骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究_cropped

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究_cropped 骺板软骨细胞复合三维支架体外构建 组织工程软骨的研究 周 强 李起鸿 戴 刚 【摘 要】 目的 探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养, 构建组织工程软骨的效果及其生物学特点。 () 方法 将 3 周龄幼兔第 1 代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合, 接种于聚磷酸钙纤维ƒ2聚乳酸 ƒ三维 L C P P F PL L A 支架材料, 构建组织工程软骨组织块, 连续培养 4 周。 行大体、倒置显微镜及组织学、 型和 型胶原免疫组织化学光镜 l? () 观察, 定量检测硫酸糖胺多糖 含量。 结果 构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形, 种子细胞 GA G 呈稳定的三维均相分布, 外观逐渐呈乳白色、半透明, 硬度亦不断增加。 培养 1 周有软骨细胞陷窝形成, 2 周后形成富含 型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨, 且 型胶原逐渐转为阴性。 4 周时构建软骨的组织结构与 ? l 天然骺板软骨相类似, 硫酸 GA G 含量平均为天然骺板软骨的 34% 以上。 结论 骺板软骨细胞复合三维支架体外培养 可生成典型软骨, 且可形成类似天然骺板软骨的组织结构, 能满足修复骺板缺损的基本。体外培养 1, 2 周可能是植 入体内修复骺板缺损的较佳时机。 组织工程软骨 骺板 软骨细胞 再生 【关键词】 中图分类号: 318 813111 R Q -CHO ND RO GENES IS IN V ITRO BY EP IPHY SEAL CHO ND ROCY TES SEED ING INTO THREED IM ENS IO NAL ƒ, 2, . , , SCA FFOLD SZ H OU Q iang L I Q ih ong D A I G angD ep a r tm en t of O r th op aed icsS ou thw es t H osp ita lth e T h ird M il2 . , . . 400038ita ry M ed ica l U n iv e rs ityC h ong q ing PRC h ina O bjec t ive T o o b se rve th e eff ic iency and b io lo g ica l ch a rac te r ist ic s in regene ra t ing in v it ro t issue2en2 【A bstrac t】 2. g inee red ca r t ilage f rom ep ip h y sea l cho nd ro cy tescaffo ld com p lexM e thods T h e f ir st p a ssage ep ip h y sea l cho nd ro cy te s 22, w e re co llec ted and m ixed w ith th e b io lo g ica l ge lm a t r ixth e cho nd ro cy tege l f lu id w a s d ropp ed in to th e scaffo ld to fo rm . . a com p lexT h e com p lexe s w e re in v it ro cu lt iva tedT h e ch ange s o f com p lexe s in m o rp ho lo gy and syn th e sis o f co llagen s ? l. typ e and typ eand agg recan w e re o b se rved unde r th e g ro ss and th e inve r ted and ligh t m ic ro scop e sT h e su lfa te GA G . , co n ten t in com p lexe s w a s m ea su red by th e th e m o d if ied d im e th y lm e th y lene b lue m e tho dRe sults D u r ing cu lt iva t io n 2,th e com p lexe s co u ld k eep it s o r ig ina l sh ap e w ith th e stab le hom o geneo u s th reed im en sio na l d ist r ibu t io n o f cho nd ro cy te s . 1 , g radua lly becam e m ilk w h ite and t ran slucence w ith th e ir r ig id ity inc rea singIn th e st w eek th e cho nd ro cy t ic lacunae . 