20S-原人参三醇抗柯萨奇B3病毒作用及机制的初步研究
20S-原人参三醇抗柯萨奇B3病毒作用及机制的初步研
究
暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文 摘 要
目的:
研究 20S-原人参三醇抗柯萨奇 B 病毒(coxsackievirus B ,CVB )的活性 3 3 3
作用,并对其作用机理进行初步探讨,为抗 CVB 作用机理的进一步研究奠定
基
3
础,并为新型的抗 CVB 药物的开发提供理论依据。
3
方法:
体外实验方法
1.应用 MTT 法检测 20S-原人参三醇对 Hela 细胞,SD 大鼠乳鼠心肌细胞 的毒性作用。
2.应用细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,MTT法检测 20S-原人 参三醇的抗 CVB 的活性作用。
3
3.应用 CPE法,根据病毒的复制周期采用三种不同的加药方式在细胞水平
探讨 20S-原人参三醇抗 CVB 的作用机理。
3
4.应用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡,检测 20S-原人参三醇对 CVB 感 3
染的 Hela 细胞周期影响,以及检测 20S-原人参三醇是否能抑制 CVB 引起
的细
3
胞凋亡。
5.应用荧光定量 PCR(Real-Time PCR)检测 20S-原人参三醇对 CVB 的 3
VP1 与 5’UTR基因的影响。
6.应用蛋白质组学技术研究与 CVB 致病有关的蛋白质以及 20S-原人参三 3
醇抗 CVB 的相关蛋白。
3
体内实验方法
1.构建急性病毒性心肌炎的模型。
2.20S-原人参三醇对小鼠急性病毒性心肌炎的模型的影响。主要观察 20S- 原人参三醇对急性病毒性心肌炎小鼠的心指数,心脏病毒滴度,心肌酶,心肌
病
理切片(HE染色)病变程度的影响。
3.应用透射电子显微镜观察 20S-原人参三醇对急性病毒性心肌炎小鼠心肌
的超微结构的影响。
结果:
1.20S-原人参三醇在体外 Hela 细胞和心肌细胞上均有明显的抗 CVB 的作 3
I暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
用,IC 分别是 2.7μg/ml 和 3.4μg/ml,TI 分别为 14.8和 7.4,而阳性
药病毒唑的
50
TI 值为 3.8和 2.4。
2.20S-原人参三醇对 CVB 病毒具有直接杀灭作用,其在细胞水平抗 CVB 3 3
作用可能是通过干扰病毒的吸附、进入,影响病毒的复制来实现。 3.CVB 能明显引起 Hela细胞的凋亡,而在 20S-原人参三醇治疗组 20S-原 3
人参三醇能抑制 CVB 引起的细胞凋亡,且能将细胞周期恢复接近正常状态。 3
4.荧光定量 PCR 分析显示 20S-原人参三醇对 CVB 的 VP1 和 5’UTR 基因 3
mRNA表达具有明显抑制作用,抑制率分别是 96.21%和 98.47% 。 5.CVB 能够上调细胞色素 C,这可能与 CVB 引起细胞凋亡有关,在 20S- 3 3
原人参三醇治疗组细胞色素 C 是下调的,而且 20S-原人参三醇能上调抗凋
亡蛋
白热休克蛋白 27。
6. 在 CVB 病毒性心肌炎模型上,20S-原人参三醇高、中两个剂量组的心
3
指数较病毒对照组减小,同时能显著降低心肌组织中病毒滴度,20S-原人参三醇
高、中、低三个剂量组能明显降低动物血清中 CK和 LDH的含量。7.20S-原人参三醇能较好的改善心肌的情况,在 20S-原人参三醇的高剂量
和中剂量组没有发现有炎性细胞的侵润及心肌细胞的坏死和变性,治疗病毒性心
肌炎的效果优于病毒唑。
8.CVB 能引起心肌细胞的凋亡,而 20S-原人参三醇的高剂量和中剂量组
3
没有发现心肌细胞核出现凋亡的现象。
结论:通过体内体外药效学实验发现 20S-原人参三醇具有较好的抗 CVB 的作
3
用,其抗 CVB 作用机制有以下可能:(1)干扰 CVB 感染周期中的早期吸附
3 3
阶段,同时对已进入细胞的病毒的复制有抑制作用,并且对病毒具有直接杀灭作
用。(2)20S-原人参三醇抑制 VP1 和 5’UTR转录。(3) 20S-原人参三醇抑
制
CVB 引起的细胞凋亡。
3
关键词:CVB ; 病毒性心肌炎 ; 20S-原人参三醇;凋亡
3II暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
ABSTRACT
Objective:
In order to examine the antiviral effect of 20S-protopanaxtriol against
coxsackievirus B CVB and assess its potential for clinical applications, antiviral
3 3
activity and mechanism experiments of 20S-protopanaxtriol were carried out in this
studyMethod:
In vitro experiments
1. MTT method was carried out to determine the 50% toxic concentration of
20S-protopanaxtriol on Hela cells and neonatal SD rat’s myocardiocytes2. CPE method and MTT method were used to determine the antiviral activity of
20S-protopanaxtriol3. CPE method was applied to study the antiviral
mechanism of
20S-protopanaxtriol by three action modes4. Flow cytometry was used to analysis of cell cycle and apoptosis ,examining
whether 20S-protopanaxtriol effect on Hela cell’s cycle, as well as
