[doc格式] 芪丹通脉片对缺氧内皮细胞保护作用研究

[doc格式] 芪丹通脉片对缺氧内皮细胞保护作用研究 芪丹通脉片对缺氧内皮细胞保护作用研究 第15卷第2期 Vol_15No.2 中莲为导 GuidingJournalofTraditionalChinese 般 MedicineandPharmacy 2009年2月 February.2009 ,价’ k”:i0.盘0 芪丹通脉片对缺氧内皮细胞保护作用研究术 王冰,马静,王碧z,王文,李军昌,罗颖,,李锋,王宗仁 (1.第四军医大学西京医院中医科,陕西西安710033; 2.第四军医大学西京医院神经内科.陕西西安710033; 3.第四军医大学病理生理教研室.陕西西安710033; .陕西汉中723000) 4.解放军538医院 『摘要】目的:观察芪丹通脉片(QidantongmaiTablet,QDTMT)对缺氧内皮细胞的保护机制.:原代培养,鉴定人脐静脉 内皮细胞,制备QDTMT含药血清并干预传代内皮细胞,将内皮细胞 根据不同处理因素随机分为3组:空白对照组,生理盐水组, QDTMT组.MTY法检测各组细胞活性.结果:经?因子免疫荧光抗体 鉴定,原代培养后获得人脐静脉血管内皮细胞系.Mrr检测 结果示,与空白对照组相比,缺氧使生理盐水组和QDTMT组细胞增 殖受到抑制;QDTMT~氧内皮细胞增殖明显增加,与生 理盐水组相比差异显着(Pl<0.05).结论:QDTMT的缺氧内皮保护 作用可能和它促进缺氧后内皮细胞增殖有关. 『关键词】芪丹通脉片;脐静脉内皮细胞;MTF;缺氧 『中图分类号]R285.5[文献标识码】A『文章编号]1672, 951X(2009)02—0001—03 StudyonProtectiveEffectsofQidantongmaiTabletinAnoxicHumanUmbilicalVein EndothelialCells WANGBing~,MAJing,WANGBi2.WANGWenl,LIJun-chanf,LUOYing3,LIFengl,WANGZong-renl 1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,XijingHospital;2.DepartmentofNeurology,XijingHospital;3.Departmentof Pathophysiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an,China,710033 ;4.PLA8Hospital,Hanzhong,Shanxi,China,723000 [Abstract]Objective:ForfindingtheprotectivemolecularmechanismsofQidantongmaiTablet(QDTMT1toanoxicvascular endothelialcells.Methods:Cellsweregotfrominfantumbilicalcordforprim arycultivation,thenantihemophilicfactoranti— genwastestedbyimmunofluorescencetestforHumanumbilicalveinendothelialcells(}IUVEC1identification.Thepreparedserum ofQDTMTwereaddedintopassageHUVEC.Accordingtodifferenttreatmentfactors.endothelialcellsweredividedintothree groups:normoxiacontro1.normalsalineandQDTMTgroup.TheproliferationofHUVECwasobservedinMTT.Resuhs:Afteran— tihemophilicfactorantigenwastestedbyimmunofluoresceneetest.theHUVECcelllinewasidentified.TheMTTshowedthat QDTMTpromotetheproliferationofHUVECinhypoxiccondition,andtheproliferationlevelwashigherinQDTMTgroup thanthatofnormalsalinegroup(P<O.05).Conclusion:Inhypoxiacondition,topromotetheproliferationofHUVECmaybeone oftheendothelialprotectiveeffectsofQDTMT. 