2 , fo rm ed in th e com p lexe sA f te r w eek sth e com p lex w a s g radua lly reo rgan ized in to th e m a tu re eng inee red ca r t ilage ?, w ith r ich co llagen typ eand agg recan and typ ica l ca r t ilage h isto lo g ica l st ruc tu rebu t w ith nega t ive imm uno lo g ica l sta in2 . 4 , ling o f co llagen typ e In th e th w eek th e eng inee red ca r t ilage re sem b led th e na tu re ep ip h y sea l p la te in th e ch a rac te r2 , 34% . ist ic o f h isto lo g ica l st ruc tu reand h ad o ve r o f th e su lfa te GA G co n ten t o f th e na tu ra l ep ip h y sea l p la teCon c lus ion 22T h e ep ip h y sea l cho nd ro cy tescaffo ld com p lex can be reo rgan ized in to typ ica l ca r t ilage w ith th e ep ip h y sea llik e h isto 2 22 , . 1lo g ica l st ruc tu reand be f it fo r rep a ir ing th e ep ip h y sea l defec tT h e t issue eng inee red ca r t ilage cu lt iva ted fo r w eek s .m ay be a goo d cho ice fo r rep a ir ing ep ip h y sea l defec t 【】 T issue eng inee r ing ca r t ilage Ep ip h y sea l p la te C ho nd ro cy te s R egene ra t io n Key words () : 39830100; Foun da t ion item sN a t io na l N a tu ra l Sc ience Fo unda t io n o f C h ina Inno va t ing Fo unda t io n o f So u thw e st ()200224H o sp ita l o f th e T h ird M ilita ry M ed ica l U n ive r sity 骺板损伤早闭会导致肢体严重的畸形和功能障 术为骺板缺损早闭提供了新的治疗手段。 目前体外构 碍, 是常见的小儿骨伤病, 目前尚缺少能修复损伤骺板 建工程化骺板软骨的方法主要为离心管内细胞团聚集 1 , 4 组织结构和恢复其生长功能的理想材料。 组织工程技 培养、细胞复合凝胶类基质等, 但这些方法均有缺 陷, 很难用于临床。采用已建立的种子细胞双相接种技 5( ) 基金项目: 国家自然科学基金重点资助项目 39830100; 第三军医 , 我们将骺板软骨细胞复合三维高孔隙支架经体 术 ( )大学西南医院科技创新基金 200224 外 培 养 构 建 组 织 工 程 软 骨, 取 得 了 较 好 效 果, 报 告 作者单位: 第三军医大学附属西南医院骨科?组织工程研究与开 ( )发中心 重庆, 400038 如下。 采用M ic ro so f t E x ce l 统计程序进行, 数据以 1 材料与方法均数?标准差示, 组间比较采用独立样本 检验, t P 1. 1 原代骺板软骨细胞的分离和培养值< 0. 05 为有统计学意义。 () 采用系列酶 消化分离 3 周龄幼兔的原代 S igm a 4 结果2 骺板软骨细胞。 苔盼蓝排斥法计数活细胞, 以 3 × 4 2 2. 1 大体及倒置显微镜观察() 10的密度和含 10% 、584 ƒƒcm FB S H yc lo n e m gL 大体观察可见, 接种后细胞2凝胶混悬液立即浸满 ( )非必需氨基 2谷氨酰胺 国产分析纯、0. 1 ƒ L mm o lL网状支架的孔隙, 10 分钟后在支架内固 ƒC P P F PL L A ( ( ) )酸 、0. 4 脯 氨 酸 国 产 分 析 纯 及 ƒG ib co mm o lL 化为半透明的胶冻状, 并共同形成具有支架三维外形 ( ) 50 维 生 素 的 2ƒƒ12 ΛgL C S igm a DM EM H am ’ sF 的整体。 随着培养时间的延长透光度逐渐下降, 1 周 2 时明显呈乳白色、半透明, 同时硬度不断增加, 且表面 () () 培养液, 接种于 175 培养瓶 ,H yc lo n ecm N u n c lo n 润滑, 但培养 4 周其硬度仍与天然软骨相差明显。在培 置于 37?、5% 培养箱内, 间天换液, 培养至 90%CO 2 养过程中构建组织始终保持支架的初始外形。