大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性的研究（可编辑）

大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性的研究（可编辑） 单位代码: 分类号: 窆圣鱼 学 号: 密级: 公珏 大豆异黄酮及其代谢产物体外 抗氧化活性研究 学位申请人:梁晓琳 指导教师:王秀伶教授 学科专业:微生物与生化药学 学位类别:理学硕士 授予单位:河北农业大学 答辩日期:二。一一年六月四日独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得塑皇垦盔些盘堂 或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签字目期: 年 月 日 学位论文作者签名: 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定, 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库进 行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编: 摘要 大豆异黄酮主要由黄豆苷原和染料木素组成,是多酚类化合物, 在豆科植物如 黄豆中含量较高。摄入动物体内的大豆异黄酮,在胃肠道微生物作用下被降解为二 氢黄豆苷原,简称、雌马酚、去氧甲基安哥拉紫檀素 ,简称和二氢染料木素,简称 等不同代谢产物。 大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、降低心血管病发生率等多种生物学活性,这些 生物学活性均被认为与氧化应激有关。氧化应激在慢性炎症疾病的发病机理中有重 要作用。活性氧过多如超氧阴离子、过氧化氢,会对造成损伤而使细胞凋亡。 因此,精确测定异黄酮及其代谢产物的抗氧化活性可为构效关系研究和药物研发提 供理论指导。 虽然黄豆苷原、染料木素和一些化学合成的大豆异黄酮代谢产物的抗氧化活性 已有报道,但不同研究者报道结果相差较大。本研究的目的是明确影响羟基自由基、 超氧阴离子和二苯代苦味酰基自由基准确测定的主要因素。在羟基自由 基试验中,首次发现极低浓度.%,/的有机溶剂具有较强的羟基自 由基清除 能力,其中甲醇与乙醇的清除能力相似,均高于丙酮,而相同浓度的乙腈则未 到清除羟基自由基活性。羟基自由基反应体系不稳定,加之大豆异黄酮及其代谢产 物水溶性差,因此,羟基自由基清除能力不适合作为该类化合物抗氧化活性测定指 标。首次发现甲醇、乙醇和丙酮在.%/浓度下仍具有较强的超氧阴离子自 由基清除作用,而乙腈在浓度高达.%/时仍未检测到清除作用。超氧阴离 .,不适于酸性化合 子自由基虽反应灵敏度高,但因其体系本身过于碱性 物自由基清除测定,方法具有一定局限性。自由基稳定,反应体系稳定,本 研究首次将传统的检测时间延长至,大大提高了检测灵敏度,可准确测 定大豆异黄酮及其代谢产物的体外清除能力,为异黄酮及其代谢产物抗氧化 活性测定的首选方法。在清除试验中,全部种供试浓度中雌马酚抗氧化活 性均最高,染料木素均高于黄豆苷原。当反应液中底物浓度高 于./时, 全部四种大豆异黄酮代谢产物对清除率均高于大豆异黄酮本身。 关键词:大豆异黄酮;自由基;抗氧化;有机溶剂/ / :: : , . ,, ,, ., 。. . . , . ,.,. , , . , ,?。? . .%/ . . . . ., . ,, , ?.%/, .%/. ., ?. .. .. ., ./, , ,.. : , ,目 录 第一章引言??。 .大豆异黄酮及其代谢产物的生理功能?.. ..大豆异黄酮结构及生理功能? ..大豆异黄酮在体内的吸收与代谢..大豆异黄酮代谢产物的生 理功能.自由基?. ..自由基与自由基学说.. ..机体内自由基的来源? ..自由基对健康的影响.. ..大豆异黄酮与自由基? .黄酮类化合物结构与抗氧化活性的关系. 第二章大豆异黄酮及其代谢产物清除羟基自由基活性研究。 .材料. ..药品和试剂..主要实验仪器与设备。 .试验方法?. ..大豆异黄酮代谢产物的分离与制备。 ..羟基自由基的产生与清除..统计分析??一 .结果与分析。 ..大豆异黄酮代谢产物的分离与制备。 ..不同有机溶剂对羟基自由基清除能力比较? ..大豆异黄酮及其代谢产物对羟基自由基的清除活性.讨论??.. 第三章大豆异黄酮及其代谢产物清除超氧阴离子活性研究 .材料??.. ..药品和试剂? ..主要实验仪器与设备 .试验方法? ..邻苯三酚.鲁米诺.碳酸盐缓冲液 .勺 ..超氧阴离子的产生与清除?.. ..统计分析.结果与分析 ..不同有机溶剂对超氧阴离子清除活性比较. ..大豆异黄酮及其代谢产物对超氧阴离子的清除活性.讨论??.. 第四章大豆异黄酮及其代谢产物清除自由基活性研究.材料??. ..药品和试剂?。 ..主要实验仪器与设备 .试验方法。 .. 