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人羊膜上皮细胞移残薷赐帽鄞陨窬鹕人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经aspan class= (NXPowerLite) 中国组织工程研究 第17卷 第53期 2013–12–31出版 www.CRTER.org Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.010 [] 张洋，刘春霞，王亮，张莉，刘伟，赵伟，李治. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤[J].中国组织工程研究，2013，17(53):9157-9163. ?人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤* 张 洋，刘春霞，王 亮，张 莉，刘 伟，赵 伟，李 治(沈阳医学院附属中心医院～辽宁省沈阳市 110024) 文章亮点: 1 人羊膜上皮细胞是克隆原细胞，与胚胎干细胞一样均是全能干细胞，经培养有分化成3个胚层细胞的张洋?～男～1981年生～辽宁省沈阳市人～汉族～潜能，而且还保持神经干细胞的特性。 2011年中国医科大学毕2 实验特点即在于采用体外培养的人羊膜上皮细胞，进行绿色荧光蛋白标记后移植到新西兰大白兔臂丛神业～硕士～主治医师～主经损伤区，经苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察，客观的证实了羊膜上皮细胞对兔臂丛神经损伤的修复作用。 要从事脊柱外科疾病的诊关键词: 断及治疗。 器官移植;细胞移植;臂丛神经损伤;人羊膜上皮细胞;绿色荧光蛋白;兔;其他基金 zhangymed@163.com 主题词: 通讯作者:李治～主任医臂丛神经炎;羊膜;上皮细胞;绿色荧光蛋白质类 师～在读博士～沈阳医学基金资助: 院附属中心医院～辽宁省沈阳医学院科研基金资助项目(20111031)* 沈阳市 110024 lz8534@163.com 摘要 中图分类号:R318 背景:目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方面，而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不文献标识码:A 多，尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究和报道更少。 文章编号:2095-4344 目的:探讨人羊膜上皮细胞对臂丛神经的修复作用。 (2013)53-09157-07 方法:应用测力神经根拉钩水平牵拉臂丛神经根的方法制备大白兔臂丛损伤模型，提取人羊膜上皮细胞并扩增修回日期:2013-11-24 培养，扫描电子显微镜下观察人羊膜组织及羊膜上皮细胞的超微结构，人羊膜上皮细胞转染绿色荧光蛋白标记(201311021/M〃W) 并注射入臂丛神经损伤区，苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察羊膜上皮细胞对兔臂丛神经损伤的修复作用。 结果与结论:?分离得到的人羊膜上皮细胞表达上皮细胞标志物角蛋白CK19，不表达间充质细胞标志物波形 蛋白，不同程度表达CD29，CD73。扫描电子显微镜观察到人羊膜上皮细胞胞体饱满，连接紧密，细胞状态 良好。?人羊膜上皮细胞移植到新西兰大白兔臂丛神经损伤模型后18周，免疫荧光检测到神经损伤区可见有 表达绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞。?术后6周实验组大白兔前爪功能开始恢复，术后12，18周实验组大白 兔前爪功能得到明显改善，功能评分明显提高，对照组几乎没有恢复。以上结果可见人羊膜上皮细胞参与了 臂丛神经损伤的修复。 Human amniotic epithelial cell transplantation for repair of brachial plexus injury in rabbits Zhang Yang, Liu Chun-xia, Wang Liang, Zhang Li, Liu Wei, Zhao Wei, Li Zhi (Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: A great deal of attention has been given to stem cell transplantation for repair of spinal cord injury, while there are few studies