倒置显 ( ) 融合, 收 集 细 胞, 胰 酶 消 化 收 集 第 1 代 软 骨 S igm a 微 镜 下 可 见, 接 种 后 细 胞2凝 胶 混 悬 液 完 全 充 填 细胞。 1. 2 组织工程化骺板软骨的构建和培养 采用组织工 网状支架的孔隙, 细胞在其中呈均匀的 C P P F ƒPL L A 程三维支架种子细胞双相接种技术, 7 ( ) 三维分布 图 1, 培养 24, 48 小时, 支架外周的细胞 将第 1 代软骨细胞以 2. 5×10ƒ的密度与生物凝胶 m l 凝胶开始随支架外形收缩, 表面的细胞变为梭形, 中部 混匀制成细胞2凝胶混悬液, 接种于已消毒水化的聚磷 的细胞仍为圆形、透亮, 以后组织密度逐渐增高, 1 周 () 酸钙纤维 , ƒ2聚 ca lc ium po lyp ho sp h a te f ib e rC P P F L 时镜下已不能透光, 仅可见边缘为梭形细胞。(( ) 乳 酸 22三维支架材料 直径, po lyL lac t ic ac idPL L A ) 11 、高 3 , 孔隙率> 92% 中, 并行固化, 置于加mm mm () 有相同培养液的 6 孔板 公司中, 在 37?、5% BD CO 2 5 孵箱内培养, 5 小时后全量换液, 以后隔天换液。 共 培养 4 周。 1. 3 观察指标 1. 3. 1 大体及倒置显微镜观察 观察构建的复合组 织 块在培养过程中形态、色泽、透明度和硬度等变化, 在 倒置显微镜下观察其细胞形态、组织透光度等变化。 1. 3. 2 组织学观察 分别于培养 1、2、3 和 4 周各采 图 1 细胞接种 10 分钟后, CPPFƒPLL A 支架内饱含细胞凝胶混悬液, 集 3 个标本, 4% 多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋, 脱蜡至 ( ) 细胞分布均匀 倒置显微镜×100( 水, 部分切片行 染色; 另一部分行甲苯胺蓝 H E to lu i21 F ig. The chon drocy te- ge l f lu id f illed in the CPPFPLL A scaf f o ld ƒ) 染色, 光镜观察。, d in e b lu eTB - w ith the stable hom ogen eous threed im en s iona l d istr ibut ion of chon dro- 1. 3. 3 型和 型胶原免疫组织化学观察 常规石 l ? ( )cy te s af ter 10 m in ute s of culture In ver ted m icro scope×100蜡切片, 脱蜡至水, 一抗分别选用鼠抗兔 型和 型胶 l?2. 2 组织学观察 () 原 单 克 隆 抗 体 , 按 免 疫 组 织 化 学 试 剂 盒O n co gen e培养过程中, 构建的组织块由外周向中心逐渐形 ( ) ( 北京中山公司说明操作, 显色液 武汉博士德 DA B 成骺软骨组织结构。其表面为 1, 3 层梭形细胞组成的 ) 公司显色, 光镜观察, 阳性为棕黄色。 膜状物。培养 1 周时, 组织块外周部的部分细胞周围形 () 1. 3. 4 硫酸糖胺多糖 , 含 g lyco sam ino g lycan sGA G 成透亮的软骨陷窝结构, 可单一或成簇状分布, 对 TB量的测定 培养至 2 和 4 周时, 分别采集 3 个标本, 同 有明显的红色异染反应; 中心部完全为细胞与凝胶基 时取 3 只同月龄幼兔的骺板软骨作对照, 用滤纸吸干 质形成的简单而幼稚的结构, 对 无异染反应。随培TB 组织水分, 电子天平称量组织湿重。二甲基亚甲蓝比色 养时间延长, 细胞形成软骨陷窝结构的范围向中心部法测定硫酸 含量, 每克组织中硫酸 含量按 GA G GA G 延伸。 2 周时, 整个组织块已有软骨陷窝结构形成, 中 下列公式计算: 心部组织结构仍较为幼稚, 软骨陷窝较少而小, 外周部 ()( ) 组织块中硫酸 GA G 含量 m g的少量软骨细胞开始出现肥大 图 2 ; 对 的红色 a TB ( ) 硫酸 含量 ƒGA G m gg= ()组织湿重 g 异染反应外周部明显强于中心部。4 周时, 组织结构发 1. 4 统计学方法 () 细胞、细胞密度低而胞外基质丰富, 类似骺板软骨的生 计 学意义 < 0105, 明显低于天然关节软骨的硫酸 P ( ) 化层; 向中心部细胞变得明显肥大、密度增加, 呈不典 含量, 差异有统计学意义 < 0101; 构建的工 GA G P 型的同源细胞柱或簇排列, 类似骺板软骨的肥大层, 但 程化软骨块 4 周的硫酸 含量约为天然骺板软骨 GA G 排列不规则。整块组织对 均呈典型的强异染反应,TB 的 34141% 。 但外周类生化层较中心部为弱。 在培养过程中支架材 料逐渐降解, 4 周时在中心区域尚残留少量支架材料 3 讨论 () 图 2 。骺板损伤早闭的临床主要治疗手段为切除骨桥、 b 开放骺板缺损区并充填脂肪、骨水泥、硅胶等材料, 以 2. 3 型和 型胶原的免疫组织化学观察l ? 型胶原的免疫组织化学显示, 1 周时呈明显的 l 使上下骨区隔离, 阻止骨桥形成, 并依赖周围骺板的横 阳性, 主要分布于未形成软骨陷窝的区域; 2 周时明显 向再生能力修复缺损区。 但骺板的再生修复能力很有 6 减弱; 4 周时已基本为阴性。? 