自由基清除能力测定方法?. ..统计分析.结果与分析 .. 反应体系的稳定性?. ..大豆异黄酮及其代谢产物清除自由基活性 ..超氧阴离子和体系清除自由基灵敏性比较 .讨论??. 砉论??.: 参考文献. 在读期间发表的学术论文??. 作者简历. 谢?..大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 第一章引言 .大豆异黄酮及其代谢产物的生理功能 ..大豆异黄酮结构及生理功能 大豆异黄酮主要是指以.苯并吡喃酮为母核的化合物,是大豆生 长过程中形成的次生代谢 产物。目前已知的大豆异黄酮共有种异构体,包括种异黄酮葡萄 糖苷和种相应的糖苷配 基,糖苷形式的大豆异黄酮只有经水解作用形成苷原形式才能发 挥多种生物学作用。游离苷原 的化学结构见图.。 图.大豆异黄酮苷原的化学结构 .. 图.中,当,时,称为黄豆苷原:当,时,称为染料木素;当,时,称为黄豆黄素. 大豆是一种重要的农作物,大豆及其加工产品不仅是人类植物性蛋白食品的主要来源,更 是家畜的首要蛋白质饲料来源。大豆中含有许多有益的生物活性物质,如大豆磷脂、大豆低聚 糖、大豆皂苷和大豆异黄酮等,在这些生物活性物质中,大豆异黄酮因具有明显的生物学活性 而备受关注。 大豆异黄酮的化学结构与哺乳动物雌激素.雌二醇相似,对机体具有类雌激素和抗雌激 素活性的双重调节作用。 抗癌作用。作为植物雌激素的大豆异黄酮通过与雌激素受体作用,能抑制乳腺的增生 与分化,达到预防乳腺癌发生的目的【】。大豆异黄酮不仅不会刺激子宫内膜细胞的增生,还能 抑制雌激素对乳房和子宫内膜细胞增生的刺激作用【】。大豆异黄酮对初期的良性前列腺肥大、 可能发生癌变的前列腺疾病或早期的前列腺癌有抑制和治疗作用【】,并能有效抑制源于前列腺 的副性腺癌细胞的生长和转移。 缓解更年期后的骨质疏松。大豆异黄酮既可刺激骨的形成,也可 抑制骨质的再吸收引, 以保持骨质形成和再吸收之间的平衡。雌激素分泌水平降低容易造成骨质流失,及时补充大豆 异黄酮,可有效预防骨质疏松的发生】。 预防心血管疾病。大豆异黄酮通过调节脂蛋白代谢、阻止低密度脂蛋白氧化、减 少血管平滑肌细胞的增殖和迁移、降低血小板凝聚和改善血管反应性等方式达到降低总胆固醇 和低密度脂蛋白的目的,因而对心血管系统有积极的保护作用睁?。 抗氧化作用。大豆异黄酮具有较强的抗氧化作用,能清除人体内的活性氧自由基,保河北农业大学硕士学位毕业论文 护人体内脂质、蛋白质、染色体免受活性氧的攻击,减少脂质过氧化物的产生,因而可以防止 细胞发生病变,延缓人体组织老化,产生抗机体衰老作用】。孙克杰等【】研究了大豆异黄酮 在不同体系中对过氧化物的抑制作用,结果表明,是一种良好的活性氧自由基清除剂,其 浓度在击/时即可达到%抑制率。 大豆异黄酮具有抑制过氧化物生成的作用,是有效的过氧化氢清除剂。等研究发现: 大豆异黄酮可明显抑制致癌剂..十四烷酰佛波醇..乙酯诱导的 中性多核白细胞 及细胞的过氧化氢的生成,其抑制作用在浓度~ /范围内呈剂量.效应 关系,它对促癌剂诱导的肿瘤细胞产生的过氧化氢也有明显的抑制作用‘】。等【 证明大豆异黄酮既能在体内又能在体外明显抑制佛波醇酯等肿瘤促进剂诱导的形成。 大豆异黄酮的抗氧化作用还表现在可减少活性氧自由基对的损伤上。.羟基.’.脱氧 鸟苷.是中鸟嘌呤被细胞有氧代谢过程中形成的某些活性氧攻击而产生的一种修 饰碱基,即氧化应激损伤的标志分子,大豆异黄酮可以有效抑制的产生,因此 它能预防的氧化损伤。等【 】用紫外线照射或以反应系统激发牛 胸腺产生大量的,如在反应系统中加入大豆异黄酮,则的产生明显减少, 其分别为. / 和 /反应。使用碱性的单细胞凝胶电泳,观 察到处理后的链断裂水平明显增加,应用生理浓度的雌马酚可明显降低这种损伤, 】 它们的保护作用高于公认的抗氧化剂、小生育酚、雌二醇和他莫昔芬等【】。等【 每天给予名男性 、名女性 的大豆异黄酮,周后测得血样中氧化损伤的标记 物.羟甲基’.脱氧尿苷..显减少。这些结果表明,在饮食中补充大豆异黄酮能减 】。 少内源性氧化损伤,可能有助于防癌【 大豆异黄酮的其它生理功能:作为甜葡萄糖苷酶抑制剂,能有效改善代谢紊甜】、提 高记忆力【、减轻脑萎缩‘、提高加压素由神经分泌的九肽激素水平、抗利尿【】、抗衰老、 抗辐射等,目前已在化妆品行业得到了应用。此外,还能减轻斑形脱发的易感性【,能改变脑 的形态学参数和生殖内分泌参数,并使视网膜增厚【,抗菌消炎及提高机体免疫力【】等。 ..大豆异黄酮在体内的吸收与代谢 大豆异黄酮在人体中的吸收主要通过两种途径:一是脂溶性的苷原型黄酮可从小肠直接吸 收;二是食物中大部分以糖苷形式存在的异黄酮不能通过小肠,而要经由葡萄糖苷酶水解,生 成的产物进一步被细胞降解,生成的大豆异黄酮苷原,大约%受微 生物作用开环形成去氧甲 基安哥拉紫檀素,简称;大约%被微生物还原为二氢黄酮苷 原,,最后形成稳定的雌马酚被胃肠黏膜吸收阱】。黄豆苷原在体 内的代谢途径如图.所示。染料木素代谢产生对乙基苯酚和’.羟苯基.丙酸 娜。