【Keywords]QidantongmaiTablet;Humanumbilicalveinendothelialcells;MTr;Hypoxia 血管的完整结构和正常功能是维系健康血管内 环境的基础,也是构筑抵御心,脑血管疾病防线的基 础,而内皮功能的正常与否直接关系到血管的完整 结构和正常功能.既往研究发现,芪丹通脉片具内皮 保护作用,其与促进内源性血管内皮生长因子vas— cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的分泌有关 VEGF对内皮细胞的存活,增殖和迁移功能有重 要影响.本实验通过体外培养人脐静脉内皮细胞 基金项目:”十一五”军队中医药重大临床攻关专项课 (2006191001);陕西省中医药管理局课题(2007035) (HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVEC), 观察了QDTMT对缺氧后内皮细胞生长的影响,进一 步探讨QDTMT内皮保护作用相关分子机制. l材料和方法 I.1主要材料和试剂QDTMT提取浸膏干粉(西京 医院提供),?型胶原酶(Sigma公司),M199培养 基,胎牛血清(美国Gibco公司).超净台f苏州苏净集 团安泰空气公司),倒置相差显微镜fEt本Nikon公 司),兔抗人?因子抗体(北京中杉公司). 1.2方法 1.2.1HUVEC的培养无菌条件下取健康产妇分娩 第l5卷第2期 Vo1.15No.2 中莲药导般 GuidingJournalofTraditionalChineseMedicineandPharmacy 2009年2月 February.2009 后新生儿脐带,选择无夹痕,无扭曲,无凝血阻塞部 分,约20—25(3m(唐都医院妇产科提供);生理盐水 多次冲洗脐带外表面及腔内残留凝血;夹闭脐带一 端,从另一端静脉注入0.1%lI型胶原酶液至管腔充 盈,并轻柔地按摩血管以增加内皮细胞脱落,入37cc CO:孵箱消化20min;注射器收集消化酶液,同时注 入PBS冲洗脐带管壁,收集冲洗液;1000rpm,5min, 去上清液,加入内皮细胞完全培养液[21重悬细胞;计 数,接种到1%明胶铺底的培养瓶中,置37CO:孵 箱中培养.第2天细胞贴壁后换新鲜培养基.以后每 2—3d更换培养基.细胞长满后,PBS清洗,0.25%胰 酶消化,分瓶传代培养. 1.2.2HUVEC的鉴定 1.2.2.1相差显微镜下观察细胞形态在倒置显微 镜下连续观察细胞生长形态变化. 1.2.2.2免疫荧光法检测?因子相关抗原接种 HUVEC于预先置入细胞培养板内的盖玻片上至细 胞长成单层,弃培养液,4%多聚甲醛室温固定20min, PBS洗涤,加兔抗人?因子一抗(用含0.1%Triton X一100的PBS1:100稀释),再放入FITC标记的小鼠 抗兔二抗(稀释度1:1000)避光孵育2h,PBS洗涤, DAPI染细胞核,荧光显微镜观察,拍片. 1.2.3含药血清对缺氧HUVEC细胞活性的干预作用 1.2.3.1制备QDTMT含药血清选用成年雄性sD 大鼠18只,体重(250___20)g,由第四军医大学实验动 物中心提供.将大鼠随机分为空白对照组,QDTMT 组(用生理盐水配成浓度为32.4g/lO0mL的QDTMT 混悬液,大鼠低氧处理前按lmL/lO0g灌胃,2~./d, 连续灌胃4d)和生理盐水组(大鼠低氧处理前等体 积生理盐水灌胃).除空白对照组外,QDTMT组和生 理盐水组使用低压氧舱进行缺氧造模[31.大鼠于缺氧 1周后经腹主动脉取血,800rpm离一t~,25min,分离血 清,一70cc存放.使用前经56?,30min灭活,0.22m 滤膜灭菌,一20?保存备用.