栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究

栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究 栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细 胞化学研究 孙虎山等:栉孔扇贝外套筷酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究 栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究? 孙虎山@王宜艳孙修勤@孛光友 (烟台师范学院烟台264025) (国家海洋局第一海洋研究所青岛266061) 摘要采用电镜细胞化学技术对栉孔扇贝(Chlamysfar)外套膜中的酸性磷酸酶 (ACP)和碱性磷酸酶(AKP)进行了定性定位研究.结果明,外套膜的所有上皮细胞和 结缔组织中部分血细胞呈ACP强阳性.上皮细胞中高电子密度阳性颗粒多为圆形,直径 300,450nm;内质网也呈ACP强阳性;徽绒毛等呈弱阳性.血细胞中次级溶酶体内有数 日和大小不同的ACP强阳性颗粒;内质同等内膜系统呈ACP弱阳性.外套膜的所有上 皮细胞和血细胞均呈AKP强阳性.AKP阳性颗粒常沿着细胞膜分布;内质同等内膜系 统呈AKP强阳性;上皮细胞中一种近圆形直径约250--420rim的颗粒 也呈AKP强阳性. 关键词栉孔扇贝,外套膜,酸性磷酸酶,碱性磷酸酶,电镜,细胞化学 0引言 贝类的皮肤即外套膜是有2层来源于外胚层的 上皮细胞夹着少量结缔组织组成,其上皮细胞的细 胞质膜直接与外界的水或空气接触,这些细胞本身 应具备很强的抗感染的能力.外套膜还能向外分泌 粘液形成一粘液层,对附着,接触其表面的病原菌 等具有抑制和杀伤作用,粘液层和外套膜就组成 了贝类免疫防御的第一道防线J.外套膜因能形成 珍珠而受到重视,有关外套膜形态结构,组织化学, 分泌方式,珍珠囊形成等方面已有不少研究报 道.J,但外套膜的免疫防御作用国内外未见专门 的研究报道.栉孔扇贝(rri)是我国 最重要的海水养殖贝类之一,近年来由于病害等引 起的大规模死亡,使得对其抗感染机制研究受到关 注.有关栉孔扇贝外套膜酶电镜细胞化学的研 究,国内外均未见报道.本文采用电镜细胞化学技 术对栉孔扇贝外套膜中参与免疫 防御的两种重要的水解酶酸性磷 酸酶(EC3.1.3.2;ACP)和碱性磷 酸酶(日C3.1.3.1;AKP)进行了定 性定位研究,以期为贝类的免疫 防御机制研究积累资料. 1材料与方法 1.1材料 栉孔扇贝为烟台芝罘湾内人工养殖的3龄贝, 壳长50--55mm.实验所用的口一甘油磷酸钠和二甲 肿酸钠为Sigma公司产品.其他试剂均为国产分析 纯. 1.2方法与步骤 切断栉孔扇贝的闭壳肌,去掉一片贝壳,用新鲜 海水将内脏团冲洗干净,切下一部分外套膜,在少量 0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)配制的2.5%戊二醛中 修块,外套膜的边缘膜,中央膜的不同部位各取几 块,2.5%戊二醛固定30min.电镜细胞化学显示 ACP采用Gomori法l9J,材料在2.5%戊二醛中固定 后,0.1mol/L二甲肿酸钠缓冲液洗涤1h,30?下孵 育液中孵育2h,二甲肿酸钠缓冲液洗15min,1% q后固定,酒精,丙酮脱水,Epon包埋,U1tracut E型超薄切片机切片,日立JEM一1200EX型电子 显微镜观察及摄影.加速电压60kV.显示AKP采 用金属盐法ll.材料经固定后,0.1mol/T,巴比妥钠 缓冲液洗涤1h,孵育液中孵育2h.0.1mol/L巴比妥 钠缓冲液洗15min,再放入0.05mol/L冷的Pb (N)2中处理10min,其它步骤与显示ACP的相 同.2种酶的显示均以孵育液中不加底物8一甘油 鸯翥器罨贵妻懿帏年科学家奖励基金硼贾助@联系人. ‘收稿日期:2002—1-28) 一 99— 呈强细皮更为 孙虎山等:栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究 300,450nrn;少部分阳性颗粒形状略不规则(图1 ?).颗粒的电子密度有的密有的疏,一个颗粒的电 子密度一般是较一致的,少量颗粒电子密度不均一, 从电子密度低的颗粒可以看到阳性颗粒是由许多细 微的小颗粒组成的(图1?)内质网等膜系统也呈 强阳性,内质网膜内有大量排列成行形状和大小不 同的高电子密度小颗粒(图1?).微绒毛呈ACP 弱阳性(图l?).结缔组织中的部分血细胞内次级 溶酶体呈ACP强阳性,接近圆形的次级溶酶体的直 径为600--2000rim,一个溶酶体内有的带有一到多 个高电子致密颗粒,且大小,形状和密度有较大差别 (图1?);有的内有大量较小的高电子致密颗粒(图 l?);内质网等膜系统呈ACP弱阳性(图1?). 2.2栉孔扇贝外套膜AKP电镜细胞化学定位 外套膜所有上皮组织和血细胞均呈AKP强阳 性.AKP阳性高电子密度颗粒常沿着细胞膜分布, 上皮细胞更为明显(图l?);内质网,小泡体等膜系 统呈AKP强阳性(图1??);上皮细胞中一种近圆 形直径约250,420nm的颗粒也呈AKP强阳性,颗 粒形状略不规则,电子密度有密有疏,多数颗粒电子 密度均一,少数颗粒电子密度不均一(图1?). 3讨论 3.1ACP和AKP细胞化学定位 本文用电镜细胞化学技术显示栉孔扇贝外套膜 中的ACP,上皮细胞胞质中呈ACP强阳性的圆形 颗粒直径为300,450nm与孙虎山等一在栉孔扇 贝血细胞中见到的ACP阳性颗粒直径200,400 rim大小相近,但不同的是大部分阳性颗粒的电子 密度较高且较均一.结缔组织中的部分血细胞内呈 ACP强阳性直径为600,2000nm的大颗粒为次级 溶酶体.ACP为溶酶体的标志酶,主要存在于溶酶 体内,本实验结果符合此理论.直径为300,450nm 相对较小的阳性颗粒应为初级溶酶体.