未被肠道细菌分解的糖苷型异黄酮不易被吸收,直接从肠道排出体外。 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 图.大豆异黄酮黄豆苷原代谢途径 ....大豆异黄酮代谢产物的生理功能 最新研究表明大豆异黄酮代谢产物具有比大豆异黄酮更高更广的生物学活性。近年来有关 大豆异黄酮黄豆苷原代谢产物生物学功能方面也陆见报道。是保持血管活性的成分 之一,由于它与.雌二醇的结构相似,从而能有效的抑制血管收缩,防止内皮组织受伤害?到。 】分别分析比较了黄豆苷原及化学合成的黄豆苷原不同代 此外,.等【、等【 谢产物对心脑血管的保护作用,研究结果均表明对心脑血管的保护作用远高于其亲本化 合物黄豆苷原。 目前已知的大豆异黄酮所有代谢产物中,雌马酚被认为是生理活 性最高的成分,其抗氧化活 性要比亲本化合物黄豆苷原高出多倍【。并且它具有很强的雌激素样活性【,它的雌激素样 作用发现较早。与其前体物质黄豆苷原不同,它是手性分子,有和两种异构体,体内代谢产物 均为.型,人工合成的雌马酚则为二者混合物,即消旋体雌马酚。这两种异构体与雌激素受体 、的亲和力有所不同。.型与琊的亲和力较强;型与的亲和力较弱,与琊的亲和 力更弱,但两种异构体与雌激素受体的亲和力均高于黄豆苷原。尿液中的雌马酚浓度与性激素结 合球蛋白性激素结合球蛋兰 ,的浓度成正比岬】,性激素与球蛋 白的结合具有调节血浆性激素的生物学作用,合成增加可降低游离的、有活性的性激素浓 度,故可减弱雌激素的促细胞增殖活性,从而减少性激素相关癌症发病危险。此外,雌马酚在预 防骨质疏松【、抗心血管疾病、抗肿瘤【】等方面的作用也普遍受到关注。 除雌马酚外,黄豆苷原的另一代谢终产物为去氧甲基安哥拉紫檀素.。早期研究表明, 抑制类固醇激素代谢中的一些酶,例如:芳香酶、还原酶、羟基类 固醇脱氢酶【。?枷。 ’引, 最近试验结果表明,.不仅与人体雌激素受体和的亲和力高于其前体黄豆苷原 河北农业大学硕士学位毕业论文 与琊结合后,在诱导基因转录上.也强于黄豆苷原。此外,当浓度高于 /,. 能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长【】。年日本学者比较与雌马酚在体内外 对切除子宫小鼠的骨密度及脂类代谢的影响,发现与雌马酚一样,均能促进脂类物质的正 常代谢,但在体外破骨细胞生长方面,贝表现轻微抑制作用;。另外,.对小鼠淋 巴瘤细胞中小核诱导物的形成具有比更好的抑制作用。 .自由基 ..自由基与自由基学说 自由基是指能够独立存在,含有一个或多个未成对电子的分子或分子的一部分。由于自由 基中含有未成对电子,具有配对倾向,因此大多数自由基都很活泼,具有高度的化学活性。自 ,厶, 由基种类较多,一般可归纳为下列几类:超氧化物自由基跚 是人体中最先产生也是最多的一种自由基,这种形态的自由基能诱发其它种类的自由基。 过氧化氢 ?,由超氧化物自由基代谢后产生,也有可能是由身体其它吞噬细 胞经氧化还原作用而产生,过氧化氢的稳定性比其它的自由基都强,但会通过细胞膜流窜于身 ,是破坏力最强的自由基, 体的各部位,而扩大伤害的范围。羟基自由基 羟基自由基是由于过氧化氢代谢以及各式辐射线所产生,羟基自由基会攻击细胞膜造成细胞死 , 亡,也会攻击机体内的不饱和脂肪酸,造成油脂的过氧化而劣变。单线态氧 单线态氧的活性比氧气高,更容易破坏细胞。过氧化脂质 灿,是自由基破 坏脂质后的产物,但此物质对细胞具有毒性,可以当作细胞氧化后受伤害的指标。 衰老是人体各器官功能开始逐步降低的一种生理现象,是一个缓慢的渐进过程,是一种不 可避免的自然规律。关于衰老的理论有几种假说,如自由基学说、神经内分泌学说等。其中, 自由基学说是目前解释衰老的重要学说之一,也是研究的热点【。 衰老的自由基学说由锄 在年提出,认为机体正常代谢过程中产生的自由基对机体的破坏作用导致衰老。 其一,自由基作用于脂质,发生过氧化反应。反应产物丙二醛等引起蛋白质、核酸等生命大分 子发生交联聚合。其二,自由基使器官组织的细胞受到破坏。自由基引起脂质过氧化从而使细 胞膜和细胞器膜受到损害,引起老年人记忆力下降、反应迟钝及智力障碍等,可能成为诱发组 织器官老化的重要因素之一引。因此,自由基反应与衰老过程密切相关,是引起衰老的原因之 一。自由基清除剂可防止自由基对人体组织细胞的损害,对抗衰老有重要作用。 ..机体内自由基的来源 机体在代谢中会不断产生自由基,在酶催化的电子转移及氧化还原反应中,有许多自由基 中间体参与。?包括一个质子和一个不对称电子,是最简单的自由基。自由基的链反应通常是 从其他分子中转移?而启动的。生物体的自由基可以通过以下几种方式产生: 生物体内代谢过程 正常的机体代谢过程中,主要的内源性活性氧来源于:需氧代谢 时线粒体呼吸链消耗 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 氧的产物。过氧化物酶体的过氧化氢产物。?活化的吞噬细胞“呼吸爆发”时产生。?细 胞色素酶的诱导。 