the detection of
20S- protopanaxtriol Whether or not inhibits CVB -induced apoptosis3
5. Fluorescence quantitative PCR Real-Time PCR was applied to study the20S-protopanaxtriol effects on the expression of CVB ’s VP1 and 5’-UTR mRNA3
6. Proteomics technology research was used to analysis of the protein of CVB
3
disease-related and the protein of 20S-protopanaxtriol antivirus-associated
In vivo experiments
1. Building a model of acute viral myocarditis2. To study 20S-Protopanaxtriol impacts on acute viral myocarditis, we mainly
observed the cardiac index, heart virus titer, myocard enzyme and histologicchanging3. Transmission electron microscopy was applied to study the ultrastructure of
myocardiumResults:
III暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
1. This observation indicated that 20S-protopanaxtriol had excellent antiviral
activity on Hela cells and myocardiocytes in vitro. the IC5050% inhibiting
concentration of 20S-protopanaxtriol on Hela cells and myocardiocytes for CVB3
were 2.7 μg/ml and 3.4 μg/ml respectively; and the therapeutic
indexTI were 14.8 and
7.4 respectively2. Results indicated that 20S-protopanaxtriol affected on early viral adsorption,
penetration and inactivated CVB directly; these are possible ways to play its role in
3
anti-CVB at Cell level
3
3. CVB could cause apoptosis of Hela cells, and in the treatment group the
3
20S-protopanaxtriol inhibited apoptosis induced by CVB , and could nearly restore
3
cell cycle status to normal
4. The results of the inhibition rate of 20S-protopanaxtriol on CVB ’s VP1 and
3
5'UTRmRNA were 96.21% and 98.47% respectively5. CVB can upregulate the expression of cytochrome C, which may be related to
3
CVB caused apoptosis, in the 20S-protopanaxtriol treatment’s group
cytochrome C
3
was downregulation, and 20S-protopanaxtriol can upregulate the expression of heat
shock protein 276. On viral myocarditis model 20S-protopanaxtriol could obviously reduce ardiac
index,heart virus titer and myocard enzyme7. 20S-protopanaxtriol could better improve the cardiac condition; there is no
infiltration of inflammatory cells and myocardial cell necrosis and degeneration in the
400mg/kg and 200mg/kg treatment groups, and its effection is better than ribavirin8. CVB can lead to myocardial cell apoptosis, and in the 400mg/kg and
3
200mg/kg treatment groups there was no myocardial cell
apoptosisConclusion:
In conclusion, 20S-protopanaxtriol possessed antiviral activities against CVB in
3
vitro and in vivo. The possible mechanism might be as follows: 1 affect
on early viral
adsorption, penetration and inactivated CVB directly; 2 inhibit CVB ’s VP1 and
3 3
5'UTRmRNA;3it inhibited the apoptosis which caused by CVB
3.
