【doc】中枢去甲肾上腺素通路和前列腺素参与IL—6,TNFα对大鼠下丘脑室旁核…

【doc】中枢去甲肾上腺素通路和前列腺素参与IL—6,TNFα对大鼠下丘脑室旁核… 中枢去甲肾上腺素通路和前列腺素参与IL —6,TNFα对大鼠下丘脑室旁核… .} 动物43(2):151,156,1997 ActaZoologicaSinica 匆够子 中枢去甲肾上腺素通路和前列腺 素参与IL一6,TNFa对大鼠下丘 脑室旁核神经元的兴奋作用 黄传书鞠躬 .西安710032) ,H 一蔓应用免疫组织化学方法研究了6一羟多巴胺化学性掼毁中枢去肾上纛素通路和中 枢引入前列腺素合成抑制荆消炎痛对脑室注射白细胞舟素6,肿瘤坏珏园子tl诱导下丘脑 室旁棱小细胞Fos表达的影响.结果显示,这两种处理均可使RB表述细胞鼓嗣明显减少, 说明白细胞舟素6,肿瘤坏死园子诱导室旁棱小绑腿神经元FbB表达柏作用与中枢去甲肾 白细胞介素1(IL.1)白细胞介素6(IL-6),肿瘤坏死因子(TNF)能够刺激下丘_ 垂律.肾上腺(HPA)轴,最终导致糖皮质激素释放增加.尽管有证据表明这些细胞因 子可以直接作用于脑垂体和肾上腺分别刺激促肾上腺激素一(ACTH)和糖皮质激素的生 成,但它们引起ACTH升高的作用在不同程度上都有中枢促肾上腺激素释放因子 (cRF)的参与(Sohobitz,1994;Rivier,1993).有关急性炎症因子激活下丘脑CRF神 经元作用机制的研究目前多集中于IL.1.而较少关于IL.6和TNF的报道.我们以前 的 研究证实了IL-6和TNFa经脑室引入均能够诱发下丘脑室旁核CRF神经元Foe表达 (杨宏等,t996).研究中我们通过6.羟多巴胺化学性损毁中枢去甲肾上腺素通路和使 用环氧化酶抑制剂抑制前列腺索的合成观察儿茶酚胺系统和脑内前列腺索在IL-6, TNFa诱导室旁核小细胞神经元Foe表达中的介导作用.- 1材料和方法 1.1动鞠分组置实处理. 所用实验动物为成年二级SD大鼠.雄性,体重250~00g实验前物先安静敷天.给以充足 清洁的饮水,撮食,自髂光{嗄动物分组:(1)脑蛊注射11.,-6(一=B)}(2)脑室注射1 (^:l0);(3)6-OHDA处理后脑室注射tb-6(4=7h(4)6-OHDA处理后脑室注射TNFa,1 =7);(5)indomet.haoin处理后脑室注射IL-6(=7);(6)indomethacin处理后脑室注射 1995—12_25收稿-19912-惨回 *现在军事医学科学院基础医学研究所神经生物研究童工作北京100~50 152动物 TNFa(=7).各组设计相应的对照实验(详见后述). 1.1.1侧脑室注射细胞因子采用两步法脑室注射以消除手术本身刨伤,疼痛应激对实验结果的影 响.颅骨钻孔与畔毒注射之间闻隔7,10天时间井保持每天抓摸一次训练动物对外界刺激的适应. 7,1O天后.在麻醉艟态下<麻醉剂均选用1%戊巴比妥钠),甩l蕞璃散臂拉触的l町管尖螭直径5, 10~m)直税下向翻鹭宣注射重组人IL.6(军事医学科学院,比活1×加u/m藩于RPMI1640) 0.5ng,5M或1n(中科院上{卑生物工捏中心,比活5×107U/ms,溶于无菌生理盐 水)50ng.5. 进针方位为Bre~na赢,向展约mm,I帏约1.5mm~,进钟探度约3口.动物蒡醒后再根据需要进 行其它处理.对照动物翻齄室分踟注射RPM1640或无菌生理盐承. 1.1.2化学性损毁中枢儿茶酚胺神经翻脑室注射6.OHDA(美国Sigma公司)500gg(溶于10合 0.1%抗坏血酸的消毒生理盐水中).注射前处理同前述.注射后动物一般出现一过性呼吸,心踌减 4小时后可以恢复.动物存括48小时后,再以同样方法恻脑室注射IL6或弱.2, TNFa,TH和 F?双标记染色.对照组设计:(1,正常动物TH免疫组化染色和经6-OHDA处理的动物坩和Fos 双标记染色以Hf较观察?A的效果和处理本身是否诱导Fos表达;(2)以含01%抗坏血酸的清 毒生理盐水代替O岫A,48小时后饲时室注射IL6或1m.