【doc】氯化镉对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12增殖与分化的影响

【doc】氯化镉对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12增殖与分化的影响 氯化镉对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12增殖 与分化的影响 ---—— 654._.—— 文章编号:1007—4287(2004)06一O654—03 ChinJLabDia即,Deeen~er,2004,Vol8,No.6 氯化镉对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 PC12增殖与分化的影响 王欣,孟洪琪",凌翎,张春霞,龙英丽,林文华,叶军绎 (1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室;吉林长春130021;2.吉林大学医学部临床七年制) 摘要:目的研究不同浓度氯化镉对鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)i~值和神经生长因子(NGF")诱导下PC12细 胞分化的影响.?采用MrllTr比色微量分析,观察不同浓度的氯化镉对PC12细胞增值影响.?采用形态学方 法,观察不同浓度的氯化镉对NGF诱导的PC12细胞分化的影响.结果不同浓度的镉对PC12细胞的增值有明显的 抑制作用,存在剂量一效应关系.不同浓度的氯化镉,不同作用时间对NGF诱导的PC12细胞分化无明显影响.结论 氯化镉对PC12细胞的增值有抑制作用,而对NGF诱导的PCI2细胞的分化无显着的影响. 关键词:氯化镉;PC12;细胞增值,分化 中图分类号:R736.6文献标识码:A ,nleEmofCadmiumontheProliferationandDirentionofthePheochromocytomacellG 舡,^Hong-qi,_VG Ling,eta1.(SchoolofPrevemiveMedicine,JilinUniversity,Changchun13002l,Ch/na) Abstract:ObjectiveToexploretileeffectsofcadmltmlchlorideontileproliferationofPCl2an dthedifferentiationofPC12in— dueedbyNGF.Methodscolorimetrymethodswereemployedtoinvestigatetheeffectsofcadmiumchlorideoneffectsofcad— miIMnchlorideontheproliferationofPC12andt}lediffemntiafionofPC12inducedbyNGF.ResultsDirentconcentrationcadmi— ulnp0sedsiofificantinhibitionontheproliferationofPC12.Thereisnosiofificanteffectsofdi fferentconcentrationcadnfiumcMofide onthedifferenfiafionofPCl2.ConclusionCadmiumchloridecansigr~canflyrepressedt}leproliferationofPC12andexertedno influenceonthedifferentiationofPCl2. Keywords:cadmiumchloride;cellpmliferafion;celldifferentiation 镉是广泛存在于生产生活环境中严重危害人体 健康的一种重金属污染物,可以对机体多种组织和 器官产生毒性作用及诱发肿瘤.研究明:镉具有 致癌和"治"癌的双重作用,大量的体内,体外实验显 示镉及其化合物可诱导多种细胞凋亡,大剂量的镉 甚至可有效地杀灭肿瘤细胞,镉及其化合物的抗肿 瘤机制正成为众学者研究的热点.PC12细胞是大 鼠肾上腺嗜铬瘤细胞克隆化的细胞株,被广泛用作 神经细胞分化,离子通道,受体和递质释放的实验材 料.本实验用PCl2细胞观察氯化镉对其增殖,分化 的影响,探讨镉化合物对其毒性作用. 1材料与方法 1.1细胞株和培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 株PC12(吉林大学第一临床医院神经科学研究所提 供)在含15%胎牛血清,L广谷胺酰胺,100Uhnl青霉 素和100t,g/mi链霉素的DMEM高糖培养基中,置于 37?,5%c02,饱和湿度的孵箱中传代培养,EDTA. *通讯联系人 (ChinJLab脚,2004,8:654) 胰酶消化,传代. 1.2不同浓度氯化镉对PC12细胞增殖作用的检 测细胞增殖功能检测采用噻唑蓝颜色反应法 (MTr法)….取对数生长期的细胞以每孑LlO'个细 胞浓度接种到96孑L板上,二氧化碳孵箱中培养3小 时后,加入不同浓度的氯化镉溶液,其终浓度分别为 0.0vmol/L,0.1vmol/L,2.5vmol/L,5.0vmol/L,7.5 tanol/L,10/mad/L(各浓度设6个平行孔),置二氧化 碳孵箱中培养至72小时.在结束培养前4小时每 孑L加入MTr2Ol,检测前弃去培养液,用PBS洗涤 细胞后加DMSO150d/;fL,充分振荡10分钟,用酶 标仪检测540啪的吸光度值(0D),以细胞的存活 率反映细胞的增殖.细胞存活率%=实验组OD/空 白组OD×100%. 1.3不同浓度氯化镉对PC12细胞分化作用的检 测取对数期生长的细胞以每孑L104个细胞浓度接 种在24孑L板上,二氧化碳孵箱中培养,待细胞贴壁 后加入不同浓度氯化镉溶液(终浓度分别为0.0 tmaol/L,0.1gmol/L,2.5gmol/L,5.0/maol/L,7.5tmaol/ 2004年12月第8卷箍 L,10gmol/L),每个浓度设3个平行孔,继续培养2 小时后加入终浓度为50ng/ml神经生长因子 (NGF).培养48小时后甲醇固定,吉姆萨染色,显 微镜下以细胞突触长度超过细胞本身直径两倍者为 阳性,分别记录各孔的阳性细胞数,每孔计数100个 细胞. 1.4氯化镉不同作用时间对PC12细胞分化作用 的检测取对数期生长的细胞以每孔lo4个细胞浓 度接种在24孔板上,待细胞贴壁后加入终浓度为 5.0/maol/L氯化镉,分别在镉作用0min,15min,30 min,60min,120min,240min后加入神经生长因子 NGF(终浓度50ng/m1),对照组加神经生长因子不加 镉.共同培养48小时后,甲醇固定细胞,吉姆萨染 色,显微镜下以细胞突触长度超过细胞本身直径两 倍者为阳性,分别记录各孔的阳性细胞数,每孔计 数100个细胞. 1.5数据统计采用SPSS统计软件进行统计处 理. 2结果 2.1氯化镉对PC12细胞增殖的影响镜下观察 PC12细胞培养3,4小时后,细胞开始贴壁,且细胞 边缘平滑,折光性强.48小时后细胞生长旺盛,增 殖明显,细胞密度增大,出现融合的细胞及成团分布 的细胞丛.加入氯化镉的PC12细胞数目减少,胞质 内可见黑色小点或小泡,细胞折光性下降,发暗,生 长状态不好.氯化镉对PC12细胞的增殖有抑制作 用,随着氯化镉浓度增高PC12细胞存活率逐渐降 低,呈剂量一效应关系(见表1).当氯化镉终剂量>15 pmol/L时对PC12细胞增殖抑制作用差异显着(P< 0.05) 表1不同浓度氯化镉对PC12增值作用影响 注:*与空白对照组比较P<0.05 2.2不同浓度氯化镉对NGF诱导的PCI2细胞分 化影响与对照组相比,在氯化镉作用下PC12细 胞,随着镉浓度的增加,细胞总数逐渐减少,很多细 ?—-—— 655'__—— 胞内出现大量空泡,各组阳性细胞分化百分率略有 差别,但是不具有统计学意义(见表2). 表2不同剂量氯化镉作用下的PC12细胞分化率(?s) 剂~(/nnol/L)阳性分化率 0 0.1 2.5 5.0 7.5 10.0 0.13?0.1 0.11?0.06 0.16?0.06 0.15?0.02 0.11?0.OH6 0.12?0.05 2.3不同作用时间的氯化镉对PCI2细胞分化的 影响每孔计数100个细胞,其中分化的神经细胞 数目各组间无显着差异,镜下观察各组的细胞总数, 生长状态随着时间的不同无明显的不同. 3讨论 镉是一种具有高度生物学活性的金属,在体内的半 衰期长,易蓄积,可引起机体的急慢性中毒.大剂量 急性镉中毒可致肝,肺,肾,睾丸的损害.目前也有 少量报道指出镉对神经系统的毒性作用.本实验采 用氯化镉与PC12细胞进行培养,直接观察镉对 PCl2细胞的毒效应. 结果显示,镉对PC12细胞的生长增殖有明显的 抑制作用,且在短时间内就显示出来.倒置显微镜 下观察,镉作用下的细胞数目减少,细胞变小,胞质 内可见黑色小点或小泡,细胞折光性下降,发暗,生 长状态较差.随着镉浓度增加,其对细胞的毒性作 用逐渐加大,细胞的存活率渐低,当氯化镉终剂量? 5tanol/L时对PC12细胞增殖抑制作用差异显着(P <0.05),氯化镉对PC12细胞的毒性作用呈现明显 的剂量依赖关系.表明氯化镉可有效抑制PC12细胞的生长增殖,此外我们还观察了镉化合物对PCI2 细胞分化影响,结果显示,镉对NGF诱导PCI2虽然 有细胞毒性作用,但是不同浓度氯化镉和不同作用 时间对PC12细胞分化皆无明显影响,且随着镉浓度 的增加,存活的细胞总数越来越少,细胞体积变小, 很多细胞内出现大量空泡,但分化细胞表现为形状 狭长,平铺或伸出多个突起,这些结果与文献报道的 相同J,表明镉只是抑制PC12细胞的增殖,可能并 没有改变此细胞的生长特性.产生原因一方面可能 是镉的抑制作用,给予分化细胞相对充足的空间及 营养条件使细胞分化数目不减少.另一方面有研究 表明,镉对细胞的毒性作用,可能通过镉一钙之间的 ?-—— 656?-—— 相互作用实现的.邵梅_4等发现PC12细胞上存 在多种类型的钙通道,未分化的PC12细胞与NGF 诱导分化的PC12细胞上的钙通道的类型和比例不 同.此实验结果表现的氯化镉不影响PC12细胞的 分化,可能是镉对PC12作用与细胞生长特性有关, 经钙通道进入未分化PC12细胞引起死亡的,而对分 化的PC12细胞由于钙通道的不同,镉的毒性不同, 从而使经NGF诱导分化的PCI2细胞的数最没有减 少. 大量的研究表明镉的毒性作用机制较复杂,对 于其可以有效抑制PC12细胞的增殖,却不影响 PC12细胞的分化特性,需从分子水平提供更多证 — Ch— in』垒髓一Decem—be—r,oI量: 据,有待进一步深入细致的实验工作. 作者简介:王欣,女,1966年生人,理学博士,讲师.主要从事 重金属等环境污染物对机体损伤效应的研究. 参考文献: [1林忠气!,董胜璋,董书芸,等.M'IT法检测|r淋巴细胞增功能的 方法学探讨与应用J].2000,10(I):8. 12]丁}『Jj杰,史学义,张娓,等,NGF诱导PCI2细胞分化的神经细胞 行为观察[J].河南医科大学,2001,36(3):281. [3]刘杰.镉的毒性和毒理学研究进展[J].1jl1华劳动]!生llj{,I粕杂 志,1998,16(1):2. 4梅,陈生弟,刘振围,等.8一淀粉样篮I125,片段敏大鼠嗜 铬细胞瘌细胞损伤的钙离子机制fJ].r#冲绎科杂志.2002,35 (4):207. (收稿日期:2(7104—02,16) 晕车对白细胞计数的影响 杨光 f长春市儿童医院检验科,吉林长春130061) 来院就诊的儿童检测血常规,经常发现白细胞 数超过15×109/I,而这些儿童无任何细菌感染指 征,未服用可使白细胞数增高的药物,在采血过程中 非常合作,不存在因情绪激动致使白细胞数升高的 因素.针对这一反常现象,我们做了详细的研究,得 出结论,晕车可致使儿童白细数明显升高. 1材料与方法 1.1研究对象门诊体检的正常儿童320名中,有 33人白细胞数明显增高,超过15X109/L,经询问无 任何不适症状,都是打车来院的.针对这33名儿 童,根据自愿,有28名儿童同意配合我们做实验,查 找白细胞增高的原因. 1.2仪器使用日本东亚公司的KX一21血球计数 仪. 1.3采血方法每次采20l耳血和20指血,用 预稀释方法测量,同时用EDTA一2K抗凝真空采血 管采静脉血0.5ml,直接测量白细胞.志愿者来院 后,在院内做2小时轻微活动后,统一采3份血,测 量白细胞数.第一次采血后,4人一组乘出租车运 行5,7公里后,回到医院下车后立即采第二次血, 3O分钟,60分钟再次采血. 2结果 以第一次白细胞数为基准,第二次所有人耳血 值都升高,升高70%,400%不等,分类无变化.指 血升高20%,40%不等,分类无变化.静脉血升高 10%,20%不等,分类无变化.第三次结果,所有人 的细胞数都下降,以第二次为基准,下降50%, 65%不等,分类无变化.第四次结果,所有人白细胞 数均接近第一次结果,上下波动不超5%,分类无变 化. 3讨论 晕车,是一组症状,表显为面色苍白,头晕,恶 心,呕吐.此时检测白细胞,因身体处于一种应激状 态,白细胞数升高.身体无任何不适症状,乘车后, 白细胞数明显升高,可称为不典型晕车. 不典型晕车,医生无法从症侯上加以判断,但白 细胞计数确已表现出来.若此时检测血常规,白细 胞数升高,会给医生以误导. 为防止不典型晕车的误导,应在患者来到医院 一 小时后做白细胞数计数,才有意义. 目前使用的血球计数仪,各家医院都把所有的 项目一起报给医生,医生应根据需要,有选择地应用 这些值. 现代医学证明,白细胞计数,对于判断感染类 .医生必须摒弃传统的用白细胞计数 型,意义不大 和分类判断感染类型的旧观念. 对于大多数患者,可应用快速C一反应蛋白检测 仪,检测C一反应蛋白来初步判断感染类型,指导医 生用药. (收稿日期:2003—12一z29 ' >: ?