放射线照射 机体暴露于自然界中,受宇宙射线及人为电磁辐射,使机体受到损害,产生少量的自由基。 更为重要的是,生物体内含有大量的水,放射线首先使水分解,产生反应性非常高的自由基如? 和?等,进而引发自由基链式反应。 机体周围自由基前身物的转变 环境中有各种各样的自由基及产生自由基的多种物质,如及自由基;大气中的臭 氧也可能转变成过氧化物自由基;食物中的某些成份长期暴露于空气中易氧化,自由基含量增 大;机体在代谢过程中摄入过氧化物、激素等也容易产生自由基。 ..自由基对健康的影响 适量的自由基与氧分子维持着巧妙的生理平衡,使人类各项生理系统运作良好。自由基是机 体有效的防御系统,它可以杀灭细菌、病毒等;当自由基产生过多或者清除过慢时,它通过氧化 攻击生命大分子物质,使身体的细胞、组织器官受损,加速身体的衰老过程,并诱发各种疾病。 如炎症、心脏病‘、休克、中毒、肿瘤四、糖尿病】、突变、帕金森病、阿尔兹海默症、肺疾、 眼疾等?。 ..大豆异黄酮与自由基 异黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化能力,作用机理在于它阻止了自由基在体内产生 的个阶段:即与超氧阴离子反应,阻止自由基引发;与金属离子螯合,阻止羟自由基生成; 与脂质过氧化物反应,阻止脂质过氧化过程。化学结构决定化学性质,不同结构的异黄酮其生 理活性各不相同。它们的活性是由结构中所含羟基个数及所在骨架中的位置决定的,因为酚羟 基作为供氧体能与自由基反应使之生成相应的离子或分子淬灭自由基,终止自由基的链锁反应, 使之表现为抗氧化活性。 .黄酮类化合物结构与抗氧化活性的关系 抗氧化剂有两大类:第一类为预防性抗氧化剂,这一类抗氧化剂可以清除链引发阶段的自 由基;第二类抗氧化剂是断链型抗氧化剂,可以捕捉自由基反应链中的过氧自由基,阻止或延 缓自由基链反应的进行。研究表明:黄酮类化合物在抗氧化反应中不仅能清除链引发阶段的自 由基,而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基,阻断自由基链反应,起到预防和断链的双 重作用旧。 黄酮类化合物抗氧化的作用机制是通过酚羟基与自由基反应生成共振稳定的半醌式自由基 结构,从而终止自由基链式反应,其反应式可表达为【舒】:】 河北农业大学硕士学位毕业论文 影响黄酮类化合物抗氧化作用强弱有以下几个因素: .酚羟基的位置及个数: 酚羟基在黄酮类化合物清除自由基时起到供氢和稳定自由基中间体的作用,并可以与金属 离子络和,因此酚羟基对自由基的清除作用十分重要。黄酮类各环上的羟基活性相差较大, 环的’旬,是决定抗氧化性强弱的第一位因素,增加.’.和.’.两个基团可加强其 氧化活性;当环上羟基和不饱和双键相连时,环也具有较强的抗氧化活性【;环也经常 被羟基化,部位多发生在、位上,形成间酚结构。位羟基有较强的酸性,利于抗氧活性, 它的抗氧化活性较小,一般认为它们属于增效作用的酚羟基 【‘不。 .环、位双键是否饱和 异黄酮的不同之处在于母核上的苯环环不是接在.位上而是接在.位上,对环、 位双键的作用说法不一。有人认为环、双键虽有利于环失电子后自旋形成更稳定的 酚基自由基,但其对化合物抗氧化性的影响效果无异于环、单键,它的有无与抗氧化性 无关。等的实验结果表明,抗氧活性不依赖于.和.间的双键。例如黄芹素的自 由基清除率为%,氢化后的柑橘素为%。但大多数人认为双键氢化后,缩短了共轭体系, 改变了分子的平面结构,降低了位羟基的作用,不利于抗氧化。从一些实验结果看,双键氢 化一般导致活性的下降,但下降的幅度差别不大眇。 .环位羰基的作用 环位羰基是吸电子基,它的吸电子性质钝化了环酚羟基作用,使其更不活泼,如果 环的位上是羟基时,那么位羟基和位羰基可以螯合金属离子。环对环活性影响不 大,但环对环钝化作用起了稳定结构的作用,使自由基稳定。 .糖基取代基位置的作用 糖基取代的位置不同带来不同的空间效应,影响到黄酮自由基中间体的稳定性,导致其抗 氧活性的显著差异。一般位氧苷,,位碳苷对活性不利。 本研究用实验室特定菌株通过生物转化制备不同的大豆异黄酮代谢产物,拟从三种自由基 清除试验中,明确影响自由基清除率的关键因素;通过比较大豆异黄酮及其代谢产物清除自由 基的能力,确立适于异黄酮类化合物清除自由基的最佳方法;为该类化合物构效关系和体内活 性研究提供理论指导。 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 第二章大豆异黄酮及其代谢产物清除羟基自由基活性研究 羟基自由基有强氧化性,可以使一些化合物结构、性质和颜色发生改变,进而改变待测液 的光谱吸收,根据这一原理可以利用比色法进行羟基自由基的间接测定。目前,应用于羟基自 由基测定的反应底物主要有:水杨耐、铁氧化邻二氮菲法、脱氧核科、亚甲兰【、 溴邻苯酏:】、茜素紫‘剐、.邻菲咯啉络合物‘、【删。 试剂是年由..发现,并应用于苹果酸的氧化,其实质是二价铁 离子和之间的链式反应催化生成?,使苹果酸及其它有机物最终氧化为和 。