concerning stem cell transplantation for repair of peripheral nerve injuries, Zhang Yang?, Master, especially transplantation of human amniotic epithelial cells used to repair peripheral nerve injuries. Attending physician, Central OBJECTIVE: To discuss the effects of human amniotic epithelial cells in brachial plexus nerve repairing. Hospital Attached to Shenyang METHODS: We established rabbit models of brachial plexus injuries and extracted human amniotic epithelial Medical College, Shenyang cells for expanding culture followed by ultrastructural observation of human amniotic membrane tissue and 110024, Liaoning Province, amniotic epithelial cells under a scanning electron microscope. Then, human amniotic epithelial cells were China transfected with green fluorescent protein markers and injected into the injury site. Hematoxylin-eosin staining zhangymed@163.com and fluorescence microscope were employed to observe the effects of human amniotic epithelial cells in the repair of brachial plexus injuries in rabbits. Corresponding author: Li Zhi, RESULTS AND CONCLUSION: (1) Successfully isolated human amniotic epithelial cells expressed cytokeratin 19 Studying for doctorate, Chief rather than vimentin, and also expressed CD29 and CD73 to different extent. Scanning electron microscope physician, Central Hospital Attached to Shenyang Medical observation showed human amniotic epithelial cells had filled cell bodies and were closed interconnected in good College, Shenyang 110024, condition. (2) After 18 weeks of successful modeling, human amniotic epithelial cells labeled with green fluorescent Liaoning Province, China protein were visible in the injury site under the fluorescence microscope. (3) In the experimental group, functional lz8534@163.com recovery of the rabbit forelegs was found at postoperative 6 weeks and dramatically improved at 12 and 18 weeks after surgery. Functional scores were also significantly increased in the experimental group. However, there was Accepted: 2013-11-24 no improvement in the control group. These findings indicate that human amniotic epithelial cells are involved ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9157 www.CRTER.org 张洋，等. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 in the repair of brachial plexus injury. Subject headings: brachial plexus neuritis; amnion; epithelial cells; green fluorescent proteins Funding: the Scientific Research Fund of Shenyang Medical College, No. 20111031* Zhang Y, Liu CX, Wang L, Zhang L, Liu W, Zhao W, Li Z. Human amniotic epithelial cell transplantation for repair of brachial plexus injury in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9157-9163. 上皮细胞已经用于治疗中枢神经系统疾病的研究中。最重0 引言 Introduction 要的是，羊膜是产后“废弃”组织，来源广泛、取材方便、 且满足伦理学要求。虽然人羊膜上皮细胞的研究还处于起 臂丛神经是由第5至8颈神经和第1胸神经前支组成步阶段，但是人羊膜上皮细胞的多向分化潜能以及免疫原的;有时C接受C的部分神经纤维，T接受部分T的神性很低的特性使其具有广泛的临床应用前景。 5412 经纤维，凡是组成臂丛的神经受损伤均称为臂丛神经损目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方[1]伤，造成臂丛神经损伤的主要原因是车祸、运动、重面，而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不物撞击造成的牵拉;同时新生儿在分娩中造成的臂丛神多，尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究 [2-3]经损伤也占很大比例。臂丛神经损伤是一种比较难处和报道更少，因此本实验将羊膜上皮细胞移植到受损伤理的周围神经损伤，若得不到及时正确的诊治，将导致的臂丛神经，探讨羊膜上皮细胞对臂丛神经损伤的修复上肢的严重功能障碍，造成患者终身残疾，并产生严重作用。 [4]的社会经济影响。目前临床对其手术治疗的最佳时机 是伤后3个月内，如果错过最佳治疗时间，可供移位的1 和方法 Materials and methods 神经数量有限，质量欠佳，术后功能恢复较差。 随着显微外科、基因治疗等先进技术的研究应用，设计:随机对照动物实验。 传统的中医药技术和规范的康复理疗技术不断发展进时间及地点:实验于2012年5月至2013年5月在沈[5-6]步，臂丛神经损伤的诊治水平进一步提高，但是由于阳医学院附属中心医院实验室完成。 臂丛神经解剖结构比较复杂、变异多样，损伤类型和平材料: 面的不同，其所支配的神经、肌肉组织病理退变与再生实验动物:清洁健康的18周龄新西兰大白兔30只，速度和程度亦有所不同，因此此类损伤的治疗效果和预雌雄不限，体质量3.5 kg左右，由辽宁长生生物技术有 [7-8][9-11]后仍不理想。国内外的相关研究结果显示:臂丛限公司提供(实验动物质量合格证号0009760)。 损伤患者的生活质量并不令人满意，且生活质量与许多羊膜组织:在征得产妇书面同意后，取沈阳医学院附 [12]因素相关属中心医院妇产科健康产妇剖腹产后的胎盘，分离胎盘。因此，许多研究开始积极寻找更为有效的 治疗。 表面的羊膜获取羊膜上皮细胞。 目前，干细胞移植作为神经系统新的治疗手段受到羊膜上皮细胞对臂丛神经损伤修复实验所用主要试剂和广泛关注。国内外干细胞移植在神经系统方面的研究多仪器: [13-14][15]集中在胚胎干细胞、多能诱导干细胞、神经干细 试剂及仪器 来源 [16-17] 胞等方面，但是这些干细胞都面临着来源限制、伦 RPMI1640 Gibco公司 理限制、安全性限制、免疫排斥限制等问题。面对这些 胎牛血清 美国Hyclone公司 问题，越来越多的研究关注于人羊膜细胞，人羊膜细胞 胰蛋白酶、二甲基亚砜 美国Sigma公司 目前已成为寻找人类干/祖细胞新来源的研究热点。羊膜 FITC标记的鼠抗人CD29、CD73 美国BD公司 单克隆抗体 存在于胎儿绒毛膜的表面，是一个光滑、无神经、无血 鼠抗人CK19、波形蛋白单克隆抗体 Santa Cruz 管、无淋巴的透明膜。羊膜组织主要由羊膜上皮细胞和 山羊抗小鼠FITC标记的IgG二抗 北京中山生物技术公司 青霉素、链霉素 Gibco/BRL 羊膜间充质细胞组成。羊膜上皮细胞表达许多干细胞的 倒置相差显微镜、荧光显微镜、 日本Olympus 标志物如:SSEA-4、SOX-2、TRA-1-60、TRA-1-81、 数字成像系统 FGF-4和 Rex-1等;表达多潜能干细胞特定的转录因子 CO细胞培养箱 美国Forma scientific公司 2 台式低温超速离心机 德国Sigma公司 Oct-4和Nanog;且具有多向分化潜能，更具有神经生 BDFACSCalibur流式细胞仪 美国Becton-Dickinson公司 [18-19]物学的特性。有研究证明，羊膜上皮细胞中存在神 恒温冷冻切片机 德国Leica [20]经组织特异性蛋白的表达，如:MAP-2、GFAP、Neural 培养皿、培养板 美国Corning公司 超净工作台 苏州安泰公司 tubulin等，体外诱导的羊膜上皮细胞可以产生不同比例 SANYO Corporation 深低温冰箱 [21]的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。因此羊膜 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9158 www.CRTER.org 张洋，等. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 实验方法: 再用预冷的1%锇酸于4 ?固定1 h，然后用PBS浸洗 人羊膜上皮细胞的分离、培养、传代:选用剖腹产后的2次，每次10 min;脱水:丙酮/醋酸异戊酯(1?1)脱水人羊膜，去除残留的绒毛膜，放入含青、链霉素双抗的10 min，再用醋酸异戊酯脱水30 min;样品经上述处理PBS中洗净后，将羊膜剪碎成直径约1 mm的小组织块，后，进行干燥，扫描电镜下观察。 加入0.25%胰蛋白酶消化液在37 ?下消化七八分钟，免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞角蛋白19和波形蛋白的表滴加含体积分数为5%胎牛血清的培养液终止消化，用达:铺板:载玻片裁成1 cm×1 cm，1%明胶在24孔板中移液管不断吹打，同时200目滤网进行过滤，滤液装入铺板，将明胶吸出，紫外下照射30 min，待明胶变干，50 mL离心管中1 000 r/min离心5 min，小心弃掉上清，收在孵箱备用;收获第5代处于对数生长期的人羊膜上 9-14收集细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×10 L，皮细胞，每孔加入2×10个细胞于24孔板，待细胞长满， 2接种到25 cm将小载玻片取出，放在湿盒上，用预温的PBS洗3次，培养瓶，加入含1%青、链霉素双抗、 10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和体积分数为10%胎每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，牛血清的RPMI1640培养基，于37 ?、体积分数为0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗3次，5%BSA封闭5%CO培养箱内培养。隔天换液，倒置显微镜下观察，30 min，PBS洗3次，一抗4 ?湿盒过夜，第2天PBS洗32 细胞状态良好，覆盖培养瓶底80%左右时进行传代。弃次，二抗和DAPI室温30 min，95%甘油封固，上镜观察。 去原瓶中的旧培养液，PBS洗3遍，以除去残留的血清。流式细胞技术鉴定羊膜上皮细胞CD73和CD29的表达:加入0.25%胰蛋白酶消化液1 mL(以浸没细胞表面为宜)取第5代对数生长期的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，后，置于显微镜下观察，当细胞的突起消失，细胞变圆用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液制成 单细胞悬液，将单细胞悬液加入2 mL圆底离心管中， 时，立即弃去消化液，用含有体积分数为10%胎牛血清 的RPMI1640培养液终止消化。然后用吸管将贴壁的细1 500 r/min离心5 min，弃上清液。以冷PBS 1 mL，离胞吹打成单细胞悬液，按适当比例分瓶传代，置于37 ?、心洗涤，弃上清液。加入用PBS稀释的荧光素标记的抗体积分数为5%CO的恒温培养箱中培养。次日更换1次体200 μL。用微量移液器轻轻吹打混匀，4 ?或置冰上2 培养液，继续培养。 孵育30-60 min。离心弃上清液。加入预冷的PBS 1 mL， 人羊膜上皮细胞的冻存:选择第7代或第8代处于对数生离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。向细胞长期的细胞，在冻存前1 d换液，用0.25%胰蛋白酶消化中加入冷PBS 500 μL，吹打混匀，置流式管中，4 ?液消化细胞;制成单细胞悬液，移入离心管中，1 000 r/min避光保存，待测。 离心5 min;弃去培养液，加入1.5 mL 4 ?预冷的冻存转染绿色荧光蛋白载体:收获第8代处于对数生长期的 4液(1 mL二甲基亚砜+9 mL血清)，吹打均匀后移入冻存细胞，以5×10个/孔转种于6孔培养板中，37 ?，体积管，用封口膜和胶布密封管口，做好标记后依次放入4 ? 分数为5%CO环境中培养24 h，细胞长至80%融合。转2 30 min，-20 ? 30 min，-80 ?过夜，如长期保存移入染前三四个小时换2 mL无血清RPMI1640培养基培养。液氮中。 在无菌1.5 mL试管中制备下述溶液:溶液A:将4 μg的 人羊膜上皮细胞的复苏:从液氮容器中取出冻存管，pIRES2-AcGFP1质粒溶于250 μL无血清RPMI1640培迅速放入37 ?水浴中，并不时摇动令其尽快融化; 养基中，轻微摇晃混匀5 min;溶液B:将10 μL 1 000 r/min离心5 min弃去冻存液，加入1.5 mL含有体Lipofectamine 2000加入250 μL无血清RPMI1640培养积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液，吹打均匀基中，轻微摇晃混匀5 min;溶液C:合并溶液A和溶液后移入培养瓶内，置于37 ?、体积分数为5%CO的恒B，轻轻混匀，室温下孵育20 min。弃去细胞培养基，2 温培养箱中培养;次日更换1次培养液，继续培养。 用无血清RPMI1640培养基洗细胞2次备用。将溶液C加 入6孔板要转染的细胞中，前后轻微摇晃培养板，37 ?，细胞计数方法:取第7代或第8代对数生长期的细胞， 0.25%的胰蛋白酶消化，用含体积分数为10%胎牛血清体积分数为5%CO环境中培养五六个小时，换为含体积2 的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，微量加于血细胞分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养。配计数板，显微镜下计数四角大方格中的细胞数，代入以制G418，进行转染细胞的G418的梯度筛选，筛选质量下公式得到细胞密度。重复计数2次，取平均值。 浓度分别为200，300，400，500 mg/L。按此浓度，依 次加入各质粒转染组。挑取单克隆，采用有限稀释法。4细胞数/mL=(4个大格细胞数之和/4)×10 继续应用400 mg/L的G418扩大培养，维持转染效率。 羊膜组织和羊膜上皮细胞的超微结构观察:将羊膜组织扩大培养，传代，冻存，进行后续实验。 冰冻切片或者羊膜上皮细胞铺片取出浸入PBS中，轻轻动物模型的制备:待麻醉平稳后，将大白兔俯卧固定漂洗表面。然后将切片或铺片放入预冷的3%戊二醛于 于手术台上，皮肤消毒，进行手术。首先，将C至C584 ?过夜，吸出固定剂，用PBS浸洗2次，每次10 min;左侧半椎板切除，显露硬膜囊，由肩胛上缘向前探查，ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9159 www.CRTER.org 张洋，等. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 显露臂丛神经股部，向神经根追溯至根孔，确定C，C，图3，以上结果证实实验所提取的细胞为羊膜上皮细胞。 56 C，C，咬除C和C小关节，在神经孔处，神经根 ，，785667 出硬膜囊外0.5 cm用测力神经根拉钩水平牵拉左侧神 经根，以0.9 N的拉力持续牵拉神经根10 min，10 min 后去除牵拉，进行缝合。根据grooming实验评价标准确 [22-23]定造模成功。 动物分组与人羊膜上皮细胞移植:18周龄新西兰大白 兔30只，随机分为实验组和对照组。通过立体定位仪， A:羊膜组织(×200) B:羊膜上皮细胞(×2 000) 用微量注射器接无菌玻璃拉丝针头将含荧光标记的人 羊膜上皮细胞悬液缓慢注入到实验组大白兔距臂丛神 经损伤区头、尾侧各4.0 mm处，注射深度为1.25 mm。 每点3 μL(75 000个细胞)，分两点注射，注射时间5 min， 为防止细胞倒流留针5 min。对照组同样方法建模，注 入与人羊膜上皮细胞相同的培养液。在术后2，6，12， 18周检测移植羊膜上皮细胞的实验组大白兔肢体前爪 C:羊膜上皮细胞(×5 000) 运动功能、以及对大白兔损伤的臂丛神经内及相应节段 颈髓内羊膜细胞进行示踪。 注:羊膜组织无血管、无神经、无淋巴，羊膜上皮细胞状态良好， 形态饱满，连接紧密。 运动功能评分:待大白兔苏醒后观察，给予运动功能 [22-23] 图1 扫描电镜观察羊膜组织及羊膜上皮细胞形态 评分，采用grooming实验评价标准:0分，实验侧 肢体前爪瘫痪;1分，实验侧肢体前爪可触及嘴部;2分， Figure 1 Morphology of human amniotic membrane tissue and amniotic epithelial cells under scanning electron 实验侧肢体前爪可触及嘴与眼之间;3分，实验侧肢体 microscope 前爪可触及眼;4分，实验侧肢体前爪可触及耳前部;5 分，实验侧肢体前爪可触及耳后部。 苏木精-伊红染色:羊膜上皮细胞移植18周后取大白 兔股部臂丛神经进行冰冻切片，切片用40 g/L多聚甲醛 固定5 min，自来水洗涤，滴加苏木精覆盖标本，染色 2-5 min，自来水洗涤，盐酸乙醇分色(1份盐酸+99份无 水乙醇)，自来水洗涤，碱水返蓝，自来水洗涤，滴加伊 红20 s-3 min，自来水洗涤，脱水:体积分数为70%乙 醇5 min;体积分数为85%乙醇5 min;体积分数为100% A:角蛋白19(CK19) B:波形蛋白 乙醇5 min，透明:二甲苯? 10 min;二甲苯?10 min， 注:羊膜上皮细胞表达CK19，而不表达波形蛋白。 中性树脂封固。 图2 羊膜上皮细胞内标记蛋白的表达情况(免疫荧光，×40) 主要观察指标:?扫描电镜观察羊膜组织及羊膜上 Figure 2 Expression of protein markers in the amniotic 皮细胞形态。?免疫荧光染色和流式细胞术鉴定羊膜上epithelial cells (Immunofluorescence, ×40) 皮细胞标记蛋白的表达。?荧光显微镜观察羊膜上皮细 胞在臂丛神经损伤区的示踪情况。 2 结果 Results 2.1 扫描电镜观察羊膜组织及羊膜细胞的超微结构 扫描电镜观察到羊膜组织为无神经、无血管、无淋巴的 致密透明膜。分离提取的羊膜上皮细胞胞体饱满，连接 A:CD73 B:CD29 紧密，细胞状态良好，见图1。 注:羊膜上皮细胞高表达CD73和CD29。 2.2 免疫荧光染色和流式细胞术对所提取的羊膜上皮 图3 流式细胞技术鉴定羊膜上皮细胞标记的表达 细胞进行鉴定 所分离的人羊膜上皮细胞明显表达上 Figure 3 Expression of protein markers in the amniotic 皮细胞标志物角蛋白CK19，不表达间充质细胞标志物 epithelial cells detected by flow cytometry 波形蛋白，见图2;不同程度地表达CD29、CD73，见 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9160 www.CRTER.org 张洋，等. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 2.3 羊膜上皮细胞转染绿色荧光蛋白结果 羊膜上皮细胞为绿色荧光蛋白标记过的羊膜上皮细胞，因此在荧细胞转染携带绿色荧光蛋白的质粒，从而使羊膜上皮细光显微镜下，表达绿色荧光蛋白。实验结果显示，羊膜胞标记绿色荧光蛋白，转染效率达到80%以上，绝大多上皮细胞移植18周后，与对照组相比实验组大白兔臂丛数羊膜上皮细胞都表达绿色荧光蛋白，见图4。 神经局部表达带有绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞，证实 羊膜上皮细胞参与臂丛神经修复，见图5，6。 AB A b baa aa bb 注:绝大多数羊膜上皮细胞都表达绿色荧光蛋白，转染效率达80%图4 对照组HE染色(A)和羊膜上皮细胞示踪(B)注:图A可见损伤的臂丛神经纵切面(×10)损伤处(a点)神经纤维 以上。 注:图A可见损伤的臂丛神经纵切面(×10)损伤处(a点)神经纤维排列紊乱,b点区域为正常神经纤维。图B 在相同位置无荧光羊膜上皮细胞排列紊乱，b点区域为正常神经纤维。图B在相同位置无荧光羊 图4 绿色荧光蛋白标记羊膜上皮细胞(×40) Figure4 The control group brachial plexus HE staining(A) and tracer amniotic 膜上皮细胞。 epithelial cells(B) Figure 4 Amniotic epithelia cells labeled with green fluorescent protein (×40) 图5 对照组臂丛神经苏木精-伊红染色和羊膜上皮细胞示踪 Figure 5 Hematoxylin-eosin staining of the brachial plexus and tracing of amniotic epithelial cells in the control 2.4 动物模型建立情况 通过手术造成大白兔臂丛神 group 经损伤，其中对照组15只大白兔grooming评分1分有2 只，2分有5只，3分有4只，4分有1只，其中麻醉过量死 亡1只，手术诱发炎症脓肿2只，退出实验;实验组15 AB 只大白兔grooming评分1分有2只，2分有6只，3分有3 A aa 只，4分有2只，其中手术诱发炎症脓肿1只，过度牵拉 aa导致瘫痪1只，退出实验。 bbbb2.5 羊膜上皮细胞移植后新西兰大白兔的前爪运动功 abab aa能 术后2周实验组大白兔较对照组大白兔前爪运动功 bbaa能有微弱的恢复;术后6周实验组大白兔前爪功能开始 图5 实验组臂丛神经HE染色(A)和羊膜上皮细胞示踪(B)注:注:臂丛神经横断面上臂丛神经横断面上，图, 图A与图AB中神经标本的相同位置不仅神经外膜以及束与图B中神经标本的相同位置，不恢复，其中损伤越轻，恢复越好;术后12，18周实验组 膜(a点)表达带有GFP的羊膜上皮细胞，在神经横断面内部即神经纤维内(b点)仅神经外膜以及束膜(a点)表达带有绿色荧光蛋白的羊膜上皮细也可见散在的带有GFP的羊膜上皮细胞大白兔前爪功能得到明显改善，功能评分明显提高，对 Figure5 The experimental group brachial plexus HE staining(A) and 胞，在神经横断面内部即神经纤维内(b点)也可见散在的带有绿色tracer amniotic epithelial cells(B)照组只有轻微恢复。表1为具体评分结果。 荧光蛋白的羊膜上皮细胞。 图6 实验组臂丛神经苏木精-伊红染色和羊膜上皮细胞示踪 表1 羊膜上皮细胞移植后新西兰大白兔的前爪运动功能Figure 6 Hematoxylin-eosin staining of the brachial plexus and grooming评分 tracing of amniotic epithelial cells in the experimental group Table 1 Grooming scoring on motor function of rabbit’s forelegs after transplantation of human amniotic epithelial cells 时间 组别 1分(只) 2分(只) 3分(只) 4分(只) 5分(只) 讨论 Discussion 3 0周 对照组 2 5 4 1 0 实验组 2 6 3 2 0 2周 对照组 2 5 3 2 0 随着现代交通的日益发展，交通事故导致了臂丛神实验组 2 5 3 3 0 经损伤的患者日益增多，由于手术时机较晚，已错过最6周 对照组 2 5 3 2 0 实验组 1 4 3 4 1 佳治疗时间，而且由于臂丛神经解剖结构复杂，因此手12周 对照组 2 5 2 2 1 术后效果不甚理想，致残率很高，严重影响患者生活质实验组 0 3 3 5 2 量，同时给家庭和社会也造成一定的负担。臂丛神经损18周 对照组 2 4 3 2 1 实验组 0 3 2 4 3 伤的治疗方式、方法多样，且疗效不一，应结合临床采 [24] 用综合治疗，促进患肢功能康复。在本实验中，成功注:实验组大白兔前爪功能得到明显改善，对照组只有轻微恢复。 建立了大白兔臂丛神经损伤模型，以用于对臂丛神经损2.6 羊膜上皮细胞在大白兔臂丛神经内的示踪 植入伤治疗方法的进一步研究。 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9161 www.CRTER.org 张洋，等. 人羊膜上皮细胞移植修复兔臂丛神经损伤 近几年，细胞治疗成为了最热门的领域，其中，胚不表达 MHC-?类抗原，少量表达 MHC-?类抗原，不胎干细胞、多能诱导干细胞、神经干细胞等已经开始广具有免疫原性，从而解决了异体移植的免疫排斥问题。泛应用于临床，而羊膜细胞也作为人类干细胞新来源得同时可分泌抗炎因子，可以防止移植后炎性反应的发到广泛关注。羊膜是覆盖在羊膜腔内表面的一层薄膜，生。从胎盘组织获取人羊膜上皮细胞不涉及伦理及法律是从细胞滋养层演化而来的，是人类两层胎膜的内层，问题。而且胎盘组织还可避免年龄的影响，也可以低温 0.05 mm，是人体中最厚的基底膜;羊膜其厚度为0.02-保存，可用于建立细胞库。由于人羊膜上皮细胞的来源是由羊膜上皮细胞、基底膜、实质层、纤维母细胞层、广、成本低、可控性强等众多优点，相信人羊膜上皮细海绵层5层结构组成的。虽然羊膜细胞仍处于研究的初胞在今后的临床研究中必将发挥不可估量的作用。 [25-27]始阶段，但是目前已经发现其治疗帕金森病、脊髓 [28]损伤等中枢神经系统疾病:第一作者负责实验的实施及设计～通讯作者修，并取得了一定的修复效作者贡献 果。在一些生长因子的作用下，羊膜细胞还可以分化为改并校审～所有作者共同起草并监督～通讯作者对文章负责。 [29]肝、胰腺、心肌和神经细胞等。同时，羊膜细胞具有利益冲突:课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组一定的免疫豁免性，这使它成为细胞治疗的良好潜在供织直接或间接的经济或利益的赞助。 体。羊膜细胞包括羊膜上皮细胞及羊膜间充质细胞，其伦理要求:实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical 中人羊膜上皮细胞位于羊膜的最内层，羊膜上皮细胞在issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚件。 [30]形成前期胚胎干细胞的可塑性。Okawa等发现人羊膜学术术语:臂丛神经损伤-一般分为上臂丛损伤(Erb损上皮细胞表达神经干细胞标记物Nestin，也有研究证明)、下臂丛损伤(Klumpke损伤)和全臂丛损伤。按损伤发生伤 [31]羊膜上皮细胞体外诱导可分化为神经干细胞，这些研的机制与损伤部位又分为:开放性臂丛损伤、闭合(牵拉)性臂究证明人羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性。还有一些丛损伤、放射性臂丛损伤、产瘫。 [32-33]研究证实羊膜上皮细胞也可以向神经细胞分化。这作者声明:文章为原创作品～数据准确～内容不涉及泄密～些研究为羊膜上皮细胞用于细胞移植治疗神经损伤提无一稿两投～无抄袭～无内容剽窃～无作者署名争议～无与他供了有力的依据。作者借鉴其他研究的方法成功提取了人课题以及专利技术的争执～内容真实～文责自负。 羊膜上皮细胞并对其进行鉴定。所提取的羊膜上皮细胞 生长状态良好，可进行传代、冻存、复苏培养，而且细4 参考文献 References 胞特性没有发生重大改变。所提取的羊膜细胞普遍表达 [1] 胥少汀,葛宝丰,许印坎.实用骨科学[M].3版.北京:人民军医出版CK19，而不表达波形蛋白，证明提取的细胞为羊膜上社,2005:950-954. 皮细胞而不是羊膜间充质细胞，同时表达CD73和[2] 胡继红.分娩性臂丛神经损伤54例综合康复疗效观察[J].中国康CD29，说明提取的羊膜上皮细胞具有干细胞特性。随复理论与实践,2006,12(7):633. [3] 贾文清.分娩引起臂丛神经损伤相关因素的分析[J].中国实用神后，对羊膜上皮细胞进行了绿色荧光蛋白标记，注入已 经疾病杂志,2008,11(7):96-97. 建立的大白兔臂丛神经损伤模型，进行修复治疗，在治[4] Giuffre JL, Kakar S, Bishop AT,et al. Current concepts of the 疗后18周，臂丛神经局部表达绿色荧光蛋白，即羊膜上treatment of adult brachial plexus injuries.J Hand Surg Am. 皮细胞对臂丛神经进行了修复。有研究报道人羊膜上皮2010;35(4):678-688. [34][5] 刘慧敏.电针加穴位注射治疗臂丛神经损伤疗效观察[J].现代诊细胞已经进行移植修复尺神经损伤的研究，也进一步 断与治疗,2012,23(7):891-892. 证实了人羊膜上皮细胞对周围神经系统具有修复作用，[6] 周俊明,徐晓君,张沈煜,等.臂丛神经损伤规范化康复治疗的临床且应用前景广泛。 研究[J].中国康复医学杂志,2011,26(2):124-127( 虽然目前人羊膜上皮细胞还没有得到广泛应用，但[7] 陈拓.臂丛神经损伤的诊断与治疗研究[J].亚太传统医药,2009, 5(2):69-70( 人羊膜上皮细胞是克隆原细胞，与胚胎干细胞一样均是[8] 崔庆元.48例臂丛神经损伤的疗效观察[J].中外健康文[35-37]全能干细胞，经培养有分化成3个胚层细胞的潜能，摘,2011,8(48):86-88( 而且还保持神经干细胞的特性，其扩增能力优于成人骨[9] 傅国,顾立强,秦本刚,等.臂丛损伤患者的生存质量调查分析[J]. 中华显微外科杂志,2010,33(2):125-128. 髓间充质干细胞。人羊膜上皮细胞的生物学性状检测表 [10] Kitajima I, Doi K, Hattori Y,et al. 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