超临界二氧化碳萃取与分子蒸馏技术联用提取姜黄有效成分的研究

超临界二氧化碳萃取与分子蒸馏技术联用提取姜黄有效成分的研究 作者:刘霞 张琼光 向阳 詹亚华 陈科力 目的研究湖北麦冬中总多糖和总皂苷的提取、分离方法。方法应用大孔吸附树脂提取湖北麦冬中的总多糖和总皂苷。结果分别得到含量为66.52%的总多糖及含量为81.15%的总皂苷。结论运用大孔吸附树脂可以同步提取湖北麦冬中的总多糖和总皂苷，有利于湖北麦冬中总多糖和总皂苷的综合利用。 湖北麦冬 总多糖 总皂苷 综合利用 湖北麦冬Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma是中药山麦冬的主要来源之一，是湖北省的道地药材，具有养阴生津、润肺清心的功效，用于肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、肠燥便秘等症,1,。湖北麦冬含多糖及皂苷类成分,2,，两者都是湖北麦冬的活性成分，其多糖有降血糖、延缓衰老、抗疲劳辅助抑制肿瘤、抗辐射等作用,3,;所含皂苷类成分在免疫系统、心血管系统等方面具有良好的活性,4,。 对于湖北麦冬中的总多糖及总皂苷，目前多为单独提取和纯化，常造成了另一大类有效成分的浪费，不利于湖北麦冬的综合利用。本文运用大孔吸附树脂法同步提取湖北麦冬中的总皂苷和总多糖，有利于湖北麦冬中总多糖和总皂苷的综合利用。 Agilent 8453紫外-可见分光光度仪，R205星海旋转蒸发器(无锡市星海王生化设备有限公司)，DZF-2002真空干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)。 湖北麦冬购自湖北省襄樊市欧庙镇，经湖北中医学院鉴定教研室陈科力教授鉴定为湖北麦冬Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma。麦冬皂苷D对照品由中药固体制造技术国家研究中心提供，批号:1214-080228，纯度?98%。D-无水葡萄糖对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号:110833-200503。D-101大孔吸附树脂(天津农药股份有限公司)，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。 2.1 总多糖的含量测定方法,5, 2.1.1 供试品溶液的制备取总多糖0.1 g，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至100 ml，精密吸取0.2 ml分别置于干燥具塞试管中，补加蒸馏水至1.0 ml，摇匀，得供试液。 2.1.2 线性关系考察精密称取105?干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品10.40 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，分别置干燥具塞试管中，补加蒸馏水至1.0 ml，再各加苯酚试液1.0 ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0 ml，迅速摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷水冷却至室温。另取蒸馏水1.0 ml，加苯酚试液同法操作，作为空白对照。按分光光度法在486 nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(Y)，绘制曲线，求得回归方程:Y=9.105 1X+0.093 4，r=0.999 1。 2.1.3 总多糖的含量测定供试品溶液按“2.1.2”项下自“加苯酚试液1.0 ml”起，同法操作，测定吸光度。2.2 总皂苷的含量测定方法 2.2.1 供试品溶液的制备取总皂苷0.1 g，精密称定，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.2.2 对照品溶液的制备精密称取麦冬皂苷D对照品10.42 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 2.2.3 测定波长的选择精密称取葡萄糖10.31 mg，按对照品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各2 ml，置具塞试管中，挥去甲醇，加入高氯酸10 ml，混匀，65?水浴加热15 min，冰水浴冷却，终止反应后按分光光度法测定吸光度，对照品溶液、供试品溶液在317 nm处有最大吸收峰，阴性对照溶液无干扰。结果见图1。