IV暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
Key Words: Coxsackievirus B ;Virus
myocarditis;20S-protopanaxtriol;Apoptosis
3
V暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
英文缩略语表
英文缩写 英文全称 中文全称
BW Body weight 体重
cDNA Complementary RNA 互补 RNA
CPE Cytopathic effects 细胞病变
CVB Coxsackievirus B 柯萨奇 B3病毒
3 3
CK Creatine phosphpkinase 肌磷酸激酶
DMC Dilated cardiomyopathy 扩张型心肌病
DMEM Dulbecco’s Modified Eargle’s Medium Dulbecco氏改进的 Eargle 氏培养基
DMSO Dimethylsulphoxide 二甲基亚砜
2-DE Two-dimensional gel eletrophoresis 二维电泳 EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 FCS Fetal calf serum 胎牛血清
HW Heart weight 心脏重量
HW/BW The heart-to-body weight ratio 心指数 IC 50% inhibiting concentration 半数抑制浓度 50
LDH Lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶
MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-y-2-5- 四甲基偶氮唑蓝 diphenytetrazolium bromide mRNA message RNA 信使 RNA
NBCS New-bron calf serum 新生牛血清
OD Optical density 光密度
PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 RBV Ribavirin 利巴伟林
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain 逆转录-聚核酶链反应
reaction
TC 50% toxic concentration 半数毒性浓度 50
TCID 50%tissue culture infective dose 半数组织培养感染量
50
TI Therapeutic index 治疗指数
VMC Virus myocarditis 病毒性心肌炎 VI暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文 目 录
中文摘要 I
ABSTRACT..III
英文缩略语表..VI
目录. VII
绪论..1
1 柯萨奇 B 病毒与病毒性心肌炎的研究进展.1 3
2 三七皂苷研究现状.5
第一章 20S-原人参三醇体外抗 CVB 的活性作用及机制研究..8
3
1 实验
..8
1.1 受试药物..8
1.2 动物.8
1.3 细胞.8
1.4 柯萨奇 B 病毒.8
3
1.5试剂及仪器..8
2 实验方法..9
2.1 体外药效学实验..9
2.2 20S-原人参三醇体外抗 CVB 作用机制实验..12
3
3 统计学处理..16
4 实验结果16
4.1 药物对宿主细胞的毒性实验结果..16 4.2 药物抗 CVB 的活性实验结果.16 3
4.3 三种不同加药方式的实验结果19 4.4 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡结果20 4.5 20S-原人参三醇对 VP1 和 5’UTRmRNA抑制率.23
5 讨论..23
6 本章小结24
第二章 20S-原人参三醇抗萨奇 B 病毒的蛋白质组学研究25
3
VII暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文 1 实验材料25
1.1 受试药物25
1.2 细胞..25
1.3 柯萨奇 B 病毒..25
3
1.4 主要试剂和仪器25
2 实验方法27
2.1 双向凝胶电泳技术路线27 2.2 常用溶液的配制28
2.4 固相 pH梯度双向凝胶电泳..29 2.5 银染:.29
2.6 凝胶图像分析.30
2.7 差异蛋白质点的质谱分析..30 2.8 数据库查询..30
3 实验结果31
3.1 CVB3 病毒对照组和 20S-原人参三醇组总蛋白质的双向凝胶电泳图
谱..31
3.2 差异表达蛋白点肽指纹谱鉴定31 4 讨论..35
5 本章小结36
第三章 20S-原人参三醇体内抗 CVB 的活性作用及机制研究..38
3
1 实验材料38
1.1受试药物.38
1.2 细胞..38
1.3 柯萨奇 B 病毒..38
3
1.4 实验动物38
1.5 试剂和仪器..38
2 实验方法39
2.1 病毒感染量的确定..39
2.2 分组和给药方法39
2.3 标本采集39
VIII暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文 2.4 血清心肌酶检测39
2.5 心肌组织病毒滴度测定39
2.6 形态学检测..40
2.7 电镜标本制备.40
3 统计学处理..40
4 实验结果40
4.1 20S-原人参三醇对 CVB 致小鼠急性病毒性心肌炎模型的影响40
3
4.2 VMC小鼠心肌组织病理学改变..43 4.3 VMC小鼠心肌组织超微结构改变.44 5 讨论..47
6 本章小结47
全文结论.49
本研究的创新点.50
展望51
参考文献.52
附录57
硕士期间撰写投寄论
文„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..62
致
谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..63IX暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
绪 论1 柯萨奇 B 病毒与病毒性心肌炎的研究进展
3
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)属于小 RNA 病毒(Picornavirus)科,肠道病毒
(Enterovirus)属,是无包膜、衣壳呈 20 面体立体对称的正链 RNA 病毒,由一条单股正
义 RNA及四种结构蛋白即 VP1-VP4 组成。能导致无菌性脑膜炎、流行性胸痛、心肌炎、
心包炎、胰腺炎、手足口病等多种疾病。柯萨奇病毒根据在新生鼠中引起的病理状态不同
而分为 A、B 两族,其中 A 族含有 24 个亚型,B 族包括 6 个亚型。柯萨奇
B 病毒是病毒
3
性心肌炎的昀主要病原体。近 50 年来,病毒性心肌炎几乎就是柯萨奇 B 族病毒感染的代
[1] [2]
名词 。尽管据报道很多病毒都可引起病毒性心肌炎,如流感病毒(inflenza virus) ,细
[3] [4]
小病毒(parvovirus) ,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus) 和人类免疫缺陷病毒(human
[5]
immunodeficiency virus) ,但柯萨奇 B 病毒还是病毒性心肌炎昀主要的致病原因。病毒
3
性心肌炎是扩张型心肌病的成因之一。扩张型心肌病是由于动脉壁扩张,而导致充血性心
力衰竭,病程长,通常需要心脏移植。前人的研究结果表明,单纯的柯萨奇病毒感染与扩
[6]
张型心肌病之间有很密切的联系(P<0.001) 。Cheng 的临床研究表明,约有三分之二
的无明显症状、但经心肌活检发现有病毒基因组的患者,会发展为扩张型心
肌病,并有部
[7]
分需要心脏移植 。
[8]
在病毒性心肌炎小鼠模型上的研究结果表明,病毒性心肌炎病程可以分为三个阶段 :
第一阶段是初期由病毒侵入心肌细胞所引起的直接破坏作用;第二阶段是由病毒引起的心
肌损伤而引发的自身免疫反应;第三阶段即发展为扩张型心肌病。这三个阶段并不是截然
分开的,它们互相重叠,第一、第二阶段又能在第三阶段重复出现,这使得病毒性心肌炎
的病程长,而且发病机制异常复杂。病毒性心肌炎的发病机制可能与以下四个方面有关。
(一) 柯萨奇病毒对细胞的直接作用
[9]
柯萨奇B 病毒是感染性心肌炎昀常见的病原体 。病原体的直接损伤在心肌炎的发病
3
过程中起重要的作用。在急性感染期,许多病原体的滴度都很高,病毒扩散可以引起病毒
[10]
血症,因此组织病理学诊断发现心肌细胞变性死亡和周围炎性细胞的反应 。Badorff等人
发现纯化的柯萨奇病毒蛋白酶2A在被感染的心肌细胞中可以分解为抗肌萎缩糖蛋白复合
