光合细菌对小白鼠毒性测试及生殖生长观察

光合细菌对小白鼠毒性测试及生殖生长观察 () 福建师范大学学报 自然科学版() 14 2: 75, 81JO URNAL O F FUJ IA N TEACHERS UN IVERS ITY()1998 NA TURAL SC IENCE Ξ ΞΞ 光合细菌对小白鼠毒性测试及生殖生长观察 张世静曾焕泰陈惠年尤玉博 () 生物学院 摘 要 光合细菌对小白鼠的毒性测试及生殖、生长观察的结果表明, 对受试动物无致毒及致病作用, 对生育生长无不良影响, 不具潜在性的危害. 可望用于人的食用蛋白、食用色素及医药等方面的开 发. 关键词 光合细菌, 小白鼠, 毒性, 生殖, 生长 () 光合细菌 是能进行光合作用的一类细菌, 广泛存在于自P ho to syn th e t ic B ac te r ia 然界中. 由于光合细菌的生理、 生化特性在人类生活生产中具有重要作用, 而且其菌体 1 , 4 中含有极为丰富的营养成分, 因此, 已受到人们的关注. 自70年代以来, 日本、美国、 德国、 英国、 法国、 南朝鲜和澳大利亚等国家广泛开展了光合细菌的研究、 开发, 在有 机废水的净化处理、 水产养殖、 农作物的增产等方面, 起到良好的作用. 此外, 对提取 5 , 8 () 色素、医药以及新型能源 氢气等方面也进行一些探讨性研究. 近年来, 国内不少 9 , 14 学者也开展了对净化水质及鱼虾饵料添加剂等的开发研究, 取得了一定成效. 对于开辟动物饲料新来源, 提取人的食用蛋白、 食用色素和药物等方面, 光合细菌 具有独特的意义, 有待人们去研究和开发. 然而, 要进行其食用性的开发利用. 必须具 备安全性, 有科学验证它对高等动物和人体不具毒性作用和生殖遗传影响. 有关这方面 的资料, 目前尚极少见. 因此, 作者进行了光合细菌对小白鼠的毒性测试及生殖、 生长 的观察, 为光合细菌的开发利用, 提供其安全性的科学依据. 1 实验部分 111 实验 光合细菌: ()的菌液, 以及采用光合细菌富集菌 —3 红螺菌科 P R ho do sp ir illaceae ( 由 —3菌进一步分离纯化而得的 11 菌株 嗜酸红假单胞菌 P N o R h od op seu d om on a s a c i2 ) d op h ila 的菌粉. 实验小白鼠: 由福建省防疫站供给, 本院动物饲养室按标准化饲养. 112 —3对小白鼠的毒性试验P () 11211 灌胃实验: 选用体重28, 32的健康小白鼠 雌雄兼用, 分实验与对照两组, 每g () 组10只. 实验组以 —3菌液 每含菌数为42亿个1ƒ只的剂量, 每天灌胃一次, 连 P m l m l 续灌服14天; 对照组以相同容积蒸馏水处理. 观察各组小白鼠的活动、食欲等反应情况. 最后, 以眼眶静脉窦注入空气处死, 解剖观察内脏器官的变化. 11212 饲料添加菌粉试验: 用培养基接种11菌株, 在光照厌氧条件下培养10 M SA P N o 天而获得11菌株的菌液, 经离心、洗涤等过程而得到菌泥, 再经低温烘干, 研成粉末 N o ( ) 即菌粉, 供作饲料添加剂. 选用体重28, 32的健康小白鼠受试, 实验与对照各10只. g () 实验组每天以100菌粉与饲料粉 小白鼠的标准饲料充分混和, 调制成团, 喂养小m g () 白鼠 全部食完,每天每只小白鼠平均摄食菌粉10; 对照组以标准饲料喂养, 连续喂m g 食7天, 观察受试动物的反应情况. () 11213 自吸实验: 选用体重24, 28的健康小白鼠 雌雄兼用, 分实验与对照两组, 每 g () 组20只. 实验组以 —3菌液 每含菌数38亿个给予小白鼠自由吸饮, 代替日常自饮 P m l 用水; 另一组以自来水作为对照. 两组小白鼠均以标准颗粒饲料为日常食料, 日常平均 饮用水量基本相同. 连续喂养、 观察30天. 在实验过程中, 每周秤称体重一次. 实验结 束时,每组随机取出5只小白鼠, 抽取眼眶静脉窦血液, 进行血液常规检查及血象观察. 此外,实验与对照各5只小白鼠进行实验前后的心电图检查. 11214 染色体检查: 用连续自吸 —3菌液30天的受试小白鼠和对照的各10只, 腹腔注射P () 012% 秋水仙素溶液 011ƒ10体重5后, 以拉颈椎脱臼处死, 解剖取两股骨, 剪去 m lg h 骨的两端, 以注射器吸取生理盐水, 将股骨腔内的骨髓冲洗出来, 冲洗液盛于离心管中, () 再加0107溶液4, 5, 低渗处理 使细胞膨胀、破裂和染色体分离15m in , 以m o l KC l m l () 除去低渗上清液, 加甲醇? 冰醋酸 3? 1 1000 ƒ离心10, 固定液4, 离心去除上rm in m in m l清液, 固定3次, 制成骨髓细胞悬液, 立即制片, 空气干燥, 染色. 在油镜下, 选 G iem sa 择分散良好, 染色清晰的染色体进行观察. 113 —3对小白鼠的生殖、 生长试验P 11311 精子数量和活动度检测: 选用雄性性成熟小白鼠, 分实验与对体重为30, 34, g () 实验组以 —3菌液 每含菌数为42亿个1ƒ只剂量, 照两组, 每组15只.每天灌P m l m l 胃一次, 连续灌服7天; 对照组以蒸馏水同样处理. 每组随机取出5只小白鼠处死, 剖取一侧附睾, 置于含1获能液的小平皿中, 充分剪碎, 制成精子悬液, 35?温育15, 使 m l m in 精子充分游离. 按红细胞计数方法, 获得附睾精子悬液每中的精子数.m l 取上述处理的温育精子悬液一滴于载玻片上, 在高倍镜下观察, 记录200个精子中活 动精子的百分率和不同活动状态分类计数. () 11312 交配生殖实验: 将上两组 连续灌胃7天所余下的雄鼠, 各分别与正常健康雌 () (性小白鼠 性成熟, 未经产按1? 1合笼交配, 一周后取出雄鼠. 实验组的雌鼠 经交配 ) () 过以 —3菌液 每含菌数为38亿个给予自由吸饮; 对照组的以自来水作为对照. P m l 观察、 记录雌鼠的怀孕率、 每胎产仔数、 子代的性比率、 以及出生仔鼠形态发育情况. ( 11313 仔鼠生长观测: 比较两组的子鼠出生存活率和哺乳成活率 出生存活率= 产后4天仔鼠存活数天断乳时仔鼠存活数21 ) ×100; 哺育成活率=仔鼠出生后, 分×100. 出生时活仔鼠数产后4天仔鼠存活数 别于1, 2天、 10天、 20天、 30天各秤称体重一次, 比较仔鼠体重增长情况. 2 结果分析 211 对小白鼠毒性试验的结果 21111 灌胃实验: 经连续灌服14天的实验观察, 各组小白鼠的活动、食欲正常, 均无毒 性反应的表现. 经解剖后肉眼观察心、 肺、 肝、 肾、 脾、 胃、 肠等内脏器官, 均未见特 异变化. 可见,—3菌液对小白鼠无急性的毒性作用. P 21112 饲料添加菌粉实验: 经连续7天添加菌粉喂食的观察, 小白鼠的食欲、活动正常, 实验与对照均无毒性反应的表现. 实验组每只小白鼠、每天平均食进菌粉达10, 在这 m g 样大剂量菌粉的情况下, 并无中毒影响. 可见, 菌粉的安全系数极大. 以急性中毒论, 光 合细菌在如此大剂量下, 并未出现急性中毒效应,其即求不出, 表明它不具毒性.L D 50 21113 自吸实验: 经连续自吸30天的实验观察, 各组小白鼠的活动、食欲正常, 均无死 亡, 表明并无产生中毒效应. 两组小白鼠的体重变化、 血液检验和实验前后的心电图检 测等情况如下. 体重变化: 见表1. ( ) 变化情况表1 实验组与对照组小白鼠的体重g 组别 开始实验时 实验一周 实验二周 实验三周 实验四周 平均增长 实验组 2710?116 2718?118 2818?119 2916?211 3014?213 314?013 对照组 2616?118 2712?211 2811?214 2819?118 2913?211 217?013 由表1可见, 实验与对照的小白鼠体重均有增长, 而实验组的体重增长略大于对照组. 血液检验: 见表2. 表2 实验组与对照组小白鼠的血液检验结果 白细胞分类 动物数 血红蛋白 红细胞 白细胞 血小板 组别 333 嗜中性嗜酸性嗜碱性淋巴单核()()()()()ƒ100血只 万个万ƒƒƒgm l mm mm mm () () () () () % % % % % 实验组 196?1148 90112?12114 80112?12413 2014?216 115 2815 016 012 6712 314 对照组 158?1180 84616?11312 76618?11415 1819?218 125 2615 110 015 6810 410 由表2可见, 两组小白鼠的血象没有明显差异. 表明 —3菌液不会引起小白鼠的血液 P 变化. 心电图检测: 见表3. 表3 实验前后小白鼠心电图 导联测定结果 ? 心率 波电压波电压间期动物数 - P R P R 波群 Q R S 组别 ()()次ƒ只 m in ()()()mV mV m s ()时间 m s ?51 01050?0101 01276?0112 22?116 4211?216 实验前 386实 5 验 组 实验后 ?46 01052?0101 01269?0110 21?118 4213?312 3985 ?48 01056?0101 01281?0112 22?114 4311?316 实验前 374对 5 照 组 实验后 ?42 01053?0102 01274?0116 23?210 4218?218 3915 观测、比较两组小白鼠的实验前后心电图的波形、心率均未见明显改变.表明 —3 P 菌液对小白鼠心脏无不良影响. (21114 骨髓细胞染色体观察: 镜检结果表明, 染色体数量 细胞中含有的完整染色体组 ) () 数目和结构 大体结构均无发生明显改变, 见表4. 表4 实验组与对照组小白鼠的骨髓细胞染色体观察 观察细胞数 染色体数目畸变 染色体结构畸变 实验动物数 畸变率 组别 合计 ()()()()只 个 个 个 ()% 实验组 10 1000 3 2 5 01005 对照组 10 1000 3 1 4 01004 从表4可见, 两组小白鼠的骨髓细胞染色体数量和结构, 均未见发生明显改变. 表明 —3菌液对小白鼠的遗传物质无明显的诱变和损伤作用; 长期喂食并不出现致突变效P 应, 所以, 一般无潜在性危害. 212 对小白鼠生殖、 生长观察的结果 21211 精子数量和活动度检测: 见表5. 表5 实验组与对照组小白鼠的精子数量和活动度检测结果 ()精子运动分类 % 实验动物数 精子数量 组别 ()()只 百万ƒm l 快速 慢速 不动 实验组 194?1192 75 61121 29115 9164 对照组 116?1126 85 60146 30156 8198 从表5可见, 两组小白鼠的精子数量和活动度均无明显差别. 表明 —3菌液对小白鼠 P 的精子无不良影响. 21212 交配生殖实验: 怀孕率、 每胎产仔数及子代性比较: 见表6. 表6 实验组与对照组雌鼠的怀孕率、 每胎产仔数及子代性比率 性比率 交配的 怀孕 产仔鼠 每胎平均 怀孕率 雄仔数 雌仔数 雌鼠数 雌鼠数 总数 产仔数 () ?? ?组别 ()()只 只 ()% ()()()() 只 只 只 只 ()% 实验组 10 7 70 61 32 29 8171 52146? 47154 对照组 10 8 80 62 32 30 7175 51161? 48139 由表6可见, 两组雌鼠的怀孕率、每胎产仔数及子代性比率均无明显差别.— 表明 P 3菌液对小白鼠生殖无不良影响. 新生仔鼠的形态发育情况: 见表7. 表7 实验组与对照组新生仔鼠的形态发育情况 外观形态 出生仔鼠数 体重 身长 尾长 组别 { { { ()只 ((()))???()()XSD XSD XSD 正常 % 异常 % 实验组 163?0124 3146?0138 1136?0184 161 100 0 对照组 156?0128 3136?0142 1152?0146 162 100 0 从表7可见, 两组新生仔鼠的形态发育情况无明显差异. 表明 —3菌液对胎鼠形态发 P 育无不良影响. 21213 仔鼠生长的观测: 仔鼠出生存活率和哺乳成活率: 见表8. 表8 实验组与对照组仔鼠出生存活率和哺育成活率情况 出生时活 产后4天 仔21天断乳时 出生存活率 哺乳成活率 组别 仔鼠数 鼠存活数 仔鼠存活数 ()()% % ()()()只 只 只 实验组 61 56 52 9118 9218 对照组 62 55 50 8817 9019 从表8可见, 实验组的仔鼠出生存活率和哺育成活率均略有大于对照组的趋势. 仔鼠体重增长情况: 见表9. 表9 实验组与对照组仔鼠体重增长情况 1, 2天 10天 20天 30天 组别 动物数平均体重动物数平均体重动物数平均体重动物数平均体重 ()()()()只 只 只 只 () () () () gggg 实验组 163?0124 112?0184 146?0196 146?1120 16111861 54 52 52 对照组 156?0128 186?0192 182?0186 184?1112 15101662 52 50 50 从表9可见, 实验组仔鼠的体重增长有略大于对照组的趋向. 3 讨论 当今世界, 人口日益增长, 加上人们生活水平不断提高, 对日常生活食物的需求量增加, 传统的动植物蛋白食品已经不能满足需要. 要改变这一局面, 除靠发展农牧渔业 外, 另开辟食物、 饲料的新来源, 探讨食物人工合成, 更显得迫切和重要. 利用光合细 () 是由蛋白菌生产单细胞蛋白 是开辟蛋白质来源的一条有效途径. 光合细菌 , SC P SC P 质、 脂肪、 碳水化合物、 核酸以及非蛋白质的含氮化合物、 维生素和无机化合物等混合组成的细胞质团. 它含有约65% 的蛋白质和大量的必需氨基酸, 是一种优质蛋白源. 还 可作辅酶成分. 它们与核酸合成有含有多种族维生素及泛酸、叶酸等生理活性物质, B 密切关系; 能参与机体神经组织的代谢并促使血液的形成; 促进动物生长发育. 作为动物的蛋白饲料及添加剂, 用于水产养殖、喂养禽畜都有明显促进生长发育的效果. 此外, 其中含类胡萝卜素也极为丰富, 目前, 已能从光合细菌中提取30种类胡萝卜素, 它可作 为天然色素的良好来源. 在光合细菌类中, 有的菌还具有一定的医药作用. 由此可见, 光 合细菌的开发利用的研究, 具有广阔的前景. 光合细菌作为食用性的开发研究, 必须具有安全性, 要有科学验证它对高等动物和 人体不具致毒作用和生殖遗传影响. 本研究的结果表明, 从福州沟泥中所分离出来的光 合 细菌 —3 菌, 系属于红螺菌科, 以及由 —3 菌再分离纯化的嗜酸红假单胞菌P P () () , R h od op seu d om on a s a c id op h ila 对哺乳动物 小白鼠无致毒、致病作用, 对生殖、生 长无不良影响, 一般不具潜在性危害, 具备安全性. 因此, 可用于人的食用蛋白、 食用色素和医药等方面开发研究. 但光合细菌种类很多, 不同菌的安全系数是否存在差异, 尚 待更深入地对不同菌的生理毒性和生殖遗传毒性进行研究, 并通过选育菌种, 改进培养 条件, 从而解决生产开发和安全利用的问题. 致谢: 本院叶冰莹同志参加染色体检查的实验工作, 谨此致谢. 参考文献 刁虎欣, 梁风来等. 光合细菌及其应用. 北京: 中国农业科技出版社, 19911 1 刘如林, 朱章玉, 俞吉安, 林志新等. 光合细菌的研究及其应用. 上海: 上海交通大学出版社, 1991. 2 () 韩静淑. 光合细菌的开发和利用. 应用微生物, 1983 16: 1, 4 光合细菌应用的研究及其3 () 周晓云. 展望. 工业微生物, 1983 1: 20, 27 4 ()() 5 许洁. 光合细菌的某些生物学性状 . 水产科学, 1993, 12 2: 27, 30 , . . 8. : 6 B uch anan R E G ibbo n s N EB e rgeyπs M anua l o f D e te rm ina t ive B ac te r io lo gyth edB a lt im o re . , 1974.T h e W illiam s & W ilk in s Co 7 НолтJ G, K r ieg N R , Snea th P H A e t a l. B e rge rπs M anua l o f D e te rm ina t ive B ac te r io lo gy. 9th ed. : . , 1994.B a lt im o reT h e W illiam s & W ilk in s Co , , . 8 S te re so n A F GM o en ing N W eck e sse r JR ad iop ro tec t ive and hom opo it ic effec t o f som e lipopo ly sac2 () ch a r ide s f rom R ho do sp ir illaceae sp ec ie s in m ice. E xp e r im en t ia, 1981, 37 12: 1331, 1332 福建师范 9 光合细菌 —3作为几种浮游动物与鱼类饵料添加剂的试验. 尤玉博, 曾焕泰, 陈惠年等.P () () 大学学报 自然科学版, 1992, 8 2: 103, 108 魏志荣, 陈瑶湖, 陈秋锦. 简介光合细菌及其在水产养殖上之应用. ( ) 10 中国水产 台湾, 1988() 432: 13, 20 伊玉华. 光合细菌在对虾养殖上的应用. 大连水产学院学报, 1990, 5 () 11 1: 66, 69 黄皓. 光合细菌在水产养殖上应用的研究. 湛江水产学院学报, 1990, () 10 1: 58, 61 12 13 张道南, 孙其焕,陈乃松等. 红螺菌科光合细菌的分离培养及其作为鱼类饵料添加剂的初步研究. () 水产学报, 1988, 12 4: 367, 369 李光友, 于义德, () 姜玉香等. 光合细菌作为对虾育苗期饵料添加剂试验. 海洋科学, 1993 1: 52 14 , 54 A Tox ic ity Te st of Pho to syn the t ic Ba c ter ia on the M ice an d O bserva t ion on Its Reproduc t ion an d Grow th Zhan g Sh ij in g Zen g Huan ta i Chen Hu in ian Y ou Y ubo ()B ioen g in ee rin g C ol leg e - 3 A bstra c t P ho to syn th e t ic b ac te r ia P w a s iso la ted f rom th e d itch πs m u d co llec ted , . in F u zho u F u jianC u ltu red b ac te r ia l so lu t io n an d it s pow de r w e re fed to th e m ice in ex 2 . p e r im en ta l g ro up sT h e to x ic ity te st o f P SB o n m ice w a s stu d ied an d th e rep ro du c t io n . - 3 an d g row th o f m ice w a s o b se rvedT h e exp e r im en ta l re su lt s in d ica te th a t P h a s no t . to x ic ity fo r te sted an im a l an d adve r se effec t s o n it s rep ro du c t io n an d g row thIn gen e ra l . - 3 , , it h a s no t la ten t h a rmP m ay b e deve lop ed an d u t ilized in fo ragefoo d stu ffed ib le .p igm en t an d m ed ic in e , , , , Keyword s p ho to syn th e t ic b ac te r iam o u seto x ic ityrep ro du c t io n g row th