溶酶体内的 水解酶包括ACP是在糙面内质网上合成的,经小泡 的转运并经高尔基复合体,最终到滑面内质网形成 初级溶酶体,这些与溶酶体形成有关的细胞器也呈 ACP阳性J,我们观察到内质网,小泡呈ACP阳性 与上述观点一致,同时上皮细胞内质网等膜系统呈 ACP强阳性该类细胞中ACP的合成,加工等 非常活跃,这对于向外分泌并发挥作用的上皮细胞 来说是非常重要的. Gomori认为AKP在动物的多数组织细胞中仅 局限在质膜上,但在某些细胞中,也见于小泡体,高 尔基复合体及线粒体上.本文显示扇贝外套膜 细胞AKP也定位于质膜,小泡体也呈阳眭与其一 致.本文显示上皮细胞中一种近圆形直径约250, 420nm的颗粒也呈AKP强阳性,按其大小应为初 级溶酶体,其功能作用有待深入研究. 3.2外套膜内的ACP和AKP在防御中的作用 由于贝类体内没有产生抗体的结构,因此细胞 吞噬作用在贝类防御机制中就具有极为重要的意 义[】.异物被吞入细胞后就与溶酶体融合,最终被 各种水解酶包括ACP消化分解,水解酶在清除异物 方面起重要的作用本文也观察到了处于消化 降解阶段的次级溶酶体.栉孔扇贝等水生贝类的外 套膜上皮细胞的质膜直接与外界接触,这些上皮细 胞本身必须具备很强的抗病原菌感染的能力.本文 研究表明ACP和AKP分布于栉孔扇贝外套膜所有 上皮细胞中,且含量较高,说明栉孔扇贝外套膜也可 利用该2种水解酶发挥免疫防御作用,成为栉孔扇 贝抗感染的第一道屏障.孙虎山等生化测定表 明栉孔扇贝血细胞中的ACP和AKP活性均低于血 清中的酶活性;Jyothirmayi等在测定淡水螺 Lym??luteola各种组织中的ACP和AKP活性 时发现,消化腺和外套膜内的该两种酶活性比其血 淋巴中酶活性高许多倍.血清中的ACP和AKP是 否部分来自其它组织细胞如外套膜等,即外套膜上 皮细胞内的ACP和AKP是否会释放到其血淋巴 中,在体内发挥作用,有待于进一步的实验证实. 参考文献: [1]石安静,陈继群,文秀英水生生物,1994.18 (4):369 [2]孙虎山,王晓安.烟台师范学院(自).1999.15 (2):125 [3,石安静,曾家玉水产,1991,15(1):68 [4石安静,张兵.水生生物.1987,11(3):236 [5]石安静水产,1985,9(3):247 [6]孙虎山.李光友.高技术通讯200111(5):10 [7]孙虎山.李光友.海洋与湖懵.200031(3):259 18]孙虎山,李光友.中国水产科学,1999,6(2):9 [9]GomoriG.Micr~copichistochemistry.Principlesand practiceChicago=ChicagoUniversityPress.1952.189 [10]PipeRKHistochemJ,1990,22:595 [11]孙虎山,李光友中国水产科学.1999.6(4):6 [12]孙虎山,李光友高技术通讯,2001,11(4):16 【l3JChengTC.J似ebrPathol,1992,59:197 【14JJyothirmayiGNa1.JlnvertebrPatho1.1988,52:373 一 l01— 高技术通讯2002.05 TheElectronMicroscopicCytochemistryStudyofAcidPhosphataseand AlkalinePhosphataseintheMantleofScallopChlamysFarreri SunHushan,WangYiyan,SunXiuqin,LiGuangyou (YantaiNormalUniversity,Yantai264025) (TheFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao266061) Ahstract TheacidphosphataseandalkalinephosphataseinthemantleofscallopChlara ys|drreriwerestudiedbycy tochemicallocalisationwithelectronmicroscope.Alloftheepithelialceilsandapartofhaemocytesinthe0012一 nectivetissueofthemantlepresentstrongACPpositivity.Mostofthepositivegranuleswithhighelectronden— sityintheepithelialcellsareroundandthediameterare300——450nm.Thee ndoplasmicreticulumintheepithe— lialcellspresefitstrongACPpositivitytOO.Themicmvilliareweaklypositive0fACP.Therearedifferenthum— berandsizedstrongACPpositivegranulesinthesecondarylysosomesofthehaemoeytes.Theendoplasmicretic uluminthehaemocytesareweaklypositive0fACP.Alloftheepithelialcellsandhaemocytesintheconnective tissueofthemantlepresentstrongAKPpositivity.TheAKParelocatedonplasmamembrane,alongwhichdis— tributegranulesofhighelectrondensityscatteringly.TheendoplasmicreticulurnpresentstrongAKPpositivity. AkindsofstrongAKPpositivegranulesapproximateroundinthecytoplasmoftheepithelialcellsareabout250 —— 420nmindiameter. Keywords:Chlamysrreri,Scallop,Mantle,Acidphosphatase,Alkalinephosphatase,Electronmicro soope,Cytochemistry —— 102—— ————————————————_i_—霭蘸_i戛iii蚕习鞫蠹目圈臣甄I磊jII]I_