用含10%胎牛血清M199 培养基将3种血清浓度配制为10%使用. 1.2.3.2MTT检{=910细胞活性选择生长状态良好的3— 5代HUVEC细胞,lx104/mL接种于96孑L培养板,以含 10%胎牛血清M】99培养至对数生长期,用无血清 M199培养液继续培养6h.按干预不同,细胞分为3 组:(1)空白对照组,加入10%空白对照组大鼠血清; (2)生理盐水组,加入10%生理盐水组大鼠血清;(3) QDTMT~N,加入10%QDTMT组大鼠血清.另设调零 孔组,只加培养液无细胞.每孔加入含血清培养基均 为200,每组设8个平行孔,除空白对照组在CO 2 培养箱正常培养24hgb,其余两组放人三相气体培 养箱中,在37oC,5%CO以及2%氧浓度条件下培 养24h.之后,每孔中加入MTF液(5mg/mL)20tzL, 继续培养4h,倾去培养板中液体,每孑L中加入DM— S0液200并震荡,调零孑L调零后用酶标仪测定 每孑L吸光度值,波长为490nm. 1.2.4统计学处理所测得MTF实验结果采用 SPSS13.0进行统计学分析,数据用(均数?标准差) 表示,P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1相差显微镜下观察细胞形态在倒置显微镜下 连续观察,可见培养的原代内皮细胞在接种4h之后 开始贴壁生长,细胞呈球形,小多角形,单个或小团块 存在;接种24h后可见细胞贴壁,部分细胞分化生 长.初长出的细胞为单层,互不重叠梭形,边界清楚, 胞浆丰富,核清晰,圆形或椭圆形.接种第2—3天,细 胞即进入对数生长期,细胞生长迅速;第5—8天,细胞 长成片,中心排列紧密的部分可见呈典型铺路石子 状排列的单层细胞.(见图1) 图l相差显微镜下观察到的HUVEC(200倍) 2.2免疫荧光法检测?因子相关抗原荧光显微镜 下可见培养的HUVEC胞浆内有黄绿色荧光,证实人 F?因子相关抗原的存在.对照组细胞呈阴性反应. (见图2) 图2FITC标记的F?因子荧光染色(100倍) 2_3MTT检测结果MTT检测结果示,与空白对照 组相比,缺氧使生理盐水组和QDTMT组细胞增殖 受到抑制;与生理盐水组相比,QDTMT组促进了内 皮细胞增殖,差异有统计学意义(P<o.o5).(见表1) 第15卷第2期 V01.15No.2 中莲药导般 GuidingJournalofTraditionalChineseMedicineandPharmacy 2009年2月 February.2009 壅鲨型塞里!!型兰塑重竺墅堕 组别OD值(,n=8) 空白对照组0.47~0.05 生理盐水组0.15~0.04 QDTMT~N0.22~0.05 注:与生理盐水组相比,P<O.05. 3讨论 血管内皮细胞结构和功能紊乱与血管疾病间的 关系是目前国内外心血管疾病研究学者普遍关注的 研究课题.血管内环境的健全主要依赖于内皮细胞 的良好功能.人脐静脉血管内皮细胞为研究该领域 问题的有力工具.人脐静脉血管内皮细胞可从脐带 获得并通过原代培养成为细胞系,而人第?因子免 疫荧光抗体检查法是鉴定人脐静脉血管内皮细胞的 良好方法[51.本实验研究在细胞培养中应用文献【2】 记载的内皮细胞完全培养液,在维持内皮细胞正常 生长和形态结构的前提下,减少了培养液中加入 VEGF,bFGF等混杂因素对实验结果的干扰.此外,不 同于以往关于该复方中药的研究旧,本实验对血清供 体动物进行了缺氧性造模.近年来,许多学者指出p-sl, 为了在最大程度上接近药物在体内生物转化的真实 过程,离体组织(细胞)的供体动物和含药血清的供 体动物必须具有同质性.在本实验研究中,为更好反 映出由QDTMT诱导机体内源性成分所产生的作 用,保证中药血清药理学实验结果与在体实验的一 致性,我们对血清供体动物进行了缺氧造模.此外, 为尽量减少细胞培养过程中自身血清对细胞的影 响,实验中统一采用了10%的大鼠血清,研究者发现 10%的大鼠血清对细胞潘『生影响无统计学意义. 已知内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)对内皮细胞的存活,增殖和迁移功能 有重要影响,是生理和病理状态下血管新生的重要 调节者[10,11].正常细胞或肿瘤细胞在缺氧时不仅产生 VEGF,而且通过旁分泌诱导血管内皮细胞VEGF受 体发挥对VEGF生物效应的调节作用.其中,KDR 是VEGF发挥生物功能的主要受体,它介导了VEGF 的有丝分裂作用,选择性的KDR活化能充分发挥胞 内的细胞迁移信号的发放[121.实验发现,在使用 VEGF中和抗体或KDR中和抗体后,完全阻断了维甲 酸诱导的血管新生作用『l3]. 既往关于QDTMT的研究发现,其内皮保护作 用与促进内源性VEGF的分泌有关[14,15_,动物在体 实验已证实,QDTMT可促进缺氧大鼠内源性VEGF 的分泌.本实验观察到,与生理盐水组相比,QDTMT 含药血清的干预促进了缺氧后内皮细胞增殖,与在 体实验观察到的结果一致.笔者认为,QDTMT促内 皮细胞增殖机制,很可能与QDTMT促进缺氧后 VEGF旁分泌作用于内皮细胞KDR受体有关.故此, 该实验仍需进一步探讨QDTMT对VEGF促内皮细胞 增殖相关信号通路的影响. 参考文献 【1】王宗仁,李晶华,肖铁卉,等.芪丹通脉片预防大鼠急性心肌 缺血及对VEGF,bFGF表达的影响fJ].第四军医大学, 2003,24(7):628-631 [2]李琴山,冯赞杰,刘洋,等.一种改进的人脐静脉内皮细胞 的培养方法[JJ.第四军医大学,2007,28(3):276—278 【3]孙新,苏慧,臧益民,等.U50488H对低氧性肺动脉高压大鼠 体内一氧化氮,内皮素及血管紧张素II水平的影响[J】.心 脏杂志,2007,19(3):249—257 [4】罗颖,李志超,张齐隘性低氧对大鼠主动脉与肺动脉平滑肌细 胞增殖影响的差异陶_川决西医学杂志,2006,35(4):428--430 [5】范佳林,邱前辉.人脐静脉血管内皮细胞的培养与鉴定[J】. 现代中医药,2005,(3):5-6 【6】李静,王文,王宗仁.芪丹通脉片联合骨髓间充质干细胞 修复损伤内皮细胞Caspase一3,c—IPI一1和C—IPI一2的表达 [J].中医药导报,2007,13(2):9-11 [7]薛洁,谢梅林.中药血清药理学的方法学研究近况[J].中草 药,2003,34(6):附9—11 【8】张声鹏,施旭光,桂蜀华.关于中药血清药理学中血清供体 动物是否造模的思考[J].中国中西医结合杂志,2001,21(5): 388-389 [9】接传红,高健生.中药密蒙花抗血管内皮细胞增生作用的 研究[J】.眼科,2004,13(6):348—350 【10】Yla—HerttualaS,RissanenrrI’,VajantoI,eta1.Vascular endothelialgrowthfactorsbiologyandcurrentstatusof clinicalapplicationsincardiovascular[J】.medicineJ 1026 AmCollCardiol,2007,49(10):1015— 【11】YamakawaM,LiuLX,DateT,eta1.Hyp0xia—inducible factor-1mediatesactivationofculturedvascularen— dothelialcellsbyinducingmuhipleangiogenicfactors fJ].CircRes.2003,93(7):664—673 【l2】A.Gampel,L.Moss,M.C.Jones,eta1.VEGFregulates themobilizationofVEGFR2/KDRfromanintracellular endothelialstoragecompartment[J].Blood,2006,108(8): 2624-263l 【13]SaitoA,SugawaraA,UrunoA,eta1.All-transretinoic acidinducesinvitroangiogenesisviaretinoicacidre- ceptor:possibleinvolvementofparacrineeffectsofen— dogenousvascularendotheliMgrowthfactorsignaling[J]. Endocrinology,2007,148(3):1412—1423 【l4】王文,王宗仁,张金洲,等芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管 新生作用与机制研究Ul中国中医急症,2007,16(2):190-191 (收稿日期:2008—09—16编辑:蔡铁如) 3