型胶原的免疫组织化学限, 超出其再生能力的大面积骺板缺损疗效较差。自 7 显示, 培养 1 周时免疫着色为弱阳性, 主要分布于有软 体骺板软骨移植虽能取得良好的临床效果, 但必然 骨陷窝形成的区域, 随培养时间的延长免疫着色增强; 造成供区新的损伤或畸形, 且组织来源极其有限, 临床 难以广泛实施。 从骺板结构和功能的特殊性及骺板早 2 周时免疫着色已很强; 4 周时外周类生发层较中心肥 ()大层的免疫着色弱 图 3。闭发生的病理机制出发, 组织工程骺板要达到临床应 2. 4 硫酸 含量用的要求, 应具备以下基本条件: 能按需要制备具有特 GA G 培养 2 周时, 构建的组织工程软骨块硫酸 GA G定大小和外形的盘状组织; 厚度为 310, 410 ; 形 mm ( )(含 量 为 8132 ? 1193 4 周 时 为 13. 33 ? 态结构完整、无孔隙, 达到阻止骨桥形成的目的; 能修 m g ƒg, ) (然 而 天 然 骺 板 软 骨 为 38. 74 ? 复骺板组织结构, 恢复其生长功能。2. 40ƒ, m g g ) 8. 97。统计学分析表明, 工程化软骨培养 4 周 ƒm g g目 前 已 有 多 种 组 织 工 程 骺 板 的 构 建 方 法。K a to a ( ) (b ) 图 2 构建的组织工程软骨组织学观察 ?2 周时组织块各部分均有软骨陷窝形成, 外周部 左少量软骨细胞出现肥大 ×100?4 周时 H E ( ) ( ) ( ) 组织块已形成类似骺板软骨的结构, 外周 上为类生发层, 中心部为类肥大层, 中心区 ?尚残留少量支架材料 甲苯胺蓝×100图 3 4 周时? ( ) ( ) 型胶原免疫组织化学染色呈强阳性, 外周 左类生发层较中心肥大部着色弱 ×200En v is ion ’ s a2 H isto log ica l observa t ion of en g in eer ied t issue a t d if f eren t culture t im e ? F ig. In th e 2nd w eek , cho nd ro gene sis ex tended to th e w ho le com p lex ( ) (b ) ×100?4 , w ith a few h yp e r t rop h ic cho nd ro cy te s in th e p e r ip h e ra l p a r t lef tH E In th e th w eek th e com p lex w a s reo rgan ized in to th e m a tu re () 2, ca r t ilage w ith th e ep ip h y sea llik e st ruc tu reth e p e r ip h e ra l p a r t upp e rre sem b led th e ge rm ina l laye r and th e cen t ra l p a r t re sem b led th e h yp e r t rop h ic ( ) () ?×100. 3 4 , laye r w ith a lit t le rem a in ing o f th e scaffo ld TB F igIn the th weekthe com plex had stron g po s it ive imm un oh istochem ica l sta in in g of ( ) (, - ? co llagen type but the germ ina ll ike layer in per iphera l par t lef thad weaker po s it ive sta in in g than the cen tra l hyper troph ic par t En v is ion ’ s ) ×200 () 1988将骺板软骨细胞通过低速离心沉降于离心管底 1 周可形成初步的软骨组织结构, 2 周后已形成 培养 部形成细胞团, 经体外培养生成软骨组织。这一方法制 典型而完整的软骨组织结构, 以后越来越多的细胞出 备 的 软 骨 为 盘 状, 培 养 4 周 最 大 体 积 为: 直 径 310, 现肥大, 这将可能导致工程化软骨在体内的再生修复 2 410 、高 2. 0, 3. 0 , 仅能满足兔等小型动物 活性下降。 因此我们认为, 体外培养 1, 2 周可能是植 mm mm 8 入体内修复骺板缺损的较佳时机。 骺板部分缺损模型修复的要求。 将骺板软骨细胞与 生物凝胶类物质复合后固化形成特定的外形, 经培养 4 参考文献 虽可生成软骨组织, 但在培养过程中组织块会出现明 4 . , , , 1 Yan W Q T o ng M H Yu L et a lR eo rgan iza t io n o f iso la ted 显收缩, 难以保持其初始的三维形态。和 L ee Jo u ve2. cho nd ro cy le s in to g row th p la telik e t issue in p e lle ted cu ltu re sJ 3 、9 等将自体骨骺软骨细胞与琼脂糖复合后立即回植 , 1995; 13: 77Bo ne M ine r R e s 入幼兔胫骨骺板缺损区, 取得了初步的修复效果, 但薄 颜炜群, 佟明华, 宇 莉, 等. 