反应方程式如下:一? 本实验用脱氧核糖法检测大豆异黄酮及其代谢产物清除羟自由 基的活性。 .材料 ..药品和试剂 黄豆苷原、染料木素、大豆苷和染料木苷美国公司 、、和利用微生物转化的方法制备,纯度达%均由实验室保藏 的菌株转化得到 甲醇、乙醇、丙酮、乙腈都是色谱纯 洳脱氧核糖、硫酸亚铁、三氯乙酸、硫代巴比妥酸均为分析纯 试验用水为双蒸水 ..主要实验仪器与设备 高压灭菌锅:.,日本公司 型,英国公司 厌氧工作站: 电子天平:,美国公司 离心机:,德国公司 高效液相色谱:型检测器,型高效液相高压输液泵,美国公司 超声波清洗器: ,上海科导超声仪器有限公司 溶剂过滤器:。天津奥特赛恩斯仪器有限公司 磁力搅拌器:.,天津奥特赛恩斯仪器有限公司 电热恒温培养箱:,天津市泰斯特仪器有限公司 公司 离心浓缩仪:.瓜,韩国 旋转蒸发仪:.,上海亚荣生化仪器厂 恒温水浴锅:肌,天津市华北实验仪器有限公司 .可见.紫外分光光度计美国公司 河北农业大学硕士学位毕业论文 移液管、移液枪及其它辅助设备; .试验方法 ..大豆异黄酮代谢产物的分离与制备 根据实验室以前的制备方法【.】,将大豆异黄酮转化菌株接种于三角瓶中装有 新鲜培养基在厌氧条件下培养.,然后将黄豆苷原、染料木素加入到培养基 中使其终浓度为./。继续在厌氧条件下培养天。待底物最大程度被转化后,用等 量乙酸乙酯萃取发酵液三次,蒸干后用甲醇溶解,并过.有机膜,利用进行分离 纯化,采用半制备色谱柱 ,,收集代谢产物峰,用旋转蒸发仪 和离心浓缩仪将其蒸干,冰箱中保存待用。 ..羟基自由基的产生与清除 利用芬顿反应体系产生?,分析对.脱氧核糖分子的氧化及破坏情 况,确定 异黄酮的存在是否对?具有清除能力,保护叶脱氧核糖分子不被氧化破坏【跚。整个过程 可以表示为: 一脱氧核糖?氧化产物如丙二醛等 氧化产物?有色化合物一比色分析 操作为:取.的.混和液/于具塞试管中,加入.的 洳脱氧核糖/,然后加入.不同浓度的异黄酮溶液,用磷酸盐缓冲液.定容 到.,最后加入.的/,混匀后于水浴中保温,然后加入质 量分数.%三氯乙酸溶液.,质量分数.%硫代巴比妥酸溶液., 混匀后于沸水浴加热冷水冷却后,在分光光度计处以蒸馏水为参比,测其吸光 度舢。 不加异黄酮溶液,以蒸馏水代替,同上操作处理,测定其对比吸光度。 不加异黄酮溶液且不加,以蒸馏水代替,其他处理同上,测定空白吸光度。 ,可表示为: 样品提取物的自由基清除能力 % %户心/ ..统计分析 所有试验至少重复三次,数据用均值的误表示,统计分析用来比较。 显著性以.表示。 .结果与分析 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 ..大豆异黄酮代谢产物的分离与制备 大豆异黄酮被吸收后,在胃肠道微生物的作用下降解为不同的代谢产物。本研究中四种异 黄酮代谢产物、、和是用本实验室特定的异黄酮转化菌株通过微生物 转化得到。从培养基中萃取不同的代谢产物用分离纯化如图.所示。 ‘《.卜“焉碍?口《 . .? .?.?.?.?. . .?. . . . .?. 图不同大豆异黄酮转化菌株转化黄豆苷原和染料木素的高效液相色谱圈?租孙....不同有机溶剂对羟基自由基清除能力比较 在羟基自由基清除试验中,首次发现用来溶解样品的有机溶剂在很低浓度时就有很强的清 除活性结果如图.所示。浓度为.%/的甲醇、乙醇对羟基自由基清除率分别为.% 和.%,相同浓度下丙酮的清除率为.%。相反,乙腈的浓度增至%/ 时仍没有检测 到羟自由基清除活性。不同有机溶剂清除羟自由基的公式如下: . .,赂.甲醇 ..,《毫吣.乙醇 ..,.丙酮 河北农业大学硕士学位毕业论文 加 ??? 苓 ? ? 柏 ? 留舞.瞰昌一皇?食? . . . % 图.不同有机溶剂清除羟基自由基的活性.. ..大豆异黄酮及其代谢产物对羟基自由基的清除活性 先用少量的乙腈溶解药品再用双蒸水稀释到待测浓度,来测定大 豆异黄酮及其代谢产物对 羟基自由基的清除率。如图.所示,供试浓度下,游离的黄豆苷原、 染料木素以及结合型糖 苷大豆苷和染料木苷间均无显著性差异。大豆异黄酮代谢产物在不同浓度下对羟基自由基清除 能力不同。当浓度为.、.和.时,各不同代谢产物在清除羟基自由基能力 上无明显差异;而当浓度为.时,或.和、的清除率有显著性 差异,而.和间则无显著性差异。 兮 写一?昌嚣昌? . . . . . . . 曲? 图.大豆异黄酮糖苷和苷原清除羟自由基活性 ..大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 苓 茛篮咖一咖皇?爵? . . . . . . . . 图.大豆异黄酮不同的代谢产物清除羟基自由基活性.. .讨论 大豆异黄酮及其代谢产物清除羟基自由基方法中的羟基自由基由反应产生,体系本 身稳定性较差。本研究中,大豆异黄酮及其代谢产物在不同浓度下具有相似的清除能力,这与 构效关系理论不符。相比较而言,较低浓度的有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮却表现出明显的 羟基自由基清除活性,而同样浓度下乙腈则没有清除活性,但乙腈在高浓度下仍具有清除羟基 自由基的能力,而且这种由有机溶剂本身引起的羟基自由基高清除能力很可能掩盖了待测样品 本身的清除作用。一些有机溶剂如甲醇、乙醇和等曾被报道有清除羟基自由基能力?州?, 但有关在极低浓度下.%.%甲醇、乙醇、丙酮及高浓度乙腈的清除羟基自由基能力尚属 首次报道。异黄酮类化合物水溶性较差,溶解时必须借助有机溶剂,而在较高浓度下%, 全部常用有机溶剂均具一定的羟基自由基清除能力。据报道大豆异黄酮代谢产物雌马酚的抗氧 化活性比其亲本化合物黄豆苷原高出多倍【】。然而,本研究中,在清除羟基自由基能力上 雌马酚并不高。因此,我们认为反应体系可能不适合大豆异黄酮及其代谢产物等水溶性 差的化合物的清除羟基自由基能力测定。河北农业大学硕士学位毕业论文 第三章大豆异黄酮及其代谢产物清除超氧阴离子活性研究 测定超氧阴离子的体系有多种,如邻苯三酚、黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶、核黄素等。本试验 采用化学发光法测定邻苯三酚体系产生的超氧阴离子。邻苯三酚在碱性条件下不稳定,自氧化 产生超氧阴离子,超氧阴离子与化学发光剂鲁米诺反应使之氧化,产生一个电子激发态的中间 体,退激时发光。加入待测物如果具有清除超氧阴离子能力,则可使发光强度降低,因而,超 氧阴离子可用化学发光仪检测。 .材料 ..药品和试剂 黄豆苷原和染料木素美国公司 、、和利用微生物转化的方法制备,纯度达%均由实验室保藏 的菌株转化得到。 .氨基邻苯二甲酰肼鲁米诺,公司 邻苯三酚、碳酸钠碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠均为分析纯。 甲醇、乙醇、丙酮和乙腈购自美国 公司 ..主要实验仪器与设备 电子天平:,美国公司 .超微弱化学发光分析仪中科院生物物理所测试条件: ;记录的 波长范围: ;温度:? ,公司 酸度计: 移液枪及其它辅助设备; .试验方法 ..邻苯三酚.鲁米诺.碳酸盐缓冲液 .的配韦 ,加 .水溶液溶解,定 ?邻苯三酚溶液:邻苯三酚加入. 容至 ,保存,临用前以蒸馏水稀释倍: . ?碳酸盐缓冲液 .:. ?碳酸钠水溶液 混合,加入 溶 .即可; 解,调至 ◎鲁米诺溶液:.鲁米诺加入. ?碳酸钠水溶液定容至,保存。临 用前与碳酸缓冲液 .以:混匀。 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 ..超氧阴离子的产生与清除 邻苯三酚在碱性条件下不稳定,自氧化产生超氧阴离子,超氧阴 离子与化学发光剂鲁米诺 反应使之氧化,产生一个电子激发态的中间体,退激时发光。抗氧 化剂可以清除超氧阴离子, 因此可以减少激发态鲁米诺的产生,所以发光强度降低。超氧阴离子的产生和清除依照 等的方法。操作步骤为:在发光杯中加入此样品溶液以相同量的乙腈作空白对照 内 和此邻苯三酚溶液,再加入儿鲁米诺.碳酸盐缓冲液混合溶液启动反应,记录 ,。根据大小可以判断物质清除自由基的能力。自由基 发光强度 清除率用以下公式计算: 自由基清除率空白对照样品/空白对照×% ..统计分析 进行比 所有试验至少重复三次,数据用均值的标准误表示,统计分析用 较。显著性以.表示。 .结果与分析 ..不同有机溶剂对超氧阴离子清除活性比较 测定不同浓度的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈和丙酮清除超氧阴离子的能力,结果 显示,除乙腈外,其他三种有机溶剂均为强超氧阴离子清除剂。在四种供试浓度下,甲醇和乙 醇对超氧阴离子的清除无显著性差异,但二者均显著高于相同浓度下丙酮的清除率.。 然而,乙腈在浓度达到反应体系的%/时,仍未检测到清除超氧阴离子能力图.。 墓 . 藿 詈 耄 磊 % 图.不同有机溶剂对超氧阴离子的清除活性 , .. 为了比较异黄酮在不同有机溶剂中清除超氧阴离子的能力,将黄豆苷原和染料木素分别溶解在 一定量的四种不同有机溶剂中。结果发现,在同样的有机溶剂添加量下,黄豆苷原用乙腈溶解时的 清除率要高于其他三种有机溶剂图.。染料木素也呈现出相同的结果结果未显示。因此, 我们选择乙腈作为溶剂溶解大豆异黄酮及其代谢产物,测定这类化合物的清除超氧阴离子活性。 河北农业大学硕士学位毕业论文 苓召盘?口曷墨嚣? 图.用不同有机溶剂溶解的黄豆苷原对超氧阴离子的清除作用注:所用黄豆苷原浓度为./ .. :. / ..大豆异黄酮及其代谢产物对超氧阴离子的清除活性 用%乙腈将大豆异黄酮及其代谢产物溶解,分别测定在四种不同浓度下的超氧阴离子 清除能力。结果显示在四种浓度下雌马酚均为最强的超氧阴离子清除剂。黄豆苷原和染料木素 对超氧阴离子能力的清除作用均高于、和。本研究中,染料木素的代谢产物 是最弱的超氧阴离子清除能力最低图.。 ?寥一。翟傅芷西一西?,侣? . 图.大豆异黄酮及其代谢产物清除超氧阴离子的活性 ..大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 .讨论 黄豆苷原、染料木素和一些合成的异黄酮代谢产物清除超氧阴离子活性已有报道,但即使 / 采用相同检测方法进行测定,结果也极不一致。等【曾报道异黄酮在浓度高达. 时仍无超氧阴离子自由基清除能力。等用测定大豆异黄酮及其代谢产物清除超 /时仍 氧阴离子活性,结果发现,黄豆苷原、染料木素、和在浓度高达 不具有清除超氧阴离子活性。 超氧自由基参与了很多病理进程,例如炎症‘引、癌症和衰老【。本研究中,邻苯三酚 在碱性条件下自氧化成超氧阴离子,激发鲁米诺发光,用化学发光仪进行测定。这种检测方法 灵敏度高,但该测定方法有一定局限性。、和均为大豆异黄酮还原产物,理 论上,应比大豆异黄酮本身有更强的抗氧化活性。然而,我们的检测结果却是、和 的清除活性均低于大豆异黄酮,这与等【 】报道的异黄酮代谢产物在抗氧化试 验和中比母本化合物有更高的抗氧化活性不一致。推测可能与超氧阴离子反应体 系的值太高.不适合测定酸性或弱酸性化合物有关。因此,在选择合适的测定自由基 的方法时应考虑反应体系的值和化合物的特性。 通过本研究首次发现极低浓度.%,/的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮仍具有很 强的超氧阴离子清除能力,而乙腈则几乎不具有清除能力.%%,/。因此,为了得到 准确的测定结果,在正式试验前首先要通过试验选择合适的溶剂。 河北农业大学硕士学位毕业论文 第四章大豆异黄酮及其代谢产物清除自由基活性研究 是一种稳定的单电子自由基。乙醇溶液在下有强的吸收,溶液呈深紫 色。当电子成对后,深紫色减退或消失,这种颜色深浅变化与电子的消失成正比。 .材料 ..药品和试剂 黄豆苷原和染料木素美国公司 .、、和利用微生物转化的方法制备,纯度达%均由实验室保藏 的菌株转化得到 美国 心脑浸提液美国 公司 其他主要试剂 甲醇,美国公司 ,美国公司 乙酸乙酯 乙醇,美国公司 ..主要实验仪器与设备 电子天平:,美国公司 紫外可见分光光度计.:美国公司 恒温水浴锅:,天津市华北实验仪器有限公司 移液枪及其它辅助设备; .试验方法 .. 自由基清除能力测定方法 在体系中,甲醇【叫和乙醇均可作为溶剂,本研究采用乙醇作为溶 剂。具体 . 方法为:用乙醇溶解的样品加入到比色管中再与. 混匀,在 黑暗环境中孵育小时。用.宽的比色杯在下测定吸光度。抑制率 通过比较对照 和样品的吸光度来计算。 ..统计分析 所有试验至少重复三次,数据用均值的标准误表示,统计分析用 来比较。 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 显著性以.表示。 .结果与分析 .. 反应体系的稳定性 自由基是一种稳定的自由基,试验中分别测定了,,,,,, ,,,,时体系的对照和加黄豆苷原和雌马酚后的吸光度。发现对 照的吸光度基本保持不变?.,黄豆苷原和雌马酚的清除率却随时间延长明显增加如图 .所示。由图.可知,在后清除率的增长趋势变缓,因此我们选择反应时间为。 磊 皇 宝 暑 苓畏篮锄蛊一?口。》矗沈 ? 图. 体系对照及加入黄豆苷原、雌马酚后随时间变化的清除率变化动力学曲线 : .. ..大豆异黄酮及其代谢产物清除自由基活性 将一定浓度的大豆异黄酮及其代谢产物溶解在乙醇中,在?黑暗环境中反应,测定 吸光度并计算清除率。如图.所示,在四种不同浓度下,雌马酚对 的清除率最高,黄 豆苷原清除自由基的活性最弱。染料木素和其他的三种代谢产物、和 在浓度./和./时清除活性相似。然而,随着浓度增加,每种化合物对 的清除活性的增长幅度不同。所有异黄酮代谢产物的清除活性在浓度./和 ./时均高于底物异黄酮本身。 河北农业大学硕士学位毕业论文 ?紧一四艺西一西?》弼协 / 图.大豆异黄酮及其代谢产物清除自由基能力....超氧阴离子和体系清除自由基灵敏性比较 根据已测得的大豆异黄酮及其代谢产物对超氧阴离子和的清除率,计算出值表 。在超氧阴离子测定中,除外,其他三种黄豆苷原的代谢产物、和 均能在./时检测到对超氧阴离子的清除能力,并且雌马酚在./时,清除率 高达%而在清除自由基试验中,当雌马酚浓度高达.时,其清除率也只有 %左右,因此,超氧阴离子体系的灵敏性要高于体系。 表大豆异黄酮及其代谢产物超氧阴离子试验和试验的卯值 ..讨论 尽管黄豆苷原、染料木素和一些化学合成的异黄酮代谢产物清除活性已有报道,但 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 是报道的结果极不一致。等【】报道异黄酮在浓度达到.时没有清除活性。 /时仍不 掣发现黄豆苷原、染料木素、大豆苷和染料木苷在浓度达到 具有清除自由基的活性反应时间为。根据等报道,黄豆苷原、染料木 素、雌马酚和去氧甲基安哥拉紫檀素有清除自由基的活性,但是值均大于/。 通过试验发现,与和【】报道的结果一致,黄豆苷原、染料木素及其 代谢产物当反应时间为时,均无清除自由基活性。然而,当反应时间延长到 时,全部化合物在./时均变为强清除剂。最强的清除剂是雌马酚,它的 值为./表;而当反应时间为时,雌马酚的值要高于/,这与 报道的结果一致。通过对反应体系本身稳定性进行测定发现,尽管该体系对照随 时间延长,吸光值有所下降,但下降比较缓慢,尤其保证实验在完 全黑暗条件下进行时,反应 体系是稳定的。因此通过延长反应时间来增加清除率是适合的。事实上,人和动物摄入异黄酮 后,异黄酮发挥作用都需要一个很长的过程。研究自由基的清除作用,最合理的方法是 延长反应时间直到所有清除剂在反应体系中都发挥他们的作用。通过延长反应时间提高 清除率是本研究的一个创新点。 河北农业大学硕士学位毕业论文 结论 .首次发现甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂本身在极低浓度下.%.%,/即具有较 高清除羟基自由基和超氧阴离子能力,而乙腈浓度增至%/时仍无清除能力。 .大豆异黄酮及其代谢产物水溶性差,不适于用羟基自由基清除率评判其抗氧化能力; 超氧阴离子自由基测定体系具有较高灵敏度,但该法有一定局限性,不适于酸性或弱酸 至 性化合物的测定。自由基测定体系稳定,通过延长传统的检测时间 可明显提高检测灵敏度,适于各类化合物检测。 .通过清除试验发现,在四种供试浓度下,相同浓度的染料木素对 的清除 率均高于黄豆苷原;在黄豆苷原、染料木素、、、和雌马酚中,雌马 酚的清除活性最高。大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研 究 参考文献 ., ..,以 【】 .., .,,:. 】 。 叨. ,.:一. .: 【】 ., ., ., ., ?. ..., 【】 ..,,,:. .. 】段文虎,徐鸣夏.骨质疏松防治药物研究【】.中国药物化学杂 志,,:. : 【】 . . ,,?: ..【】 .., ., ,,:. . 【】郑德勇,安鑫南.植物抗氧化剂的研究概况与发展趋势叨.林 产化学与工业,,: .. 【】 ,杜顺,毛一雷.抗氧化剂闭.国际内科双语杂志,,:?. 【】汪秋安,周冰,单杨.天然黄酮类化合物的抗氧化活性和提取 技术研究进展【】.化工生产 与技术,,:.. 】孙克杰,汤坚.异黄酮类化合物在不同氧化体系中的作用研究】. 食品科学,,: .. , 八 , 【】 . ,:. . , 【】 , .,,:. .一 【】 , ,八 . ,,:. . ., 【】 , 凡 ,, . :. . , 凡 【】 . ,,:. .., , 【】 .., , . ,:.河北农业大学硕士学位毕业论文 【】 , , , .. .:. 。 .&缸 , 【】 , . ,:. .. .., 【】 ., . ,,: .. . 【】 ., .,? 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【】,..,.,,..,... 河北农业大学硕士学位毕业论文 .,,. .】,..,, .,.,..., ,. 】井乐刚,路芳,张永忠.大豆异黄酮的抗氧化活性叨.食品与发酵 工业,,:.. .: 【】,.,,.,,, . .. . .,,?. . 【】,.,.,,. . ?. .,, 【】 ,..,,.,,.., :. .,,. 【】卞云云,李萍.蒙古黄芪中黄酮类成分抗超氧阴离子活性研究 及构效关系分析【】.中国药 学杂志,,:. 【】 , . 【】. 中国药学杂志,,:.. . 【,.,,.,,., ... .,, 年. 【】,.,,.. . ,,.. .【,.,,,,., ..,,?. 】,, . ,.,,.., .,,.. .【,&,..,., . .. ,,鲻. 【】,..,, . ,. , ,. .. 【】,,,..,,&., , ,,. .,,. . 【】&删%.,,,,.,. .,, .【】.,,.,,.., . .,,. ... 大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 【】,.,..,. . . ,,. 【】,.,,.,,.. . .,,. . .【】,.,,.,, .,/ ....,,?.【】, .,,..,,. .....,,. 【,.,,,,. ,,.., ..,,?. 河北农业大学硕士学位毕业论文 在读期间发表的学术论文 ,? ,? ;/ 【】? , ’,一 ... .,,. 】,..;,..;,.;,.;,..;,.;,../ . ,吼;,..,,.,, .,.;:;,,.?.大豆异黄酮及其代谢产物体外抗氧化活性研究 作者简历 姓 名:梁晓琳 性 别:女 出生日期:年月 籍 贯:河北省石家庄市 最后学历:理学硕士 教育背景: 工学学士 年.年 就读于河北农业大学生命科学学院 年 年 就读于河北农业大学生命科学学院 制药工程系 理学硕士 微生物与生化药学专业天然药物分析与应用方向 在读期间发表的学术论文: 【】 ’, , , ;/ ,.,.,, ... .