因此选317 nm为麦冬总皂苷的测定波长。 1.对照品 2.供试品 3.葡萄糖 图1 湖北麦冬总皂苷含量测定波长选择图(略) 2.2.4 线性关系考察精密吸取麦冬皂苷D对照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 ml，分别置干燥具塞试管中，挥去甲醇，加入高氯酸10 ml，混匀，65?水浴加热15 min，冰水浴冷却，终止反应后按分光光度法测定吸光度，以浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，求得回归方程:Y=6.991 4X+0.035 2，r=0.999 9。 2.2.5 总皂苷的含量测定精密吸取供试品溶液1 ml，按“2.2.3”项下自“置具塞试管中，挥去甲醇，加入高氯酸10 ml”起，同法操作，测定吸光度。 2.3 大孔吸附树脂的前处理取D-101大孔吸附树脂，用乙醇浸泡过夜，使充分溶胀，湿法装柱。然后用乙醇冲洗，至洗脱液在试管中加水稀释不浑浊，且洗脱液在200,400 nm扫描无吸收峰为止。再用水洗去乙醇。 2.4 湖北麦冬药材的提取湖北麦冬药材2 kg加10倍水提取3次，1 h/次，滤过，合并。滤液冷却至室温，备用。 2.5 总皂苷及总多糖的提取及纯化将“2.4”项下提取液通过处理后的大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱，至Mollish反应呈现阴性，然后用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，至Liberman反应呈阴性。 作者:杨苹，黄必义，陈森州，李莉，黄静霞 目的研究穿心莲内酯对链脲菌素实验性糖尿病小鼠血糖及抗脂质过氧化作用的影响。方法小鼠腹腔一次性注射链脲菌素120 mg/kg制备糖尿病小鼠模型，治疗组用穿心莲内酯以50，100 mg?kg-1两个剂量浓度灌胃连续14 d,测定血糖、血清和胰腺组织匀浆中的丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果穿心莲内酯能显著降低糖尿病小鼠血糖,提高血清和胰腺组织中的SOD活性、降低MDA含量，与模型组比较,具有显著性差异(P lt;0. 05)。结论穿心莲内酯有降低血糖作用，可能与提高氧化酶活性、清除自由基、减少过氧化脂质生成有关。 穿心莲内酯 糖尿病 降血糖 脂质过氧化 糖尿病是以糖代谢紊乱为主的全身性疾病,其与自由基的关系正在引起人们的广泛关注。穿心莲内酯是穿心莲的主要有效成分,1, 。穿心莲具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、防治心血管疾病、抗肝损伤、增强免疫等多种药理作用,2, ，但对降血糖的研究报道少见。在我们前期的实验研究发现穿心莲水煎剂对四氧嘧啶所 致高血糖小鼠血糖有影响,3, 。许多研究结果也表明，在血管炎症、辐射损伤、中毒等疾病发病过程中都有氧自由基的参与，而这些氧自由基能损伤细胞大分子的结构，结果导致组织器官病变，引起某些疾病的发生,4, 。为进一步了解穿心莲降血糖作用的有效成分及可能的机制，本文就穿心莲内酯对链脲菌素实验性小鼠血糖、抗氧化作用的影响进行研究，以探讨穿心莲内酯抗氧化与降血糖作用的关系，为开发穿心莲新的药理作用提供实验理论依据。 1.1 试剂 链脲菌素(streptozotocin,STZ),美国Sigma 公司产品; MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，批号20060609;SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，批号20060607。 1.2 药品 穿心莲内酯，购于桂林医药站。盐酸二甲双胍，北京京丰制药有限公司产品，批号050319 。 1.3 动物 昆明种小鼠，体重(22?2)g，雌雄各半，由桂林医学院动物室提供，各组动物均在同样环境中饮水、摄食。 1.4 仪器 722分光光度仪超级高速离心机台式恒温水浴锅，可调微量移液器(10,50 μl )。 2.1 穿心莲内酯对STZ致高血糖动物模型的建立与分组取昆明种小鼠60只，适应性饲养3 d，随机留取10只作为正常对照组(简称对照组)，其余为实验组。实验组小鼠禁食12 h后，以腹腔一次性注射STZ 120 mg/kg(溶于pH 4.5,0.1 mmol?L-1 枸橼酸盐缓冲液)。对照组注射等容积的枸橼酸盐缓冲液。实验组注射48 h后，剪尾取血，用葡萄糖氧化酶法测血糖，血糖浓度 , 11 mmol?L-1,为合格的糖尿病模型,5, 。 将成模的42只小鼠再随机分为4组，每组10只(模型组为12只)。