家兔肋软骨生长板软骨细胞的立体培 2 ( ) 养. 中国地方病防治杂志, 1992; 7 6: 331 层琼脂糖固化后脆而易碎, 不便操作, 且在体内有明显 , , , . L ee EH C h en F C h an J et a lT rea tm en t o f g row th a r re st by 3 的异物反应。 高孔隙率的三维网状支架材料最大的特. t ran sfe r o f cu ltu red cho nd ro cy te s in to p h y sea l defec t sJ P ed ia t r 点是能按 ( ) , 1998; 18 2: 155O r thop 需要塑形, 具有良好的组织再生模板作用, 其高孔隙率 周 强, 李起鸿, 杨 柳, 等. 骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培 4 10 ( ) 养 生成软骨组织的实验研究. 第三军医大学学报, 2002; 24 5 : 有利于组织生成过程中的物质交换。实验中采用我 5 559 们建立的种子细胞双相接种技术, 借助生物凝胶将 周 强, 李起鸿, 戴 刚, 等. 关节软骨细胞三维支架双相接种体 5 网状支架 骺板软骨细胞与三维高孔隙 C P P F PL L A ƒ( ) 外生成软骨组织的观察. 中华骨科杂志, 2002; 22 6: 372 复合, 经体外培养生成了典型的软骨, 组织结构与天然 . O ste rm an KH ea ling o f la rge su rg ica l defec t s o f th e ep ip h y sia l 6 ( ) . . , 1994; 300: 264p la teA n exp e r im en ta l studyC lin O r thop 骺板软骨相类似。 细胞外基质中富含软骨基质特异性 , , , . Inno cen t i M C e ru so M M anf r in i M et a lF ree va scu la r ized 成分 型胶原和硫酸软骨素蛋白多糖聚集体, 培养 4 ?7 2. g row th p la te t ran sfe r af te r bo ne tum o r re sec t io n in ch ild renJ 周工程化骺板软骨中硫酸 平均含量为天然骺板 GA G ( ) , 1998; 14 2: 137R eco n st r M ic ro su rg 软骨含量的 34% 以上, 且具有一定力学强度, 始终保 王 建, 杨志明, 解慧琪. 培养软骨移植修复兔生长板缺损. 中国 ( ) 修复重建外科杂志, 2001; 15 1: 53 8 持了构建工程化软骨组织的初始外形。另一方面, 该实 , , , . Jo uve JL Co t ta lo rda J M o t te t V et a lR e im p lan ta t io n o f g row th 验培养生成的组织工程骺板软骨尚不具有天然骺板软 9 : p la te cho nd ro cy te cu ltu re s in cen t ra l g row th p la te defec t sP a r t 骨的典型组织结构, 可能与体外培养缺乏其生长发育 . Su rg ica l exp e r im en ta t io n in rabb it s. J P ed ia t r O r thop B , 1998; ? 所必需的生物微环境、相关生长激素和生物因子等有 ( ) 7 2: 174 关。 但这一组织结构上的差异可能不会影响其修复体 , 2. , , F reed L E V an jak N o vo ko v ic GB iro n RJ et a lB io deg radab le . , 1994; 12 10 po lym e r scaffo ld s fo r t issue eng inee r ingB io tech no lo gy内骺板缺损的活性, 因为组织工程骺板软骨置入体内 ( ) 7: 689 缺损处后, 其组织结构在局部微环境的作用下会改建 周 强, 李起鸿, 戴 刚, 等. 组织工程骺板软骨移植修复兔胫骨11 为典型的骺板结构。 ( ) 上骺板缺损. 中国修复重建外科杂志, 2003; 17 6: 488 11 ( )收稿: 2002212209 修回: 2003212208 我们的实验结果表明, 所制备的组织工程骺板符 合临床应用的基本要求。从其组织学形态演变过程看, ?致作者? 本刊对投稿的基本要求 《中国修复重建外科杂志》自创刊以来得到广大作者的大力支持, 并取得了显著进步。为了缩短杂志的刊出周期, 特别重申作者 () 投稿时请严格按征文要求: ?来稿 含图片、表格一式二份, 图片不得使用复印件; ?附单位证明材料; ?稿件处理费 20100 元; ? () () () 附寄软盘, 以纯文本文件 . 格式或文档 . 存盘; 或邮寄稿件同时再以电子邮件方式投稿 2? : @ 163. ; tx tW o rd do cE m a ilc jr r sne t文稿中文关键词下方须标注中图分类号; ?请留联系电话备用; ?投稿后通信联络地址有变化时, 须及时与本部联系。 谢谢合作。 编辑部 2004201201