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试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量

2017-09-21 5页 doc 18KB 39阅读

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试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量 试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量 【关键词】 核黄素磷酸钠 摘要:目的 建立核黄素磷酸钠中核黄素的含量测定方法。方法 高效液相色谱法,采用NH2色谱柱,以乙腈0.02mol/L磷酸二氢钾(体积比67?33)用稀盐酸调pH5.3为流动相,荧光检测,激发波长: 445 nm,发射波长: 520 nm。结果 核黄素在0.1092,2.184 μg/mL范围与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为99.1%,RSD为 1.5%。结论 本方法准确...
试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量
试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量 试论HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量 【关键词】 核黄素磷酸钠 摘要:目的 建立核黄素磷酸钠中核黄素的含量测定方法。方法 高效液相色谱法,采用NH2色谱柱,以乙腈0.02mol/L磷酸二氢钾(体积比67?33)用稀盐酸调pH5.3为流动相,荧光检测,激发波长: 445 nm,发射波长: 520 nm。结果 核黄素在0.1092,2.184 μg/mL范围与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为99.1%,RSD为 1.5%。结论 本方法准确,灵敏,快捷。 关键词:核黄素;核黄素磷酸钠;HPLC Abstract: Objective To develop the assay methods of riboflavin in riboflavin sodium phosphate. Methods HPLC method was used to determine riboflavin in riboflavin sodium phosphate with NH2 column. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate (67?33)(adjusted the solution with hydrochloride acid to pH 5.3). The fluorometric detector, excitation wavelength: 445 nm, emission wavelength: 520 nm. Results Riboflavin had a good linearity(r=0.9999) within 0.1092,2.184 μg/mL. The average recovery was 99.1%, with the RSD of 1.5%(n=5). Conclusions The method is accurate, sensitive and rapid. Key words:riboflavin; riboflavin sodium phosphate; HPLC 核黄素磷酸钠中国药典 ,、美国药典,2,、英国药典,3,均有收载。中国药典没有对有关杂质进行,1 测定,美国药典和英国药典均采用非极性的C18柱进行分离测定。但由于核黄素的极性小,保留时间较长,整个分离分析约需45 min,另外峰较宽,检测灵敏度较低。本文采用高效液相色谱法对核黄素磷酸钠的有关杂质核黄素进行含量测定,采用极性的NH2柱,用荧光检测,核黄素的保留时间约2.9 min,峰锐,大大缩短了分离分析的时间,方法灵敏,结果准确。 1 仪器与试药 岛津LC―10AT液相色谱仪,带SIL―10AT自动进样器,RF―10AXL荧光检测器,Classvp5.0色谱工作站。 核黄素对照品为美国药典参考(USP R.S.)由广州药物研究中心提供。核黄素磷酸钠,批号: 03704(由顺德南方生物制药有限公司提供);批号: 040118― 1、040118―2(由珠海生物化学制药厂提供)。 乙腈为色谱用试剂,磷酸二氢钾为分析纯试剂,稀盐酸按中国药2017年版二部配制,水用纯水器制备的高纯水。 2 方法与实验 2.1 溶液配制 2. 1.1 核黄素对照贮备液的制备 取核黄素对照品约10 mg,精密称定,置100 mL棕色量瓶中,加36%盐酸0.2 mL使溶解后,加水稀释至刻度,摇匀,备用。 2. 1.2 对照品溶液的制备 精密量取核黄素对照贮备液3 mL,置25 mL棕色量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,精密量取2 mL,置20 mL棕色量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。 2. 1.3 供试品溶液制备 取本品约10 mg,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加水6 mL使溶解后,加流动相稀释至刻度,摇匀,精密量取2 mL,置20 mL棕色量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇篮匀。 2.2 测定方法 2.2.1 色谱条件 色谱柱: Nucleosil NH2 5 μm (150 mm×4.6 mm);流动相: 乙腈0.02 mol/L磷酸二氢钾(67?33)用稀盐酸调pH5.3;流速: 1.0 mL/min;荧光检测,激发波长: 445 nm;发射波长: 520 nm。 在上述色谱条件下,分离核黄素和核黄素磷酸钠的色谱图见图1。 2.2.2 测定法 精密量取对照品溶液与供试品溶液各50 μL,分别注入液相色谱仪,色谱图,按外标法以峰面积计算核黄素的含量。 2.3 方法验证 2.3.1 专属性试验 取本品,照“2. 1.3”项下方法操作,测定。供试品溶液呈现与对照品溶液主峰保留时间、峰形一致的色谱峰。经供试品溶液与对照品溶液混合分离,以及调整流动相再分离,核黄素对照品主峰与供试品呈现相应的色谱峰始终重叠,峰形也没广东药学院学报,2017,22 (1)第1期 邓洁雄.HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量有改变,证实供试品呈 现与对照品主峰保留时间一致的色谱峰为核黄素的色谱峰。 2.3.2 标准曲线绘制 精密量取核黄素对照品贮备液3 mL,置100 mL棕色量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,分别精密量取 1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL,各置25 mL棕色量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,测定。以峰面积(A)为横座标,相应的质量浓度(ρ)为纵座标作图,求得一元线性回归方程: ρ=2.5664×10-7A-00042257,r=0.9999(n=6)。可见核黄素在0.1092,2.184 μg/mL浓度范围与峰面积呈良好的线性关系。 2.3.3 重复性试验 制备两份对照品溶液,每份进样3次,结果核黄素的平均响应值为2.5609×10-7,RSD=0.7%。 2.3.4 加样回收试验 取已测定核黄素含量的核黄素磷酸钠约8 mg,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,制备6份,其中5份分别精密加入核黄素对照品贮备液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,按供试品溶液制备自“加6 mL水……”起,同法操作,测定。按加样回收计算回收率,结果见1。表1 加样回收测定结果(略) 2.3.5 样品测定 按对照品溶液的制备与供试品溶液的制备和测定方法,测定3批样品,结果见表2。表2 样品测定结果(略) 3 讨论 3.1 从样品色谱图可见,除核黄素和核黄素磷酸钠主峰外,在2. 5、4. 9、5. 3、6. 2、15. 6、20.3 min还可见分出6个色谱峰,这与核黄素磷酸钠存在核黄素二磷酸盐和不同取代位的单磷酸盐相关。对于它们的归属,由于缺少对照品,有待进一步研究。 3.2 本文的色谱分离,主要参考“注射用水溶性维生素”(国家卫生部药品标准)的色谱条件,经调整选定。实验表明,增加流动相中乙腈的量,可改善核黄素峰与相邻未知峰的分离,但核黄素磷酸钠的保留延长,且与相邻峰的分离变差。在选定的色谱条件下,各组分的分离效果较好。 3.3 核黄素磷酸钠中核黄素的含量测定属于杂质的含量测定,参考文献,4,经过实验,核黄素的最低定量限按信噪比10?1计算为0.03μg/mL。如按本实验能准确精密测定的直观评价则为0.1μg/mL。 3.4 测定3批样品,含核黄素均低于美国药典和英国药典不得过6.0%的要求。 (本文得到广州市药品检验所胡家炽主任药师指导,特此致谢!) 参考文献: ,1,国家药典委员会.中华人民共和国药典: 二部,S,.北京: 化学工业出版社,2017: 60 1. ,2,United States Pharmacopeial Convention.USP 27,S,.USA:Board of Trustees,2017: 1646. ,3,British Pharmacopoeia Commission.Bp 2017,S, UK:HMSO,2017: 1623. ,4,ICH 指导委员会.药品注册的国际技术要求 ,M,.北京: 人民卫生出版社,2017.50.
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