物,进而损伤心肌细胞的骨架结构并导致心肌功能的障碍。从而提示这种复合物可能在急
性病毒性心肌炎的发生发展中有重要作用。Taylor发现多聚腺苷酸A结合蛋白(Poly
1暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
Abinding protein,PABP)在感染后明显上调。PABP在介导真核细胞基因的翻译中有重要
作用,存活的细胞需要高水平的PABP来提高蛋白质的翻译以促进心肌细胞的修复和正常
心肌细胞的活性和完整性。急性心肌炎如何发展为慢性心肌炎?心脏被认为是分裂后的组
织,但一部分心肌细胞可以保持DNA的大量复制状态而不经历分裂,使DNA的倍数增加。
另外,心脏中还有许多其他类型的细胞,例如,成纤维细胞和内皮细胞,比心肌细胞更容
易分裂。因此,柯萨奇病毒可能先感染这些分裂的细胞,随后感染心肌细胞,建立持续或
[11]
隐性感染而导致了慢性疾病 。近来的研究显示,细胞周期可以影响病毒感染细胞和在
细胞内复制的能力。柯萨奇B 病毒在细胞的G1和G1/S期复制,G0或G2/M期复制减少。一
3
种可能是病毒仅在G1和G1/S期可以感染细胞,另一种可能是病毒本身可以诱导细胞循环
[12]
。在脊髓灰质炎病毒感染细胞时发现,脊髓灰质炎病毒的5’非翻译区包含核糖体插入位
点(internal ribosome entry site,IRES),可以与细胞周期的调控蛋白结合,调节脊髓灰质
炎病毒蛋白的表达; 一些IRES可以识别细胞周期的状态。细胞中的mRNA可以识别IRES,
[13]
它们编码的基因产物与细胞周期有关 。病毒感染静止期的细胞,由于病毒的复制不活跃,
[14]
可以造成潜伏感染,引起慢性心肌炎 。近来报道, P21鸟苷三磷酸酶激活蛋白(RasGAP)
水解的产物丝裂原活化蛋白激酶的活性在慢性心肌炎的进展中起重要的作用。丝裂原活化
的蛋白激酶通路是不同病毒调控细胞增生和活性的作用机制。肠道病毒复制时,丝裂原活
化蛋白激酶的活性参与了细胞间钙离子的动员,可能破坏了感染的心肌细胞的形态和生理
[15]
作用 。
(二)心肌细胞的凋亡与病毒性心肌炎
细胞凋亡事实上是一个由遗传因素控制的,具有特定形态学和生物化学形式的程序化
细胞死亡。通过细胞凋亡,可以清除一些恶性化的细胞以及病毒感染细胞等,同时通过干
预细胞凋亡,使维持机体正常功能的细胞得到保护。一旦调控细胞凋亡的信号途径遭破坏,
可引起一系列疾病,通过细胞凋亡及其机制的研究,可以阐明发病机制,探索疾病新的治
[16] [17]
疗方法 。在病毒性心肌炎发生中存在心肌细胞凋亡现象,Kyko等 随机选取死于急性心
肌炎的33个尸体解剖,检测到了凋亡的DNA片段和活化的caspase-3。心肌细胞凋亡在人类
严重的急性心肌炎中是昀常见的心肌损伤机制,而且在急性病毒性心肌炎中,心肌细胞的
[18] [19]
高凋亡率与心力衰竭的进展有关 。在动物模型实验中,王永祥等 探讨柯萨奇病毒B
3
感染与心肌细胞凋亡的关系,将CVB 接种Balb/c小鼠,动态观察病毒感染后心肌病理改变
3
和病毒滴度,并用转移酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记(transferase
mediate dUTP
biotin nick end labeling,TUNEL)方法检测凋亡的心肌细胞。其研究结果显示接种病毒后
2暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
第3天和第5天光镜观察可见心肌纤维崩解、断裂;第9天和14天间质纤维增生,填充坏死
心肌吸收后的间隙。接种后3~9天心肌内可分离到病毒,第7天病毒效价达高峰,第9天下
降,第14天分离不到病毒;接种后3~14天在心肌内检测到凋亡细胞,凋亡细胞数量呈逐
渐增加趋势。研究提示,柯萨奇病毒B 型感染Balb/ c小鼠可以引发心肌细胞凋亡,心肌细
3
胞凋亡是病毒性心肌炎的致病机理之一。细胞凋亡是一个非常复杂的生理和
病理过程。目
前发现,在病毒性心肌炎中,对细胞凋亡具有调控作用的基因主要有bcl-2、Bax、p53、fas
[20]
等原癌基因。另有Joo等 研究在病毒性心肌炎发生期间肠道病毒感染与心肌组织凋亡的
关系,发现亲心肌株CVB 比非亲心肌株CVB 导致更严重的凋亡;病毒复制局限于炎症和
3 3
凋亡损伤的心肌组织中;在病毒感染后的早期就有凋亡的发生;Bax与CVB 所致的心肌炎
3
的凋亡过程有关。心肌细胞凋亡参与了心肌炎的病理过程,可诱导心肌病变加重。