即正常对照组、糖尿病模型组(简称模型组)、糖尿病模型+穿心莲内酯大剂量组(100 mg/kg)、糖尿病模型+穿心莲内酯小剂量组(50 mg/kg)及二甲双胍组。对照组和糖尿病组小鼠喂普通饲料，自由饮用水，每天以蒸馏水灌胃,0.2 ml/(10g?d),1次，连续给药14 d，给药期间标准饲料和饮水不受限制。 2.2 检测指标于末次给药1 h后，断头取血，分别测定空腹血糖和血清SOD活性 、MDA水平含量;断头取血后剖开腹腔，取胰腺组织，用4?生理盐水清洗残血，用滤纸吸出残存水分，称质量，置玻璃匀浆器中研磨，加4?生理盐水制成10%胰腺匀浆，检测MDA和SOD。检测MDA含量采用硫代巴比妥酸反应物(TBA比色)法、检测SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法。测定方法按试剂盒说明程序进行。 2.3 数据处理实验所得数据均用?s表示，数据统计由SPSS10.0软件处理，组间比较用t检验。 目的筛选提取姜黄有效成分的最佳条件。方法用正交实验对提取姜黄素和姜黄精油过程中各操作参数进行优化。结果新工艺完成了姜黄油和姜黄素的分步提取，而且一定程度上达到了姜黄油和姜黄素的提取、分离同时实现的效果。姜黄素提取率达到93.60,，姜黄精油得率达5.49%。结论姜黄有效成分提取工艺最佳条件为:夹带剂和原料的重量比为6?1，分子蒸馏温度120? ，分子蒸馏压力为5 Pa。 姜黄 超临界CO2萃取 分子蒸馏 正交实验 姜黄属姜科植物(Zingberaceae)，盛产于我国南方，四川、云南、贵州、广西、广东、江西、福建、陕西等地。现代医学研究表明，姜黄的主要有效成分姜黄素具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗诱变、抗人类免疫缺陷病毒、降血脂和抗动脉粥样硬化等作用,1,，姜黄油具有抑制肿瘤、增强免疫功能等作用,2,。然而，目前在对姜黄多种有效成分综合考虑，进行集成优化提取的研究较少。故此，实验提出了超临界-分子蒸馏联合提取姜黄有效成分的工艺路线，不仅得到了姜黄色素提取物，还得到了含量较高的姜黄油，提高了对姜黄有效成分的综合利用。 1100高效液相色谱仪(美国Angilent公司)，AE240十万分之一中国药品生物制品检定所，批号0823—9802)，其余试剂均为分析纯。姜黄中药材，本地药材市场所购，经挑选、干燥、粉碎，过20目筛备用。CO2和液氮:食品级，99,，广州市气体厂生产。 2.1 姜黄素色谱条件色谱柱为Dikma公司Diamonsil C18(250 mm×4(6 mm);流动相为甲醇?乙腈?水=13?35?52;流速1ml,min;柱温35?;波长424 nm，进样量10 μl 。 2.2 姜黄油的得率如下: 姜黄油得率(%)=蒸馏出的姜黄油的质量(g)原料质量(g)×100% 2.3 因素水平选择 对姜黄油和姜黄色素提取率有影响的主要因素有超临界CO2萃取时夹带剂用量，分子蒸馏的温度和压力，以姜黄素提取率和姜黄精油得率为评价指标，按3因素3水平进行L9(3)4正交实验。见表1。 表1 正交实验因素水平选择(略) 2.4 提取工艺 2.4.1 提取方法准确称取姜黄粉末约300 g于1 L超临界CO2萃取装置中，按正交实验表加入夹带剂，萃滤物按正交实验表进行分子蒸馏，得到姜黄色素浸膏和姜黄油。每个样品平行测定3次。结果见表2。 由表3,4的方差分析结果表明，因素A、C 对姜黄素和姜黄精油提取率均有显著性影响，通过比较表2中的极差及表3,4中均方的大小，可知各因素的主次关系为:A gt;C gt;B。直观分析得A3B3C1组合为佳。因B因素(分子蒸馏温度)在之间的波动对姜黄素和姜黄油提取率影响不大。为节能安全，将B3调为B1，故确定适合生产的较佳工艺为A3B1C1组合。 2.4.2 最佳工艺验证与中试由于优选的工艺未包括在正交实验设计表的9次实验中，故需对其进行验证实验。用同一批姜黄药材(300 g)进行验证实验。结果见表5。 表2 正交实验L9(3)4(略) 表3 姜黄素提取率方差分析(略) 表4 姜黄油得率方差分析(略) 表5 验证实验结果(略) 经验证实验，结果与正交实验基本一致，说明此工艺较稳定。 采用超临界二氧化碳萃取技术和分子蒸馏技术提取姜黄中的有效成分，使得姜黄提取物得率高，有效成分回收率高，最大限度的实现了对姜黄的综合利用。 超临界一分子蒸馏联合提取工艺完成了姜黄油和姜黄素的分步提取，而且一定程度上达到了姜黄油和姜黄色素的提取、分离同时实现的效果。在实际生产中有较高的实用价值。 【 ,1, 陈铁晖，严国鸿，陈 华，等.姜黄的化学成分及抗肿瘤作用研究进展,J,.海峡预防医学杂志，2004，10(16):23. ,2, 孙秀燕，李秀琴，王金辉，等.姜黄挥发油抗癌活性成分研究,J,.中草药，2006，37(7):982 欢迎到访:更多资源查看: