微生物浸入试验 Microsoft Word 文档

容器/密封系统完好性实验 ——微生物浸入试验 概述 微生物浸入试验是对最终灭菌容器/密封件系统完好性的挑战性试验。在验证试验中,去输液瓶,灌装入培养基,在正常生产线上压塞、压盖,经最长时间灭菌。此后,将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中,取出、培养并检查是否有微生物浸入,已确认容器密封系统的完好性。此同时,需做阳性对照试验,确认培养基的促菌生长能力。 试验步骤 1试验样品的制备 1.1在生产线上去足够量的容器,灌装SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉汤)培养基,使 用自动压塞和压盖设备将容器密封。 1.2将灌装后的容器经最长灭菌程序灭菌。 1.3从灭菌柜中取出试样,冷却,将一试样倒转,使培养基与容器内面充分接 触,在30~35℃下竖放培养14天。 1.4小心去除至少50个试样的铝盖,注意不要破坏其密封口。将去铝盖时不慎 损坏容器密封性的所有试样剔除。按1.3培养样品。 2确认培养基促菌生长能力——营养性试验 2.1所有试样培养14天均不长菌时,随机取20个戴盖试样,每个试样内接种0.1ml 的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC9027,菌液浓度: 10-100CFU/0.1ml。 2.2在30~35℃下竖放培养7天,或培养至所有试样都呈阳性结果。 2.3 若7天内,所有接种铜绿假单胞菌的试样中,微生物生长良好,则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。 使用格兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。 3挑战菌悬浮液的制备 3.1从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC9027的新斜面上取一整环 培养物,分别接入含10ml无菌培养基的试管中,在30~35℃下培养16~18h。 3.2将每管的培养物分别转入含1000ml相同培养基(SCDM/2)的容器内,于 30~35℃下培养22~24h。在培养结束时,能明显见容器内培养基出现浑浊。 3.3培养结束后的菌悬液既可用来作容器/密封系统完好性试验 4 微生物侵入操作实验步骤 本实验需在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。 4.1 将新鲜的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC9027的菌悬液倒入合适的盆中,用金属丝架固定试验容器,使试倒置在菌悬液中。 4.2 将50个经最长灭菌程序灭菌的试样倒置,并浸入菌悬液中。改组试样为A 组。 试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内表面,样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬夜中。 4.3 同时将25个去铝盒的试样容器倒置入菌悬夜中,该组试样为B组。 4.4 实验开始时取一份菌悬液,平板计数每毫升所含的活菌数。按2.3.1确认试验用微生物是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 4.5 将A组和B组试样容器在菌悬液中持续浸泡约4h. 4.6 浸泡结束时,再用平板计数菌悬液的浓度。 4.7从菌悬液中取出试样,擦干试样容器外残余的菌悬液,然后用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒容器外表面。 4.8 取装满培养基有铝盖和去铝盖的试样各两个,作阳性对照。阳性对照用样品制备方法同试样,但不经菌悬液浸泡,其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒。此后接种入10-100CFU铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC9027,按步骤2进行培养基的营养试验。 4.9 将消毒后的容器放在塑料袋中,置30-35摄氏度培养7天,操作中应特别注意不要损坏B组无铝盖试样胶塞的密封性。 4.10 挑战试验用菌悬液进灭菌后丢弃。 4.11 将挑战实验用的试样培养7天,观察检查试样容器内培养基中微生物的生长情况。 4.11.1 对每一试样进行观察检测,有生长的记+,无生长的记-。 4.11.2 如果试样容器长菌,按2.3.1方法确认生长菌是挑战微生物——铜绿假单 胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 4.11.3 如果所有容器都不长菌,则从浸过菌悬液的,A组中取10个试样,B 组中5格试样,分别按2,进行培养基的营养检测。 5 结果评价 5.1 步骤2、步骤4.8、步骤4.11.3中进行的营养试验都合格,试样的挑战试验才有效。 5.2 在挑战实验开始时,挑战用菌悬液浓度(活菌数)必须达到1*10^6CFU/ml。 5.3 挑战实验中A组和B组如有长菌,需记录长菌的试样数。在A组如出现长菌试验,则需按下述要求做进一步调查。 5.3.1 仔细去除微生物生长的容器的盖和塞,检查容器封口是否有缺损,造成微生物侵入。 5.3.2 将观察到试样容器封口的缺陷采用拍照或其他适当详细记录。 5.4 如果任何挑战实验中长菌的容器不是由于容器封口明显的物理缺损所致,容器/密封系统挑战实验做失败论处。 6 贮存稳定性 6.1 将剩余未经过挑战试验的容器放入箱中,保存在室温黑暗处。 6.2 在适当的时间间隔(如12个月,24个月,36个月等)取出一些容器,重复挑战试验。 在药品生产验证指南第一版大容量注射剂验证中,曾对本法作了介绍,与第一版不同点主要有两方面,一是简拼在菌液中浸泡的时间,前版为14天,本版为4h,但新版将样品分为A、B两个组,苛刻条件的组成部分来处理;二是新版按FDA 1994年11月对灭菌制剂注册申报材料的要求,增加了贮存稳定性考察的。企业在事实验证时,还可将部分缺陷的瓶子列入试验范围,考察瓶口缺陷与密封完好性之间的相关性,以便为指定药包材料的内控提供实验依据。