猪圆环病毒2型基因工程疫苗研究（可编辑）

猪圆环病毒2型基因工程疫苗研究（可编辑） 华中农业大学 博士学位论文 猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究 姓名:樊惠英 申请学位级别:博士 专业:预防兽医学 指导教师:陈焕春 20070601缩略语表 光密度 开放读码框猪肺泡巨噬细胞 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应聚乙二醇 猪圆环病毒型 /每分钟转速 限制性内切酶反转录聚合酶链反应. 十二烷基磺酸钠一聚丙烯 酰胺凝胶电泳,, ,, 秒钟,分钟,小时 刺激指数 四甲基乙二胺 组织培养半数感染量胸苷激酶单位 微克,毫克,克 岭,, ,, ,, 微升,毫升,升 ,,感染复数 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 日 如需保密,解密时间 年 月 龙 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我仓人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科,指导教师对此进行了审定.与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意. 研究生张撅慷 帆如年多月//日 学位论文使用授权书 本人完全了解。华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”,即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版,并提供检索和阅览服务,可以采用影印.缩印或扫描等 复制手段保存、汇 编学位论文.本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容. 注:保密学位论文在解密后适用于本授权书. 导师鲐,缏衫 学位论文作者挠獬复 签名翔:一年冠 签名强:。?年 “ 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间摘要 猪圆环病毒型 ,不仅可引起断奶仔猪多系统衰 竭综合征,而且还与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征 、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。 自从世纪年代发现可致猪的疾病以来,病毒在世界各国迅速蔓延。目 前在猪群中的感染率非常高,造成猪的生长缓慢,饲料报酬下降,同时侵害 猪的免疫系统,导致猪的免疫机能下降,造成其它疾病的大暴发,给世界养猪业造 成了巨大的经济损失。我国也于年检测到了该病毒的存在,该病毒在我国猪群 的感染率近乎%,给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制 主要是依靠疫苗,而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低,发展传统的灭活疫苗和弱 毒疫苗非常困难,因此,研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关 注的焦点,但目前对于的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。 本研究对新型疫苗进行了新的探索,构建了利用杆状病毒表达系 统表达的蛋白亚单位疫苗,修饰的 疫苗以及杆状病毒为载体的重 组毒疫苗,并对构建的候选疫苗进行了免疫效力研究,主要研究内容如下: .亚单位疫苗的构建以及免疫原性研究 扩增 全基因,并克隆到杆状病毒转移载体?中,构建 转移载体,然后转化大肠杆菌,通过蓝白斑菌落及抗性筛选, 获得重组穿梭载体., 提取其基因组并转染昆虫细胞,获得重组杆状 病毒?。通过问接免疫荧光和 分析证明插入的基因可 在重组杆状病毒中进行有效表达,并证实该表达蛋白纯化后经磷钨酸负染后,电镜 下可见形态与病毒粒子相似的病毒样颗粒,其中某些颗粒由于中心浓 染而似空衣壳,其直为。为了进一步研究病毒样颗粒的免疫原性,我们将此特 性的蛋白制备成亚单位疫苗,按照个细胞/,个细胞/和 个细包/三个不同的剂量免疫日龄断奶仔猪。试验结果表明,在首疫后第周, ×个细胞/和个细胞/两个剂量组免疫的部分仔猪体内已有抗 体产生,在加强免疫后该两组的抗体水平继续升高,但两组间差异不显著,而 个细胞/免疫组在加强免疫之前和之后均检测不到抗体的存在。淋巴细胞 个细胞,免疫组的仔猪可以 增殖试验结果也同样证实该旷个细胞/和 诱导较高的特异性的淋巴细胞增殖反应。表明杆状病毒表达的蛋白具 有良好的免疫原性,是一种极具潜力的候选亚单位疫苗。 .修饰的 疫苗的构建以及免疫原性研究 研究证实将抗原靶向到不同的亚细胞器,能够影响此抗原的加工与提呈途径, 进而改变此抗原诱导的免疫反应的类型。核定位的衣壳蛋白是否也会由于核内定位的模式而影响其抗原提呈,进而影响其免疫反应的 诱导因此本研究对 基因进行修饰,使所表达的具有不同的定位模式,即核定位型的., 胞浆定位型的.,分泌型的.和膜结合型的旬。间接免疫荧光 证实修饰后的蛋白能够表达,并且能够正确靶向到各亚细胞器。以小鼠为模 型动物,探讨了种修饰的 疫苗的免疫效力,实验结果表明:种构建 的疫苗均可以诱导一定程度的特异的体液免疫反应,但相对于核定位型 .与胞浆定位型,分泌型和膜结合型 .免疫小鼠能够诱导显著高的中和抗体水平。而从细胞免疫水平来看, 膜结合型免疫的小鼠诱导显著高水平的淋巴细胞增殖活性及 分泌水平,其次是核定位型免疫的小鼠,而分泌型. 与胞浆定位型免疫的小鼠仅诱导低水平的淋巴细胞增殖活性 及分泌水平。因此,综合体液免疫水平和细胞免疫水平,膜结合型 ?强能够诱导较高的中和抗体水平和最高的细胞免疫水平,具有最佳的免 疫效果,是一种具有良好发展前景的新型候选疫苗。 .杆状病毒介导的表达 的重组毒疫苗的构建以及免疫原性的研究 杆状病毒不能感染哺乳动物细胞,但可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳 动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。目前利用杆状病毒作 为体内基因投送的载体己受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体 内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,在本 研究中利用水泡性口炎病毒蛋白修饰杆状病毒。扩增编码水泡性口炎蛋 白的基因,克隆到杆状病毒转移载体中,构建转移载体 ,在下游的多克隆位点插入启动子驱动的编码 蛋白的整个读码框,构建重组病毒.。用相同的方式构建表达增强型绿荧 光蛋白的重组病毒.。体外转导试验表明,构建的重组病毒均能 高效转导哺乳动物细胞,基因的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关,当 感染复数越高,表达报告基因的细胞数越多。将重组病毒分别以不同的剂量 /, /, /肌肉注射免疫小鼠。试验结果表明,在首 免后第三周,重组病毒? /免疫组即可检测到较高水平的 抗体,加强免疫之后,. /免疫组平均抗体滴度达到: ,而平均中和抗体水平达到:,显著的高于其它免疫组。细胞免疫 水平表现 出与体液免疫水平相似的趋势,. ”/免疫组的细胞免疫水平显著 高于其它免疫组,因此,不管是体液免疫水平还是细胞免疫水平, /免疫组表现出最佳的免疫效果,是一种具有良好发展前景的新 型 候选疫苗。 关键词:猪型圆环病毒;基因;杆状病毒;亚单位疫苗:疫苗;免疫 原性, , , , . . , . ,锄 . . . . . . , . ,, . , . : .? . .佑. . . , . . / .. .. ? .,.廿 ,一 . ? . . , ’. ,. .. ?, ... . . . . ., , .. ,, . , ,:,?, . ? . . , . .. . ,? ?. ,, ?. ?.鹞 . ?..,. . ,. ,. ., . 血曲 . .. 仃 . . ? , .百 / 一 ?/ . , :./, :. , , 曲 /. . / . ; : ; ;; ; 第章文献综述 猪圆环病毒型,由等首次从断奶 后多系统衰竭综合症 灿,病猪体内 分离到,属于圆环病毒科,圆环病毒属成员,已证明是发生的必要病原,在 临床上主要感染.周龄的断奶仔猪,表现为衰弱、增重迟缓、呼吸困难,贫血腹 泻、淋巴结肿大、黄疸等临床症状,以及淋巴组织中淋巴细胞缺失、炎性粒细胞浸 润等特征性病理变化。猪群中的发病率和死亡率常在%.%和%.%之 间。此外,猪皮炎与肾病综合症、猪呼吸道疾病综合症、增生性坏死性肺炎、先天 性振颤等疾病的发生也与的感染有关,从而使感染造成的经济损失更 加严重。现已证明,当感染悉生,?猪、非哺乳.正.,;: ., 猪和猪后,能够导致的发生 .,,并且基因组感染性克隆能够感染猪,并引起 ;?峨 与相一致的病理变化,从而进一步证明了是引起发生的必要 因素 ., .,。此外,能够导致感染猪获得性免疫抑制 ; .,。临床上常见到的与猪细小病毒、猪繁殖与呼 吸综合征病毒?、猪伪狂犬病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等病原 体混合感染的现象可能与引起感染猪的免疫抑制有关。自年首次在加拿 大发生以来,现在全世界大多数养猪国家均有发生该病的报道 ,,主 ,。据估计,相关性疾病一 要是,在年给欧洲造成的损失高达亿欧元;给我国养猪业造成 的损失至今未见权威统计,但感染性疾病引起的死亡率增加,饲料报酬降低, 加上我国规模化猪场饲养管理水平相对较为落后,因此在全国造成的损失应 在几十亿元。当前感染及其所致相关疾病正对世界养猪生产构成严重威胁, 如何有效控制和降低给养猪生产所造成的直接或间接经济损失己迫在眉睫。 目前,对的控制主要靠加强饲养管理和生物安全措施,但鉴于感染的 普遍性及其对外界环境抵抗力较强的特点,采用安全有效的疫苗 来预防的感 染和流行应是一条有效的途径。目前,还没有防制感染的有效疫苗。加上体 外培养比较困难且病毒滴度较低,所以研究开发安全有效的新型疫苗不失为 一条可取的策略。 .猪圆环病毒国内外研究概况 是近年来新发现的病毒之一,该病毒与猪的多种疾病综合征有关,包括 猪断奶后多系统衰竭综合征,猪皮炎/肾病综合征,猪增生性/坏死性肺炎,仔猪先天 性震颤及母猪流产等,严重危害养猪业的健康发展。病原学及血清学调查表明,该 病毒在世界各地广泛存在。为单股环状的病毒,无囊膜,面体对称, 平均直径为,以滚环方式复制,基因组全长 或,推测整个基因 组包括个开放阅读框,其中和为两个主要阅读框。与 同属的猪圆环病毒型高度同源,编码与病毒复制相关的酶类。而在 的主 和间的差异相对较大 .,,编码分子量约为 要结构蛋白衣壳蛋白 ,能够与感染的猪血清特异性结合,并且具有中和活性 .,; .,用重组杆状病毒表 .,。己有研究报道 达的能够自我组装成病毒样颗粒 重组免疫猪后可抑制在体内复制,表明编码的具有免疫原 性 .,。 】..病毒的发现 年,等在细胞系中,发现了与细小病毒和乳多空病毒类似的 ,,当时被认为是一种 颗粒,这种颗粒状物质不引起细胞病变 细胞污染物。等在年用超速离心法提取到了病毒粒子和病毒核酸,通 过电镜观察核酸状态,首次揭示了这种细胞污染物实际上是一种单链环状病 ,?。用该病毒感染试验动物, 毒,并将其命名为猪圆环病毒 发现只有猪产生特异性抗体,但无临床症状和病理变化,而兔、鼠、牛均为血清学 阴性。后来的血清学调查结果显示,德国、加拿大、新西兰、美 国等国的猪群中抗体呈阳性,而且感染十分普遍。年,在加 拿大出现了断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、 黄疸,剖检有淋巴 结肿大、肝硬变、多灶性粘液性气管炎、间质性肺炎和肾炎,当时认为是一种新发 的猪病,将之命名为断奶仔猪多系统衰竭综合征., ,。随后,该病迅速在全世界蔓延,美国 、法亘 .,、北爱尔兰 .,、德国 .,、日本 .,、韩国 、西班牙 .,等国家陆续报道了 .,、意大利 的发生,我国也于年报道了该病的发生洪武等,。进一步病原 分离鉴定的结果显示,引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原是猪圆环病毒,但是 这种病毒的基因组与最初发现的.细胞系中持续存在的病毒既有一定的同源 性,又存在一定的差异,因此将分成了两个基因型,即:不致病的与致 病性的。 ..病毒的分类地位 国际病毒分类委员会?第六次学术报告新增一个病毒一圆环病毒科,被 列入该科的病毒既有植物病毒,又有动物病毒,其中植物病毒有地三叶草侏儒病毒 、椰树叶腐烂病毒、香蕉簇顶病毒弋,等;动物病毒有猪圆环病毒 、喙羽病病毒 ,、牛圆环病 毒 、金丝雀圆环病毒 、鸽圆环病毒 、鹅圆环病毒 。曲及鸭圆环病毒 。等 建议可将圆环病毒分为个类群:似双病毒类嗜动物圆环病毒,包 括和 等病毒,这些病毒种内的基因组同源性比较高,而种间的差异很 大,它们在进 化上与植物圆环病毒微病毒,密切相关,基因组介于植物双粒病 毒与微病毒基因组之间,推可能是微病毒与动物类微病毒 基因重组的产物;似双病毒类嗜植物圆环病毒,包括、 和等植物病毒;与其它圆环病毒的结构差异较大,被列为另一类 群, 与近期分离的人的输血性肝炎病毒和类输血性肝炎小病毒相似。 图?.不同环状病毒的形态结构 ., ..鸡传染性贫血病毒;.猪圆环病毒型.与鹦鹉喙羽病病毒 。病毒粒子最大的是,并且病毒的边缘很粗糙,与的个体比较 小,并且病毒粒子的边缘光滑。 ..病毒的病原特征 病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,直径为 ,是己发现的最小的 病 毒。病毒的衣壳蛋白为一条多肽链,其分子量约为 。病毒基因组为单链环状 。 ,长度约为. ,病毒粒子浮密度约为. /,沉降系数为 对环境的抵抗力较强,?能存活较长时间,可存活分钟,对氯仿、碘酒、 酒精、的酸性环境有一定抵抗力,对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂 等较敏感。病毒主要在.细胞中增殖,也可在源于猪骨髓、外周血液、肺洗出 物和淋巴结的单核细胞/巨噬细胞中复制。牛外周血液来源的单核细胞也对感 染敏感,在原代猪肾细胞、恒河猴肾细胞、细胞及一些猪传代细胞系、 上不能生长,在细胞、猪睾丸传代细胞系及细胞上可以生长, 但都不显示细胞病变。病毒在所有细胞中增殖的滴度不高,病毒在细胞中复制需要依赖细胞生长周期期的细胞表达蛋白。用.氨基葡萄糖处理细胞培养物后,有利 于病毒的复制,感染细胞数量可提高%,可能是因为这种试剂有利于促进病毒基 因组进入细胞核,但一氨基葡萄糖对细胞有毒性作用,因此处理过程稍不小心就会 造成细胞的大面积死亡 .,。 .. 基因组结构 基因组为单股环状负链,基因组全长为 ,基因组 全长为或 ,同基因型的内部基因组变异很小,同源性在%以 上,两种基因型病毒的基因组同源性为%,间的核酸同源性为%,氨基 酸同源性为%,的变异比较大,核酸同源性为%,氨基酸同源性为 %? .,。序列分析结果显示,的基因组共编码个开放阅读 框架 ,,即.,病毒的、、、 在病毒链上,而强、、、、、、 在互补链上,这种结构体现了病毒对有限遗传物质充分利用的特殊方式。在这个 开放阅读框架中,功能上重要的是和。编码和’蛋白,与 病毒基因组的复制有关。等通过系统发育树分析发现,圆环病毒的 蛋白与植物矮小病毒和二价染色体病毒之间有一定的同源性,据此作者推测该蛋白 可能起源于植物矮小病毒,经过宿主转移感染脊椎动物,并与其 它感染脊椎动物的 病毒发生重组从而成为能感染脊椎动物的圆环病毒。编码病毒的核衣壳 蛋白,是病毒的唯一结构蛋白。两种基因型病毒的基因间的差异比较小,且 蛋白间存在交叉反应,而基因变异较大,并且两种基因型病毒蛋白 问不存在交叉反应,可作为鉴别诊断的根据。基因为近两年来新鉴定的一个 具有重要功能的基因,它不参与病毒的复制过程,也不编码病毒的结构蛋白,但在 致病机理中具有重要作用 .,。在和的保守区段都包 、 含有信号,在病毒链上,的分别位于: 、 。在互补链上, ;的分别位于: 一 、 ? ;而只有一 有两个信号分别位于: 个信号位于一 .,。 .. 基因研究进展 基因是最大的开放阅读框架,由病毒正链转录合成,产生个大 小不同的共线性转录产物,分别编码,和截短的’,, 其’羧基末端的个氨基酸由不同的编码.,,和’ 是病毒基因组复制必需的蛋白。基因启动子定位于位.位核苷酸区域,该 ,,位于? 区域包含干扰素刺激应答元件. 位核苷酸片段内,说明细胞因子可能对基因表达存在调控作用 ., 。基因在所有圆环病毒中高度保守,且功能上是可以互相替代的,髓 等发现,的和’蛋白可结合至的复制起始区,启动病毒基因 组的复制,反之亦然。在基因中存在个典型的滚环复制结构域酶起始复制基序: ,和,位于解旋酶结构域的结合基序环或称为 和盯。系统发育分析的结果显示,圆环病毒基因和微粒病毒 基因与原核生物解旋酶编码基因的同源性高,推测可能是微病毒与动物类微 病毒 基因重组的产物。 .. 球基因的研究进展 基因编码病毒的蛋白,由基因组的互补链合成。蛋白由个氨 基酸组成,分子量约为 。转录起始于位核苷酸,转录产物含有一个 由个核苷酸 组成的非编码前导序列,启动子精确定位于 .核苷酸区域,与基因重叠 .。。在圆环病毒感 染细胞后.小时可检测到蛋白的表达,在小时定位于细胞核中 :.,。基因在圆环病毒中变异比较大,同源性约为%。等 通过预测中的抗原位点,发现中共存在个抗原位点,其中 个位于中,其余个都在中 .,。应用合成肽及重叠肽技 术,分析和高免血清与病毒蛋白的结合部位,结果表明和 蛋白第.位氨基酸片段能与和高免血清发生特异性结 合,具有交叉反应性。而 蛋白第?位,.位和位氨基 酸片段,是型特异性的抗原位点,只与高免血清发生特异性结合, 而与 高免血清不发生反应。这证明蛋白?位氨基酸区域内,存在 和共有的一个表位,而蛋白?位,.位,位三个表位 是型特异性的表位,尤其是一位可作为病毒感染标志,用于 的血清学诊断 .,。另外,通过单克隆抗体的研究发现,在蛋白中 含有一个中和表位 .,。等将 基因及其连续缺失产物,置换基因组中的基因,通过质粒拯救构 建 /重组嵌合病毒。用特异性单克隆抗体对不同嵌合病毒免疫反应性 差异进行研究,对主要衣壳蛋白表位进行定位,结果显示,在 蛋 白第.位,.位,?位氨基酸区域内,至少存在个不同但彼此重 叠的构象型免疫优势表位,分别位于第?位,.位,?位、? 位,.位、.位,.位、?位、?位,?位、 位,在位氨基酸区域内,兔抗高免血清与嵌合病毒的结合位点在 蛋白.位和.位氨基酸区域内。蛋白端的前个氨基酸不参与形 成抗原位点,这个部分含有丰富的碱性氨基酸,可能形成病毒衣壳的内表面,在病 毒的装配阶段与结合 .,。用大肠杆菌表达了基因,并证明该表达产物具有很强的免 等 疫原性。等用杆状病毒表达了基因,发现表达产物至少存 在两个糖基化位点,经 分析证实,该表达蛋白与纯化的病毒粒子的 核衣壳蛋白大小相近;将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见大 量形态与病毒粒子相似的病毒样颗粒,其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣 壳,其直径也为 左右,证实该表达蛋白可在体外组装成病毒样粒子。蛋 白在细胞中表达后,表达蛋白定位于核周,定位信号为端第.位氨基酸,进一 步的突变分析发现第.,位氨基酸区域的碱性氨基酸对定位起着关键作用 ., 。等将基因的定位域缺失,并在大肠杆菌中表达 了缺失定位域的疋蛋白,证明该蛋白的单克隆抗体依然具有与天然蛋白的反 应原性,同时保持了对的中和活性。 基因是决定毒力的主要因素,江基因的变异造成了各地 分离株在毒力上的差别,同时基因可能与病毒在细胞中的增殖滴度有一定关 系。通过病毒感染性克隆的研究,将的与的基因进行互 换,构建了嵌合病毒.与.,的基因用的基 因置换后,病毒的毒力大大下降 .,。等 将在 细胞上连续传代代,第代的病毒在一细胞的增殖滴度可升高到 。/,而第一代病毒在细胞中的增殖滴度为’/,同时在经 过连续传代后病毒的致病力却大大下降。对各代次的病毒全基因组测序发现,在 代病毒的基因中发生了两个位点的氨基酸突变,可能是使病毒毒力下降的主 要因素,它们分别是:位变为,位变为。 关于诊断和基因工程疫苗的研究,都集中在基因或蛋白上。 基于基因或蛋白,研制出了可鉴别诊断与的、原位杂 交、过氧化物酶单层试验、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光、实时 荧光定量等检测,都能做出针对特异、敏感的诊断。而在疫 苗研究方面的研究报道较少。等研究了基因的疫苗, 用杆状病毒表达的蛋白免疫猪,取得了理想的免疫效果, 等 等将 基因插入的基因组骨架,同时将的 基因替换到基因组中,构建了两种嵌合病毒的感染性克隆。将、、 .、.的感染性注射猪腹股沟淋巴结,可使猪获得一定的抵抗力, 说明.可用于的免疫保护,等构建了可表达 基因的重组腺病毒,用该病毒免疫猪也取得了理想的免疫效果。 .. 腑基因研究进展 通过对基因组测序和序列分析,人们很早便知道基因的存在,但其 功能却是最近两年才得到人们的注意。等通过点突变将缺失,并通 过质粒拯救病毒技术研究发现的缺失并不能影响病毒的复制。为研究 的功能,他们将,,基因分别在或.细胞中进行瞬时 表达,发现基因表达的细胞出现了与病毒感染类似的细胞凋亡现象, 而用缺失的感染细胞,发现凋亡活性大大降低,推测基因是 诱导细胞凋亡的主要因素。后来,等.将他们构建的基因缺失的 接种周龄/小白鼠,同时设置野生型病毒接种对照。 接种后天,接种两种病毒的小白鼠都发生了的阳转,但不同的是接种 的小白鼠体内抗体明显比接种的小白鼠高,同时接种病毒 小白鼠血清中病毒基因组的拷贝数明显升高。组织病理学研究结果也显示, 可造成淋巴组织的损伤,而在接种动物的淋巴细胞中却未发现明显的病理 变化,且在小白鼠淋巴结中的病毒含量更高,说明基因在病毒的致病 机理中占有重要的地位。上述研究说明,虽然对病毒的复制是非必需的,但 是它却具有重要的功能,对基因功能机制的进一步研究将有助于对许 多生物学活性的深入了解。 .猪圆环病毒的致病机理 目前的研究表明,主要在机体的单核/巨噬细胞和抗原提呈细胞 中复制, 少数可在肾小球、支气管上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和淋巴细胞中增殖。尽管在 严重发病猪体内淋巴细胞显著缺失,但几乎不能或者很少能从淋巴细胞中检 出核酸及抗原。从定量的观点看,与其它类型的细胞相比,单核/巨噬细胞系 统中的含量最多,然而核酸和抗原主要从患猪组织的巨噬细胞、 树突状细胞和多核巨细胞的细胞浆中检测到,极少在细胞核中检测到。血细胞和其 它上皮细胞或内皮细胞的细胞核内存在病毒标记物,表明这类细胞可能在病毒的产 生过程中发挥重要作用。而单核细胞,巨噬细胞胞浆内存在的抗原和核酸是否是其吞 噬所致,以及骨髓中单核细胞/巨噬细胞前身在病毒增殖中的作用,这些都需进行进 一步探索。 毫无疑问,与免疫系统及其分子成份问存在相互作用,但这种相互作用 在感染的早期是如何发生的,以及这种相互作用是发展成为还是成为亚临床 和持续感染,尚不清楚。在感染过程中,免疫系统似乎是一把双刃 剑。一方 面,与其它病毒,如和同时接种试验猪时,这些病毒可以刺激 和活化免疫系统,从而促进感染猪体内的增殖。因此,免疫系统的激活可能 是的触发因素。另一方面,感染也使机体产生严重的淋巴组织病变, 包括淋巴细胞的缺失及淋巴组织免疫细胞亚群的变化,这就使机体的免疫力下降, 从而对其它病原不能产生有效的免疫应答,也是该病发生机理的重要部分。..免疫弱激., ; .,; 目前己证实,可引起猪发生.,; .,。感染可能是引起的主要原因,但 不是唯一的原因,有些病例还有、等的共同感染。等 研究表明,用单独感染或与混合感染未吃初乳的仔猪,可使猪表 现 临床症状及病理变化,混合感染较单独感染严重,可引起试验猪死 亡,而单独感染的试验猪不表现任何临床症状和病理变化。等认为 与对猪都具有较强的感染性,在自然界中都广泛存在,因此,两者混合感染引 起的可能性较大。等将患猪的组织病料及其细胞分离物接 种限菌仔猪,接种物中起初被证明只含有,但从复制出的猪的组 织病 料中却分离出了及,只不过的含量较少,对此研究结果,等认 为是与混合感染的结果,过去所报道的一些病例中,之 所以只分离到而没有发现,可能是由于在患猪组织中的含量较少, 同时对?细胞也不太敏感所致。由于这两种病毒都可以感染巨噬细胞,并 且其复制都需要细胞周期的期表达的细胞酶类,有可能是在感染巨噬细胞时 使巨噬细胞活化,从而促进的复制,同样,也可能是其它未知因素促进了这 两种病毒的复制。对于与的这种协同作用机理尚不清楚。相似的问在 与中也存在,因为也在巨噬细胞中复制。感染是世界 性的普遍问题,而且和共感染的发生率在、及 中很高。如果和刺激了免疫系统并且促进了的复制,可以假设, 其它非传染性刺激原与共同作用同样可以加重症状及病变。 等将感染新生仔猪后,再注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔戚血蓝蛋白 /,可使感染仔猪出现明显的症状及病变,而未注射 /组则未发生。因此,免疫刺激在的发病过程中可能起着关 键性的作用。这一点对实际生产有很大的指导作用。在希腊进行 的田间试验证明疫 苗免疫或非特异性免疫调节剂可以影响自然感染猪的症状及病变。该 研究是从爆发期间的某猪场选择头临床健康猪,分为组,每组头, 第组在日龄和日龄分别接种猪支原体肺炎疫苗,在日龄肌肉注射: 第组在日龄肌肉注射,而在日龄和日龄注射非特异性免疫调节剂; 第组在、和日龄分别注射,作为对照组。结果在接种猪支原体肺炎疫 苗组有.%的猪发生了典型的 临床症状,在注射免疫调节剂组有%的 猪发生,而对照组只有.%的猪发生。因此,我们可以得出结论, 通过注射疫苗或免疫调节剂等非特异性刺激免疫系统,可以促进的复制,在 爆发期间可以加重临床症状。 ..免疫抑制 ., 感染引起机体的免疫抑制,也是其致病机理的重要部分 ; .,。在研究中,有许多研究结果都对该病的免疫抑 ., 制特征进行了描述,主要表现为:?对抗生素治疗无效 ; .,:?同窝效应的存在 .,;?其它疾病综合征的同时存在 ’ .,; .,; ., ., ; ;:?通常被认为是无致病性病原体的感染, ; .,; .,,这些都与免疫缺陷病的特征相符。等研究了 感染对猪肺巨噬细胞体外免疫功能的影响,结果发现,从整个感染过程来看, 感染对抗体段及补体受体的表达或对巨噬细胞的吞噬作用及其辅助杀伤作用均 无任何影响。在此研究中,作者所用的病毒是来自持续感染该病毒的猪肾传代 细胞,经过多次传代后病毒的毒力可能减弱,因此,感染对猪肺巨噬细胞免疫 功能无影响.有可能是因为病毒的毒力减弱所致,也可能是因为本身就对猪肺 巨噬细胞免疫功能无影响造成。但作者也观察到感染对巨噬细胞有短暂性的影 响,感染后 可明显的抑制巨噬细胞介导的、分裂素诱导的淋巴细胞增殖, 感染后 可增加细胞.类抗原的表达量,但表达.类抗原的细 胞总量与对照组相比无差别,此时,.?类抗原的表达量不变,而 在感染后 可降低细胞?类抗原的表达。现有的研究表明,.类抗原及.类 抗原表达量的降低可能与病毒感染细胞时病毒介导的细胞膜的凹陷及病毒从细胞浆 内向复制中心的移动有关。 等用流式细胞仪对自然感染猪外周血单核细胞进行研究发 现,患猪外周血单核细胞数量较正常对照组明显增多,且出现少量未成熟粒细胞, 而淋巴细胞主要和淋巴细胞数量下降,说明急性感染患猪不 能产生有效的免疫应答。但等对阳性和阴性的消瘦猪群的外周 血单核细胞同时用流式细胞仪进行检测发现,所有消瘦猪无论是阳性还是 阴性猪,其细胞都下调,这可能暗示细胞下调与猪的消瘦相关。 而对外周血细胞亚群的研究发现,外周血中细胞和细胞数量 下降仅见于感染猪,这表明细胞和细胞变化与发 展过程有关。细胞的主要作用是参与细胞毒性反应,因此,应对感染 猪的一般细胞毒性反应和病毒特异性的细胞毒性反应进行进一步研究。 细胞是成熟的淋巴细胞。其主要功能是起记忆细胞和效应细胞的作用 ..。因此,细胞的变化可能干扰机体的免疫记忆反应。关于 .,; .,; 感染猪外周血中细胞的变化也有报 .,。等认为细胞减少可能是导致感染 猪的淋巴细胞发生凋亡的原因。等研究表明,依据外周血中 细胞水平的不同,可以将阳性猪分为两类:一类是细胞比例%的猪, 另一类是目胞比例%的猪。经分析已证实,%临界值与感染猪组织中 的含量及病变的严重程度有很大关系,因此,可以将%的‖细胞比例作为评价 感染严重性的指标。此外,淋巴组织中数量与这些组织的细胞衰竭程度 呈正相关,而与外周血中和细胞数量呈负相关,这同样说明感染 降低了患猪的免疫应答。通过免疫组化研究发现,患猪的腹股沟淋巴结变化 分三个阶段,初期和中期阶段淋巴细胞萎缩,淋巴细胞减少,滤泡间树突状细胞数 量减少,细胞和细胞减少或缺失;后期淋巴结基质成份出现:同时还发现 引起抗原提呈细胞的提呈能力下降,细胞和细胞功能减弱。 在细胞因子的产生方面,等对感染猪的细胞因子及 蛋白质水平进行的研究表明,感染猪的.及.的表达量增加,这一 点与 表达水平升高 等的研究结果相一致,以前的研究表明, 仅发生在胸腺和扁桃体,但等发现,感染猪的外周淋巴细胞中.表 达水平也很高,这表明.的过量表达不仅局限于胸腺,它也可能是免疫反应向 对机体不利的方向发展所必须;及.在蛋白质水平上的增加可以为单核/巨 噬细胞系统的激活提供依据:在水平上,及一?微量升高,而这两 种细胞因子与炎性反应的发生有关;在水平上,一显著降低,而在蛋白质 水平上,.表达量增加,从这一点可以看出,细胞内细胞因子的检测结果可以反 应其它细胞的功能,即虽然细胞内的. 转录水平很低,但在其它细胞的作 用下促使更多的淋巴细胞产生一,从而使.的表达量升高;在蛋白质水平上, .表达量降低,而在水平上,微量升高,说明产生型保护性 免疫反应的能力降低,这与等的研究结果相符;可以促进细胞介 导的耵型免疫反应,感染猪.表达量降低可能暗示特异性体液免疫水平的降低。 等研究发现感染在淋巴器官引起的特征性组织学病变是: 淋巴细胞缺失、巨噬细胞增多及出现细胞浆内包涵体,这一点与以前的报道相同 .,; .,; .,;。此外,在这些组织常发 生淋巴细胞凋亡,更为重要的是,作者发现抗原和病毒粒子被限制在巨噬细 胞吞噬的凋亡小体中,并且凋亡小体中无其它病原微生物存在。这些结果表明 可诱导淋巴细胞凋亡并导致淋巴细胞缺失和猪的免疫抑制。结合以前的研究结 .,;? .,; .,; .,, 果 等推测,感染引起猪免疫抑制的致病机理:直接感染分裂 期细胞,包括细胞和巨噬细胞,并通过细胞间传播直接引起单个细胞凋亡,不 能诱导巨噬细胞凋亡或坏死。含的淋巴细胞凋亡小体在生发中心被巨噬细胞和 巨细胞吞噬作为一种传染源感染其它细胞或通过淋巴结转移,这个过程在整个感染期都存在,甚至在感染早期及无症状期也存在。巨噬细胞吞噬凋亡细胞后,凋亡小 体中的病毒粒子可自发地转染巨噬细胞,导致新的病毒粒子的产生 ., 。淋巴器官中大量细胞凋亡可能是致病机制之一,并且也可以用来解 释感染猪后细胞为何会剧烈减少。大量细胞凋亡使机体的免疫力下降, 继而造成其它病原,如、的继发感染,从而使感染猪出现更严重 的临床症状。与可以引起免疫抑制的鸡传染性贫血病病毒属于同一个病 毒家族。对的研究己证实,它可以编码一种凋亡素蛋白,这种蛋白可诱导人的 各种肿瘤细胞发生凋亡,但不能使正常细胞发生凋亡. .。。据此, 等推测可能编码一种类似凋亡素的物质从而诱导淋巴细胞凋 亡,对此推测尚需进一步证实。 等从个慢性病例中发现,从猪的鼻、口腔侵入体内, 在扁桃体和局部淋巴结增殖后,向其它淋巴组织、肺、肝和肾扩散,受慢性感染的 影响,诱发免疫抑制、肠炎、间质性肾炎及肝脏损伤。等对试验性感染 而发生急性感染的仔猪进行研究发现,仔猪肝脏的病变特征表现为肝小叶中 心坏死、肝板破坏、枯否氏细胞增生及肝窦状隙中巨噬细胞增加。肝细胞常肿胀, 有时在其核内存在嗜红细胞的细胞核内包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞的胞浆中常 见小颗粒状的嗜碱性到嗜中性包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞及 浸润的巨噬细胞中 存在大量抗原和核酸,在肝细胞中,抗原和核酸主要位于其细胞核内, 在核周围也零星存在,而在枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞中,抗原和核酸主 要位于细胞浆内,而细胞核中很少。在肝细胞、枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞胞核 内不存在病毒粒子。肝细胞的细胞核及一些凋亡小体表现肘染色阳性,并且 这些染色阳性的肝细胞主要位于肝小叶坏死区域及其周围。电镜观察结果 显示,胞浆内包涵体主要分散在退化的或无核的坏死肝细胞及巨噬细胞中,并且在 包涵体中含有直径约为 的无囊膜的呈晶格状排列的病毒粒子。发生凋亡的肝 细胞其染色质固缩,并有核膜包围。因此,作者推测细胞凋亡可能参与了肝脏病变 的产生。 等则认为很可能是和猪小核糖核酸病毒共同作用的 结果。猪小核糖核酸病毒在猪的免疫细胞中复制,所以很可能诱发免疫抑制,促进 的复制。或者猪小核糖核酸病毒活化了作为靶细胞的单核巨噬细 胞类细 胞,促进了靶细胞对的感受性。 从以上研究结果可见,对机体的影响表现在三个方面:?本身的致 病性;?其它免疫刺激因子对免疫系统的刺激,促进了的复制而使机体病情 加重;要对机体免疫系统的影响,使机体的免疫抵抗力下降,造成其它病原 的继发感染,从而引起更加严重的临床症状。 . 的流行病学 .,; 年,加拿大学者等详细描述了一种新的传染病 ,,主要症状为断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、 贫血、出现黄疸现象,剖检症状有淋巴结肿大、肝硬变、多灶性粘液性气管炎、间 质性肺炎和肾炎,当时将之命名为断奶仔猪多系统衰竭综合征 ?,。随后用从猪中分离到了,用 该病毒试验感染猪,并复制出了的典型症状 .,,证明了 是由引起的。从年首次在加拿大暴发后,该病毒在全世界范围内迅 速传播,世界上其它主要养猪国家都陆续报道了的发生。在我国,年郎洪 武等首先检测到了的流行,在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等 省市的猪群中检测到了抗体,阳性率高达%。 人们曾认为是由一种新病毒引起的新疾病,但是有证据表明,抗 体至少从年起就已经存在于猪群之中了。用原位杂交和免疫过氧化物酶单层试 验的方法,检测西班牙.年间的血清,发现年以来就已存在感 染。这些发现表明不是一种新的病毒,而也不是一种新的疾病。有证 据显示,现代饲养管理方法的变化以及早期免疫接种的方法可以起到触发的 作用,但需要进行进一步的研究。 .. 的宿主 圆环病毒的宿主主要是猪,也可能感染鼠、人,但不感染牛、马、兔等。 报道在牛、绵羊、鸡、火鸡、山羊、老鼠、兔子和人的血清中未检测到抗体, 但报道用间接免疫荧光和相组合的方法在人、老鼠和牛中检测 到了抗体,抗体阳性率分别为:.%、?%和%。等正实 在体外可以感染牛和猪的单核细胞而不感染人和羊的单核细胞。 而 等用透射电镜观察了暴露于病毒的人细胞超微结构 变化,结果发现暴露于的人细胞胞浆内形成了梭形的包涵体,在细胞中存 在大量的成熟和未成熟的病毒子,病毒在高尔基体中复制和出芽增殖,细胞的核膜保持完整,染色体形态没有变化,通过和 方法可在人、、、和细胞中检测到的存在。 等用感染人源细胞系细胞,细胞以及张氏肝细胞 ,用感染人源的细胞,发现病毒均可感染这些细胞并在 这些细胞中进行基因的复制和表达。等用、接种新西兰 兔鼻腔接种和小鼠腹膜接种,接种后未发现临床症状和组织病理学变 化,通过原位杂交的方法未在鼠和兔的组织中检测病毒核酸,用方法可在鼠的 血清中检测到和病毒,有一只小鼠产生了的抗体,而在兔的血清中不能检测到抗原和抗体,由此可见可在小白鼠内复制但效率不高,而不能 在兔体内复制。等的研究结果显示可感染/小白鼠,并可 在小白鼠的多个组织内复制,造成淋巴细胞减少。等随机检测了份 牛血清,份马血清以及份牛初乳样品,检测结果显示所有的样品均呈 阴性,同时他们用分别接种头新生奶牛和头月龄的奶牛,接 种后也未检测到特异性抗体的产生,说明不感染马和牛。 .. 的传播途径 可经口腔、呼吸道等途径感染不同年龄的猪。怀孕母猪感染后,可经 胎盘垂直传播给仔猪 .,。用感染猪后,其它同栏未接种猪的感 染率高达%,感染猪可自鼻腔分泌物、粪便中排出病毒 ..。用 接种公猪,在接种后天即可从公猪精液中检测到病毒,并且可以维持到第天 .,。等研究表明在流产胎儿的病变部位可以检测到 抗原,同时也可以从胎儿组织中分离到病毒,流产胎儿散毒也是该病毒 一个重要的传播途径。 .. 的传播特点 猪群感染率高、混合感染与隐性感染是病毒流行的主要特点。在加拿大 进行的流行病学调查显示,猪群中血清抗体普遍存在,被调查的猪群包括 猪、育肥猪以及少部分散养猪 ., .,;,; 。在德国,育肥猪和.岁母猪血清抗体阳性率为% .,。而在英 , 国和北爱尔兰,猪血清抗体阳性率分别高达%和% ;., 。等用竞争的方法检测了荷兰?年 间收集的临床血清,猪群的阳性率在?%。我国郎洪武等用方法 检测了来自北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等个省市的个猪群的血清,结果显示日龄未断奶仔猪阳性率为,月龄断奶仔猪阳性率为.%, 后备母猪阳性率为.%,经产母猪阳性率为.%,肥猪阳性率为%,总阳性 率为.%。年琚春梅等用检测了从华中地区采集的猪血清,结果显示 .%的血清呈抗体阳性。周继勇等用间接免疫荧光的方法对来自杭州、 宁波、嘉兴等个浙江省主要养猪地区个种猪场?年度的份血清 样品进行分析,发现被检测猪场均有感染,猪场的感染率为%,猪群平均 感染率为.%。等对台湾省的血清学调查发现,大约.%的猪为血 清学阳性。 表.已报道发病的主要养猪国家常与其它病原发生混合感染,等检测了份猪的 病料,发现阳性的有.%,肺炎支原体阳性的有.%,患细菌性败血 病的有%,患细菌性肺炎的有.%,感染猪流感的有.%,而仅单独感 染的只有.%,在并发感染的细菌性疾病中,链球菌的感染是最常见的。 等的临床调查发现,表现症状的猪%为阳性,而其中% 的猪为/混合感染,在临床调查的无症状的猪群中也有%的 /的混合感染。曹胜波等建立了可检测、、的多重 检测方法,用此方法对临床病料进行检测的结果显示,在头阳性猪 中有份为阳性,份为阳性,份为/双阳性,说明也 是与混合感染的常见病原。等正实可与粘膜皮肤念珠 菌发生混合感染。等通过检测发现,在自然感染猪流行性腹泻病毒 ,的猪中,有.%的猪呈阳性,说明在韩国是一个重要的混合感染病原。混合感染在的致病中具 有重要作用,在与混合感染的病原中,最常见、最重要的为猪细小病毒 ,和猪繁殖与呼吸综合征病毒,?。用/、/共感染的猪比用单 独感染的猪,表现出更加明显的症状与更严重的病毒血症,病毒在体内的分布更加 ., ; 广泛 .,。等用支原体和 混合接种猪,发现同时接种支原体和病毒的猪在肺和淋巴结的损伤加 剧,组织中病毒的含量增加,病毒在体内存在时问延长,使发病几率增加, 说明支原体也是加剧感染的一个重要病原 ., 。 尽管感染率很高,但感染后不显示临床症状的猪比率也较高,存在隐性 感染的现象。等用建立的方法对发病猪场和未发病 猪场分别进行抗体检测,发现在有发病历史的猪场的抗体阳性 率为%,而在无发病史的猪场的抗体阳性率也高达%。等用/接种周龄的饲喂过含有母源抗体的小猪,攻毒后没 有发现临床症状,用和免疫组织化学方法可以确定/的猪出现的 隐性感染,在内脏中可检测到病毒及其的存在,而却没有出现隐性感染。 等用接种头猪后,在其中头组织中检测到了很高的病毒 含量”。,但是这些猪都未表现出临床症状,而组织病理学检测结果 显示,的感染造成了组织病理损伤,尤其是侵害免疫系统,造成淋巴细胞减 少和单核细胞浸润。这种隐性感染的现象对养猪业的威胁也是巨大的,广泛 存在于猪群中,因隐性感染而不易被察觉,但实际上已对猪的免 疫系统造成损害, 造成猪群的群体免疫力下降,一旦接触其他病毒和细菌就会造成群体的疾病大暴发。 因此,应当高度重视的沉默感染,在猪场中加强对抗原抗体的检测, 同时也应当加快疫苗的研发,为养猪临床预防感染提供有力的保障。 .. 的分子流行病学研究 进化较缓慢,相同基因型的病毒之间变异不大,虽然不同地区、不同时间 分离的病毒具有一定的差异,但同源性一般都大于%。的两个主要基因中, 基因的变异较基因的变异大,正是由于的变异造成了不同地区分 离株毒力的差异。等克隆并测序了株的全基因组序列,其中有 株是引起先天性震颤的病毒,株是引起的病毒,通过对该病毒的序列分析 发现,引起先天性震颤的和引起的病毒各自都很保守,各自基因组的同源性 都为%,而它们之间基因组具有一定的差异,同源性为%。等 对英国.年年间的进行了测序,序列分析结果显示,在这年 中没有发生明显的进化。等对?年间从加拿大分离 的株进行了分子进化分析,分析结果显示,这些病毒在进化上非常接近, 同时它们与美国、欧洲和亚洲分离毒株的序列同源性也很高。 等 分离了株,发现其中有个新的突变体,这些病毒核酸的同源性在. %..%之间,从猪中分离的毒株与隐性感染猪分离的毒株在序列上变异程 度相对较高,但是没有找到反映致病力变化的特异性的分子标记。王忠田等 对从我国分离的株进行了全基因组测序,序列分析结果表明这株病毒的 核酸同源性都大于%,与欧美毒株的同源性为.%..%。等通过 和方法对中国分离的病毒进行分 析,将病毒分为个类型,分别命名为.、,、.、一、 一、、一、.、.,分离的病毒中大部分为. 型.%,通过对序列的同源性比较发现,这些病毒的基因变异比较大, 核苷酸和氨基酸的同源性分别为.%..%、%.%。 从进化树分析上看,可分为两大分支,即和的两个分支,两 种病毒基因组的同源性小于%。分离株之间在进化上存在着某些地理位置上的相关性,大致分为两大主支,美国和加拿大的分离株进化关系上非常接近,形 成分支的一个群北美群,台湾的分离株与北美群同源性高。法国等欧洲分离 株与北美的分离株差别比较大,形成分支的另一个群欧洲群。我国分离的猪 圆环病毒既有欧洲型的也有美洲型的,但在进化树上没有形成明显的一个分支。 .与有关的疾病 ..断奶仔猪多系统衰竭综合症 最早出现是年在加拿大的萨斯喀彻温省,当时描述的疾病的特征 ., 。随着 是进行性消瘦,苍白,有黄疸出现,淋巴组织病变明显 研究的发展,的症状也不断得到丰富,如咳嗽、发烧、胃溃疡、脑膜炎以及 突然死亡。等认为确诊需具备个条件:现进行性消瘦的症状; 淋巴组织的特征性病变;在组织中可检测到的蛋白或核酸,; ., 。 多发生于.周龄的后期哺乳猪和早期育肥猪,主要表现为精神不 振,食欲不佳,被毛粗乱,消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻、贫血、苍白及黄 疸。感染妊娠末期的母猪,可通过胎盘屏障感染胎儿,导致流产、死胎 .,。引起的死亡率不高,一般小于%,但在少数情况下,死亡率 可增加倍,有报道证明,如果每栏猪的数量少于头,虽然疾病的发生率很高, 但是死亡率却很低 .,。剖检变化最典型的症状为淋巴结和肺的病变, 包括全身淋巴结肿大,特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结最为明显,有时可达 正常组织的倍;肺脏肿大,呈间质性肺炎,肺坚硬或似橡皮,肺泡出血者颜色加 深,尖叶、心叶萎缩或实变 .,;其他的症状还有肝淤血,水肿或萎 缩,硬度增大;脾脏常肿大,呈肉样变化;肾脏肿大,有时呈花斑肾;胃溃疡导致 胃出血严重,通常认为贫血是因胃溃疡导致的严重出血,但是也有报道未出现胃溃 疡症状而出现贫血的症状 .,。 组织病理学变化主要表现在淋巴结、脾脏及胸腺等淋巴组织器官。在这些器官 中,淋巴细胞数量减少,单核巨噬细胞浸润,有时散布着大量的多核巨细胞;淋巴 结的皮质及副皮质区扩张,有组织细胞浸润,淋巴滤泡中心部有蜂窝状坏死,其周 围形成由组织细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞聚集的炎性肉芽肿;在淋 巴细胞内形成球形的边缘清晰的嗜碱性包涵体; .,,有时 在严重的发病猪中可见淋巴组织的坏死;肺呈明显的间质性肺炎,肺泡隔显 著增厚,肺泡内有单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞渗 .,; 支气管淋巴组织淋巴细胞减少、组织细胞浸润,支气管粘膜上皮增生,管腔内有粘 液渗出:肝脏表现不同程度的炎症,常见淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润; 肝脏表现肝小叶周围纤维化,肝细胞可见细胞坏死及单核细胞、组织细胞炎性