[doc] A群β溶血性链球菌药敏试验及大环内酯类抗生素耐药基因检测

[doc] A群β溶血性链球菌药敏试验及大环内酯类抗生素耐药基因检测 A群β溶血性链球菌药敏试验及大环内酯类 抗生素耐药基因检测 338中国感染与化疗杂志2008年9月20日第8卷第5期ChinJInfectChemother,September2008,Vol8,No5 A群』3溶血性链球菌药敏试验及大环内酯类 抗生素耐药基因检测 马耀玲,杨永弘,梁云梅,俞桑洁,袁林,沈叙庄 ? 论着? 摘要:目的研究我国儿科A群p溶血性链球菌(GAS)临床分离株抗菌药物敏感性情况.方法收集5所儿童医院 2005--2006年222株GAS感染的临床菌株,采用琼脂稀释法测定11种抗菌药物的MIC值;诱导试验分析大环内酯类抗生素 耐药型;PCR检测大环内酯类抗生素耐药基因ermB,erDJTR和mefA.结果分离株对大环内酯类抗生素和克林霉素耐 药率在93.69,98.65,MIC>512mg/I;对四环素的耐药率为94.14;对青霉素,头孢他啶的敏感率高达1()().分离 株大环内酯类抗生素耐药以耐大环内酯类,林可酰胺类和链阳性菌素B表型(cMLS)为主,占99.()4,iMIS表型仅2株,未 检测到M型;ermB,erlYl丁尺和mP,A阳性率分别为94.71,2.89和0. 结论所测儿科GAS感染流行菌株对大环内酯类 抗生素和克林霉素耐药率高,主要耐药机制为ermB编码的23SrRNA 甲基化酶导致靶位改变,青霉素类和头孢菌素类抗生素 是治疗我国GAS感染首选药物. 关键词:链球菌;大环内酯类;表型 中图分类号:R378.12文献标识码:A文章编 号:1009—7708(2008)05—0338—05 ThedrugresistanceanalysisofGroupAbeta--hemolyticstreptococciandthedetec-- tionofmacrolide—resistantgene MAYao—ling,YANGYong—hong,LIANGYun—mei,yUSang—jie,YU ANLin,SHENX”一 zhuang.(DepartmentoJ,MicrobiologyandImmunology,BeijingChildrenSHospitalAffiliatedto UniversityofMedicalNcien~e,Beijing100045,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatethedrugresistanceOfGroupAStreptococcus(GAS)isolatesftomChinesechildren.Meth— odsAtotal0f222GASisolatesCOIlectedftom5ChildrenSHospitalsinChinaduring2005—2006werestudied. Theminimum inhibitoryconcentrations(MICs)of11antibioticswereevaluatedbyagardilutionmethod.Double—discagardiffusiontestwas usedtOdeterminethemacrolideresistancephenotype,Thegenesencodingerythromycinresistance(ermB.ermTRandmefA) wereamplifiedbyPCR.ResultsAmongthe222isolates,theresistanceratestOmacrolidesandclindamycinrangedfrom 93.69tO98.65,withMIC>512mg/l.Theresistanceratetotetracyclinewas94.14.Allstrainsweresusceptibleto penicillinandceftazidime.ThemostcommonmacrolideresistantphenotypewascMIStype(99.04).Onlytwostrainswere iMIStype,andnoMtypewasdetected.Theerlli~,ermTRandmefAgenewasidentifiedin94.71,2.89and0ofthe strainsrespectively.ConclusionsTheresultsindicatethatmacrolidesresistanceprevalentintheGASisolatesfromchildrenin China.ThemainmechanismofmacrolideresistanceiS23SrRNAmethylationencodedbyeril1]3gene.PeniciIlinsandcephalo— sporinsshouldbethefirstchoicetotreatGASinfectionsinChina. Keywords:StreptocOtCUSP3og’enesMacrolide;Phenotype A群p溶血性链球菌(GAS)是引起儿童感染性 基金项目:国家863项目资助(2006AAO2Z417). 作者单位:首都医科大学附属北京儿童医院微生物及免疫室,北京 l()0045. 作者简介:马耀玲(1982一),女.在读硕士研究生,主要从事微生物, 感染领域研究. 通讯作者:沈叙庄,Email:xuzhuangshen@l63.COFII. 疾病的重要病原菌.最多见的感染是急性咽扁桃体 炎,猩红热和脓疱疮等感染,随着抗生素的广泛应 用,近年来采用青霉素或大环内酯类药物治疗GAS 感染失败的情况在世界范围内有增高趋势.为 了解近期我国GAS对抗生素的耐药性及大环内酯 类抗生素的耐药机制,我们对2005--2006年5所儿 童医院(首都医科大学附属北京儿童医院;上海交通 中国感染与化疗杂志2008年9月2()日第8卷第5期 ChinJInfectChemother,September2008,Vol8,No.5339 大学附属上海儿童医院;复旦大学附属儿科医院;广 州市儿童医院;重庆医科大学附属儿童医院)222株 GAS感染的临床菌株进行了抗菌药物敏感性研究. 材料与方法 一 ,材料 (一)菌株来源20052006年我国5所儿童 医院的临床GAS分离株,62.46为急性咽扁桃体 炎,16.12为脓疱病,21.42来自脓疱病,猩红热, 链球菌感染综合征,急性肾小球肾炎等患儿.咽拭 子,脓液,血液标本接种于5羊血培养基,挑选p溶 血菌落进行杆菌肽检测,阳性株采用Lancefield族 特异性抗血清分型确定为GAS. (二)抗菌药物和药敏纸片抗菌药物标准品青 霉素,头孢他啶,红霉素(14元环),克拉霉素(14元 环),阿奇霉素(15元环),交沙霉素(16元环),克林 霉素,复方磺胺甲口恶唑,氯霉素,四环素和氧氟沙 星;药敏纸片包括红霉素(15g/片)和克林霉素 (2g/片)均购自中国药品生物制品检定所. (三)Taq酶,dNTP购自宝生物有限公 司;PCR引物委托上海生工生物工程技术服务有限 公司合成. (四)质控菌株肺炎链球菌ATCC49619用作 琼脂稀释和纸片扩散敏感性试验的质控菌株. 二,方法 (一)抗菌药药敏试验11种抗菌药物对222 株GAS的MIC值检测采用琼脂稀释法,按CLSI 规程操作].抗生素敏感性判定依据2006年CLSI 判定标准.棉签蘸取0.5麦氏浊度的GAS悬浊液 均匀涂于59/6羊血的MH培养基上(Mueller-Hinto 琼脂+5羊血的培养基).质控株为肺炎链球菌 ATCC49619. (二)大环内酯类药物耐药诱导试验_5将红霉 素纸片和克林霉素纸片间隔15,20mm置于加有 59/6脱纤维羊血的MH琼脂平皿上,37?,5%CO 条件下与0.5麦氏浊度的菌液孵育18h后观察”D” 诱导试验结果:两纸片抑菌圈直径均在耐药范围,为 结构型耐药表型(cMLS);对克林霉素纸片敏感,但 靠近红霉素一侧抑菌圈变钝,即克林霉素出现”D” 抑菌环者为诱导型耐药表型(iMLS);对克林霉素敏 感且靠近红霉素一侧无变钝抑菌圈为M表型. (三)基因检测用PCR方法检测大环内酯类 药物耐药基因ermB,ermTR和mefA;水煮法提取 222株GAS的DNAl6],所用引物见表i. PCR条件:94?预变性1rain后,94?变性 30s,退火30s,72.C延伸30s,30个循环后72? 再延伸i0rain.PCR扩增产物1,1.5琼脂糖 凝胶电泳,溴化乙锭染色成像. 表1用于检测ermB,ermTR和mefA的引物 Table1.PrimersusedforamplificationofermB,ermTRandmefAgenes[] 结果 琼脂稀释法检测222株GAS对11种抗菌药物 的药敏试验结果如表2所示,GAS对大环内酯类抗 生素和克林霉素的耐药率在93.699/6,98.659/6,且 MICs和MIC..都?512mg/L;而对青霉素,敏感率 仍为100,但MIC和MIC分别为0.625和 0.12mg/L.此外,分离株对四环素的耐药率为 94.14,MIC5和MIC.均?32mg/L;对氧氟沙星 和氯霉素的敏感率较高,分别为95.05和 81.089/6;对头孢他啶,复方磺胺甲口恶唑的敏感率高 达100,MIC5和MIC.分别为?0.25mg/L, 0.5mg/L;?0.125mg/L,?0.125mg/L. 208株红霉素耐药的GAS菌株进行诱导试验结 果见表3,cMLS表型最常见,占99.049/5,iMLS表型 仅2株,未检测出M型.耐药表型与MIC的结果一 致.208株红霉素耐药株94.719/5(196/208)ermB基 因阳性;ermTR阳性占2.89(6/208),未发现mefA 阳性菌株.5株红霉素敏感菌株未检测到ermB, ermTR和,基因型与表型之间的关系见表3. 340中国感染与化疗杂志2008年9月2I)日第8卷第5期 ChinJInfectChemother,September.2008,Vol8.No5 Penicillin Ceftazidime Erythromycin Azithromycin Clarithromycin Josamycin Clindamycin trimethoprim Sulfamethoxazole— Tetracycline Ofloxacin Chloramphenicol ().9() 【1.9【1 ().45 2.7【1 1()() 4.96 95.I)5 81.()8 98.65 98.65 98.2() 96.4() 0 94.14 0 4.51 <().625—0.12 <().25).5 ().25一>512 ().5一>512 ().25>512 0.25一>512 0.125一>512 <().125—0.125 0.25一>32 (】.5—4 2一>32 ().625 ().25 >512 >512 >512 >512 >512 ().125 32 1 4 【).12 ().5 >512 2>512 >512 >512 >512 ().125 2>32 2 8 表3208株耐红霉素GAS耐药表型构成及对2种抗生素耐药情况, 基因特征关系 Table3.Thephenotypesandgenotypesof208strainsofmacrolide—resistant GroupAStreptococcus 讨论 青霉素一直是治疗GAS感染的首选药物,对青 霉素过敏病例的治疗主要选用大环内酯类药物,然 而近10余年来GAS对大环内酯类抗生素耐药报道 逐年增加.1998--2001年在西班牙发现对红霉素 和阿奇霉素的耐药率显着增长,1997--2001年在 多伦多发现耐大环内酯类抗生素的GAS感染菌株 增加了近7倍],匹兹堡儿童GAS感染菌株对红霉 素耐药率增长至48Evil.然而,2000--2006年英 国,印度和波兰GAS对红霉素的耐药率分别为 6.6,17.6和9.8E4.1.,耐药率相对较低.整 体来看,我国大环内酯类抗生素耐药率显着高于其 他国家,我国董太明等.报道,19931994年对4 个地区儿童调查中,GAS对红霉素耐药率为 43.3,我们曾报道1993—1994年北京地区上呼吸 道感染儿童GAS分离株红霉素耐药率达 66.6E143,2007年肖永红等报道97株从儿童 感染者中分离的酿脓链球菌对红霉素,克林霉素,麦 迪霉素,阿奇霉素和克拉霉素的耐药率分别为 67.O,45.4,48.5,72.2和60.8,2003年 中国香港GAS对红霉素耐药率为31.8,从儿童 分离的菌株>27.1Et6].本研究2005--2006年儿 科GAS临床分离株对大环内酯类抗生素的耐药率 为93.69,98.65,远高于以往国内外报道.可 以看出我国儿科GAS感染流行株对大环内酯类抗 生素耐药十分严重,参考同期上述5所儿童医院门 诊抗菌药物使用,大环内酯类抗生素排名第一,可以 推测儿科长期广泛使用大环内酯类抗生素可能是耐 药率增高的主要因素.临床医师应谨慎选用大环内 酯类抗生素治疗GAS感染. 作为治疗GAS感染的首选药物,过去7()年来 一 直认为青霉素的MIC值没有增高,近年有报道青 霉素MIC值出现增高趋势,并出现了青霉素不敏感 菌株.2006年印度的Capoor等发现GAS青 霉素的MIC值及耐药率比以往研究增高,20.6 (7/34)耐药,MIC值为0.19,0.25mg/L,MIC和 MIC分别为0.047mg/I和0.19mg/L.同样在 墨西哥也发现了青霉素MIC值的增加(0.25,0.75 rag/L),我们的研究显示1993—1994年儿科 GAS分离株对青霉素的MIC和MIC均为 0.0125mg/L1==1].2005--2006年儿科GAS分离株 虽对青霉素1()()敏感,但MIC和MIC有明显增 高,分别为0.0625mg/L和0.12mg/L.这可能与 儿科临床大量使用青霉素等J3内酰胺类药物有关. 另外,GAS分离株对头孢菌素类,复方磺胺甲 嗯唑,氧氟沙星和氯霉素的敏感率很高,分别为 100,10O,95.O5和81.O8.由于后三者对 002 li 中国感染与化疗杂志2008年9月2()日第8卷第5期ChinJInfectChemother,September2008,Vo1.8,No5341 儿童的种种不良反应,目前不推荐儿科使用. 细菌对红霉素的耐药机制主要为:?errnB基 因介导靶位点修饰.errnB基因编码核糖体甲基化 酶,可使细菌23SrRNAA2058位点的腺嘌呤残基 N一6位二甲基化.其耐药表型为MLS,即对大环内 酯类,林可酰胺类抗生素和链阳性菌素B交叉耐 药,可被分为cMLS和iMLS,后者表现为仅对大环 内酯类抗生素耐药,当耐药基因被完全诱导时,则表 现为结构型耐药.4d93.?主动外排机制.外排泵 膜相关蛋白由mefa编码,为M耐药表型,即对14 元和15元大环内酯类抗生素耐药,而对16元大环 内酯类抗生素,克林霉素和链阳性菌素B敏 感’1921].?核糖体突变导致的耐药.变异主要发 生在与大环内酯类药物结合密切相关的23SrRNA V区,?区及蛋白质L22及L4的高度保守序列 中I2驯.?灭活酶的产生.肠杆菌科细菌由ereA, ereB基因编码的红霉素酯酶或mph基因编码的大 环内酯2’-磷酸转移酶,能破坏14元环大环内酯类 抗生素的内酯环,但不能破坏16元环大环内酯类抗 生素的结构,导致细菌对该类抗生素耐药_2.GAS 对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为前两种. 2006年,Robinson等j研究发现,来自34个国家 212株GAS感染菌株中,85株为M型,其中77株 检测到mefA,127株为MLS型,在4株iMLS和44 株cMLS型菌株中检测到errnB;2003年我国香港 报道39株红霉素耐药的菌株中,erYflTR,me和 errnB分别为17,14和6株Il;2005年葡萄牙Silva— Costa等口I_研究发现cMLS,M型和iMLS分别为 52.3,46.4和1.2,所有的M型菌株均检测 到mefA基因,4.9的MLS型含有me和errnB 基因,其余的则仅检测到errnB基因;国内近期尚无 此方面报道,本研究中,208株儿科红霉素耐药的 GAS临床分离株中,cMLS表型占99.04(206/ 208),iMLS仅检测到2株,未检测到M型,所有的 cMLS均检测到errnB基因,有6株同时含有errnB 和erD’l丁尺基因,2株iMLS型菌株都仅含有errnB 基因,未检测到me,A基因.表明,我国红霉素耐药 基因型和表型具有高度一致性,耐药机制主要为 errnB基因介导靶位点改变,大环内酯类抗生素耐药 株主要为cMLS表型.这一结果与国外文献报道有 显着差异,造成国家,地区间耐药模式和机制差异的 可能原因是流行菌株血清型不同以及不同耐药克隆 株流行等,有待进一步调查. 总之,对我国儿科临床GAS感染菌株耐药性分 析发现,我国GAS感染菌株大环内醋类抗生素的耐 药率,主要耐药表型和主要耐药机制与其他国家均 存在差异,分离株在对红霉素和新型大环内酯类药 物高度耐药,耐药表型以cMLS为主,耐药机制以 errnB编码为主的23SrRNA甲基化酶致靶位改变 为主.分离株对青霉素MIC.和MIC.有所上升, 应引起关注.在儿科I临床GAS感染的治疗中,应根 据我国GAS耐药流行情况选择抗生素和制定指南, 不能照搬国外方法,慎用大环内酯类和克林霉素等 抗生素,对青霉素过敏者,合理使用头孢菌素类抗生 素作为替代药物,加强对儿科常见病原的耐药监测. 参考文献 [1]ShiblA.Patternsofmacrolideresistancedeterminantsamong S.pyogenesandS.pneumoniaeinSaudiArabia~J].IntMed Ras,2005,33(3):349—355. 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