观察溶剂本身扼香影响F商表遮. 1.1.3中枢注射前列腺素台戚抻制荆侧骑室注射indomethacln(美国si舯a公司)lmg丙酮溶液 5,注射前处理向前}链.'王S分钟后,以回样方法翻脑室注射细胞因子IL.6和1啊口.5小时后灌注. 对照组设计:(1)单纯注射imk~ettmdn而注射细胞因子,观察indomethaeln是否诱导F蔼表达; (2)以丙酮代替imk~ethacin,15分钟后恻脑室注射IL-6或TNFe.观察溶剂率身柏否髟响Fl咀表达. 各组材料行Foe免疫组化染色. 1.2组织准备和免应组织化学. 动物以过量的戊B比妥舳撵麻,经主动弥灌注生理盐水t00ml,4"C之4%多聚醛?敢壤冲液 s?,7OOIll1.维持1.5小时.取出鹭授入古20%蔗糖的礴酸缓{巾灌中过夜.自室旁 棱前瓣至后{II行冠 状切面的珠磙切片,片厚50ttm.隔二取一收集于O.01mol/LPBS.pH7.6中.行常规船痉组北色. 缓冲藏为0.01KPt~,pl-'I7.5,7.6,特异性抗Foe抗体:美国On,x~eneSdence公司,1:1000~生物素 化的羊抗兔Ig及ABC复台4白;美国sna公司,1:500.采用葡萄糖鞋化酶法呈色(Sheslyun. 1988).进行Foe与酪氨酸羟化酶(TH)双标记的切片.反应完后再进入鼠抗TH抗体(美国INC St~r)中继续孵育36—72小时,除选用兔抗鼠生物索化IgG(美胃爱鲫a公司)外,其它染色程序与 Foe染色相同. 1.3切片用Olympm阴-2墨徽靖曩囊,?相以~uantlmet570图像分析系统(Leica公司)定量分 析,计数每只动物(约5张切片)室旁棱小细胞部Fm免疫反应阳性细胞的数目. 2结果 2.1塌脑壹注射IL,TNFe后下丘脑童旁棱神经元F?衰迭 对照实验显示,在仅注射RPMI1640或消毒生理盐水的动物,除个别动物室旁核 内侧小细胞亚核处见极少量胞核弱阳性的细胞外.大多数动物室旁校区域无Fos表达. 脑室一次性注射IL-65rig,TNFa50ng,5小时后脑内Fbs表达达到高峰.阳性细胞主 要集中于室旁核小细胞亚核,以内衡小细胞亚核的背侧部最为密集.其次是背侧,外侧 小细胞亚核(图版I:1,2).在TNF~,,Fos表达细胞还见于前,内I嘲,外佣大细胞亚 核,弓状核内.图像分析结果表明,每只大鼠室旁核小细胞部Fos免疫反应阳性(Fos- IR)细胞的平均数目在侧脑室注射IL-6和TNFa分别为6066个和5329个. 2.26-OIIDA对1L-6.1N诱导童寡接小细胞Fee表达的影响 2期 扬宏等:中枢去甲肾上腺素通路和前列腺紊参与ID6,1a 对大鼠下丘脑室旁核神经元的兴奋作用 对照实验显示:(1)在正常动物第3脑一 室周围有密集的TH-IR细胞和纤维.室旁核| 小细胞部有密集的TH.IR神经末梢(图版I{ :3).而在脑室注射6.OHDA48小时后的动 物,室周部和室旁核区TH.IR细胞和纤维明型 显减少,剩余的少数细胞形态不规则,突起 变短,变细,弯曲.室旁核小细胞部的TH. IR末梢密集区域染色强度大为下降.高倍镜 下只见稀疏的阳性末梢(图版I:4).Fb8和田16-OIIDA和Indo?作用示意田 TH免疫组化染色显示,脑室注射6-OHDAng-咖0f.o肿A'nd 的动物室旁棱区无域无RzR细胞.表明6-鼠下高薹:iOHDA处理本身不诱导该区域神经元Fos表标示室旁棱小细粗区免疫反应阳性神经元的平均 达(图版I:3,4);(2)以生理盐水代替6?数目(Efft,etof6-OHDAandindometla,zqnmtheFoB OHDA所得结果与单纯注射IL.6或TNFa者expl船sinducedIcydmrm缸址n.f11--6 — 致.6-OHDA注射48小时后再行IL-6或TNFainthe刚IIBlan1icpVNdmTheavel~,e TNFa侧瞄室注射,室旁核小细胞部Fos-IRb盯:.B"咖螂恤州e?u. 细胞明显减少(图版I:5,6).图像分析显' 示,在IL-6和TNFa,大鼠室旁核小细胞部Fowm细胞分别减少47%和70%(图1). 2.3ladomethacin对?,6,TN诱导童旁桉小细胞l~os表达的影响 对照实验显示,(1)仅注射indomethaein不能引起相应部位的F表达;(2)以丙 酮代替inddmethacin,染色结果与仅注射TNFa和IL-6者相同.经侧脑室注射in— domethaein后再注射IL-6,室旁核小细胞部Fos表达阳性细胞明显减少,剩余少数Fos 免疫反应细胞主要分布于背侧小细胞部的后部(图版I:7).注射indomethacin后再注 射TNFa.室旁核Fos表达几乎完全消失(图版I:8).图像分析显示,.经indomethacin 处理后再行脑室IL一6或TNFa注射.大鼠室旁核小细胞部Fos-IR神经元分别减少86% 和近100%(图1). 3讨论 我们的实验结果证实,应用6.OHDA和indomethaein能不同程度地影响IL-6和 "INFa对下丘脑室旁核小细胞神经元的兴奋作用.本实验中我们未直接观察6-OHDA和 响而是观察计数了Fos单标细胞indomethacin对含有CRF的神经元Fos表达的影 数量的 变化.这是因为中枢引入IL广6和TNFa后Fb8表达神经元在分布上与含CRF的神经元 完全一致,即主要位于内侧小细胞亚核的背懊I部,而且同样刺激条件下室旁核含CRF 神经元呈现Fb8表达也在我们以前的实验中得到过证实(橱宏等,1996).另外,经6. OHDA或indomethacin处理后再注射细胞因子.室旁核Fos表达细胞数量减少非常明 显.此时即使进行双标记染色,由于F0s/CRF双标细胞所剩无几而失去了观察的意义, 故而本实验中采用Fb8单标细胞数目的变化间接地反映CRF神经元的情况. 本实验采用的6-OHDA化学损毁方法可以使下丘脑,纹状体,中瞄,脑桥,延髓 ll. 动物43卷 去甲肾上腺素(NA)能神经遭到破坏,去甲肾上腺紊明显丢失,下丘脑NE含量下降 70%左右,而中枢多巴胺含量,除纹状体中明显下降外.其它部位不受影响(Cross, 1986).我们在实验中观察到,6-OHDA处理动物后,下丘脑第3脑室周围TH免疫反 应阳性神经纤维明显减少,室旁核内侧小细匏部TH神经末梢大部分消失,说明该剂量 和作用时间能够有效地破坏中抠儿茶酚胺能胂经通路.6-OHDA处理后再注射细胞因子 TNFa或IL-6,室旁核小细胞都Fl璐表达细胞明显减少,而且许多细胞核呈现淡染.这 一 结果表明.IL.6和TNFa诱导室旁核小细胞神经元Fos表达作用在不同程度上有中枢 去甲肾上腺紊通路的参与.室旁核接受上行L茶酚胺能神经的传入投射早已得到证实. 投射纤维来自于脑干A1,A2,A6区去甲肾上腺紊能神经元和c1,c2,c3区肾上腺素 能神经元,经腹侧去甲肾上腺紊纤维束(VtdAB)上行至下丘脑(Sawchenko,1982). 电镜观察发现.几茶酚胺能神经末梢与小细胞部CRF神经元胞体接触(Liposits, 1986).室旁核小细胞区有肾上腺紊受体分布兴奋虮.肾上腺紊受体可刺激CRF神经 分泌系统,而中枢给予该受体的阻断剂能够鞋断由应激所引起的CRF分泌(DamMi, 1990).细胞因子对NA通路的朝激发生在哪环节目前尚不清楚.它l门可能作用于位 于脑干的NA能神经元,或直接刺激下丘脑的NA能传人末梢促使NA的释放.有研究 证实,IL-1能够改变下丘脑局部区域NA的代谢并能促使离体下丘脑释放N说明其 作用位点在NA能神经末梢而不在胞体(Palaz~lo.1990).对细胞因子具体作用部位的 研究还有待于对其受体的精确定位,现有IL-6和TNF受体分布的文献均较粗略, 如有报道IL-6受体广泛分布于下丘瞄,大脑皮层和小脑(Schibitz,1993;Gradient, 1993),TNFa受体在鼠脑也有广泛分布且以瞄币部位浓度最高(Kinouchi.1991).但 它们在室旁核区域是否存在尚不清楚.TNFa受体在脑干部位的高密度分布是否 与去甲 肾上腺紊能神经元系统有关也有待进一步证实. 目前关于前列腺紊参与炎症因子,对HPA轴的辩激作用,已积景了太量的实验依 据(Schobitz,1994;Goott~hall,1992).在IL-6湘TNFa,前列腺素合成抑制剂_m- domethadn能够阻断该两种细胞因子在离体下丘脑对CRF的刺激作用(Navarra,1991; Bernardini,1990).我们的实验结果证实了体内IL-6和TNFa刺激CRF的作用在很大 程度上依赖于前列腺紊.关于前列腺紊在中枢神经系统内传递免疫信息的方式, Goottschall等(1992)根据大量的实验依据提出如下假说,即位于缺乏血脑屏障的室周 器官,如血管终板器(ovLT)的神经胶质细胞能够惑受细胞因子的朝激面释放前列腺 紊.后者弥散入视前区,朝激该部位投射到室旁核的神经元,进而导致CRF神经元的 兴奋.? 细胞因子刺激CRF神经元的机制相当复杂,可能存在一种细胞因子通过两种或几 种机制而起作用的可能性.同样.一个神经元的奋可能同耐存在多种刺激途径.我们 在实验中发现,对于IL-6或TNFa中任何一种细胞因子来说.6-OHDA和iadoraethacin 分别处理所导致的Fos表达细胞减步的百分比之和都太于100%,这说明并非一个神经 元只靠一种途径兴奋,可能有相当一部分神经元的裔同时与NA投射和前列腺紊相 关.很可能正是这种复杂而精细的调节,使得机体在各种外界刺激下保持稳态. 2期 杨宏等?,6,1,旷? 参考文献 扬密,邱建勇.王措军.鞠躬1997白细胞舟紊6和肿瘤坏死周子a对太鼠下丘脑CRH神经元音作用的 研究.解翻勰(1):4,9. 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KeyworthRat.IL-6lTNFn.6.OHDA.Indomethaein.FosIHC 图版说明 图版I(PlateI) 1,2.分别示佣脑室注射lL6或15小时后,下丘脑室旁棱Fos免疫组也染色结果(正 Foeimmunos- 常大鼠)【 raininginPVNofhypothahmus5hour~after X100 'L)inieetiooof11.-6mdTNFgzinnomudrat】 3.示下丘脑宣旁棱酪氨t羟化酶'TH)免疫组化染色结果(正常走鼠).TH免疫反应阳 性神经末梢音集分布于内 佣小细胞部【Tyrc3~ehydroxyhse(TH).曲眦mc出 IginhypothahmusofnormalrS.t.TH-~vete'z~inals weFedensdydistributed_mthepar~cellularpartofpVN】X100 4.示室旁棱TH和Fos双重免疫组化染色结果((x皿】A处理大鼠).该结皋表 瞬.6-OI-~A处理不能诱导室旁校 Fos表达(THandFosdoubleiln?lIm0啡血 gjnpVNof6-OI-~At~eatedm.Theresetshowedth*tnoFose~lnes- sionw瞄inducedbythetreatmentX100 5,6分别示佣脑室注射11.-6或TNFI1后,TH与Fos双重免疫组化染色结果(0}?)A 处理大鼠)(THandFos dooblei删?帅.咖ininginrRt0f6一(咖)AtreatmentfollowedbyIL-6?TNF~Iectkm)×l00 7,8.分掰示侧脑室注射ILo6或TNFa后,Fos免疫组化染色结果(处理大鼠)(F缸l曲Imo白i|Iiin r&tofindomethaeintf呲rn曲tfollowedbyILo6or1he0d帅)×l00