(三) 免疫机制与病毒性心肌炎病毒感染诱发的免疫反应与病毒性心肌炎的组织损伤有着密切的联系。主要是T细胞
[21]
介导的细胞免疫反应、B细胞介导的体液免疫反应以及细胞因子的共同作用 。目前普遍
[22]
认为,病毒感染后机体的免疫反应所致损伤在病毒性心肌炎发病中起重要作用 。细胞免
[23]
疫主要包括T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等,Deguchi等 发现,在急性病毒性心肌炎
阶段,炎性细胞浸润可分为两个时相:第一时相即病毒感染后3~9天,主要为NK细胞和巨
噬细胞浸润心肌并达到高峰;第二时相在病毒感染后7?14天,T细胞替代NK细胞和巨噬
细胞成为主要浸润细胞。在病毒性心肌炎的发病和进展过程中,CTL细胞也起着重要的作
用,它可以清除心肌细胞里已感染的病毒,同时又会引起心肌炎症反应,从而造成心肌损
伤。也有人认为病毒性心肌炎是自身反应性CTL介导的心肌损伤,是自身免疫性疾病。 Huber
[24]
等 用从已感染CVB 后7天的DBA/2小鼠中分离的T细胞与心肌细胞混合后选择性回收与
3
心肌细胞结合的CTL,并将其移植于正常DBA/2小鼠,结果后者发生了严重心肌炎,这提
示CVB3激活的CTL可损伤非感染心肌细胞。 Schwimmbeck等将慢性心肌炎患者和正常人的
外周粒细胞(PBL)分别移植于T细胞和B细胞功能严重缺陷的SCID小鼠体
内,60天后发现
患者PBL移植小鼠的心肌中有患者的CD3+T细胞浸润,且心功能明显下降,而正常人PBL
移植小鼠的心肌无T细胞浸润,心功能也正常,表明慢性心肌炎患者体内存在自身反应性T
细胞。自身反应性CTL可能由病毒感染诱导的新抗原或心脏自身抗原激活产生,Smith等用
可以激活自身免疫反应而引起自身免疫性心肌炎的心肌肌凝蛋白免疫CD4+或CD8+T细胞
剔除小鼠,其心肌炎的发生率及心肌病变程度均比正常小鼠低,提示肌凝蛋白主要通过激
[25]
活T细胞而损伤心肌细胞。另外,Kishimoto等 研究抗体介导的免疫增强作用,在试验?
3暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
中,体外培养表面有Fc受体的巨噬样细胞P388D1,用CVB 感染细胞,再用抗CVB 血清进
3 3
-1 -2 -4 -6
行滴定,发现当抗体浓度为10 ~10 或10 ~10 时,病毒都明显低于对照组,当抗体的浓
-3
度为亚中和抗体浓度时(即10 时),病毒的产生明显升高。在试验?中(即在体试验)
也证实了具有亚中和抗体效应,并且发现用纯化的IgGFab片段或者用热凝集γ球蛋白及Fc
受体特异性抗体阻断细胞表面的Fc受体,可以消除亚中和抗体效应。这些结果提示CVB
3
可以通过抗体的Fc片段与表面有Fc受体的细胞结合而进入细胞内致病。亚中和抗体效应导
致病毒增加的可能机制是适当浓度的抗体可以组成潜在的免疫复合物。这种效应只存在于
CVB 感染,其它病毒未发现。也有研究表示细胞免疫功能紊乱与急性病毒性心肌炎有关
3
[26]
。
细胞因子在细胞免疫和体液免疫中也起着很重要的桥梁作用,由柯萨奇B族病毒引起
的病毒性心肌炎中,其心肌损伤可能是病毒感染引发的免疫反应所致。而细胞因子可能在
[27]
免疫反应中起着重要的作用,但具体的机制并不明确。谢晓燕 研究了心肌纤
维细胞感染
CVB 后检测其细胞因子的产生,她采用的方法是用ELISA方法检测了感染CVB 心肌纤维
3 3
细胞培养上清液IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β和TNF-α的产生。结果发现感染CVB 24小时
3
后IL-6和IL-8即明显升高(P0.01),96小时后IL-1α有所升高(P0.05),IL-1β和TNF-
α无明显变化。IL-8是主要的中性粒细胞刺激和趋化因子,可诱导中性粒细胞在炎症部位
的浸润,且能刺激病毒的复制,因而有人将它视为病毒治疗的靶位,IL-8可能对于心脏有
不良作用。IL-6在炎症反应及机体的免疫应答中均有重要作用,因其可刺激机体的免疫应
答,因而对于机体有一定的保护作用。柯萨奇B族病毒引起的病毒性心肌炎可能是多种细
胞因子综合作用的结果,需要进一步进行研究。
(四) 信号通路与病毒性心肌炎
另外柯萨奇B 病毒引起病毒性心肌炎,随着研究的不断深入发现细胞内信号传导通路
3
在病毒性心肌炎的发病机制中起重要作用。 CVB 感染宿主细胞后能对胞内多种信号传导通
3
路进行调控,这些信号传导通路反过来又能影响病毒在细胞内的增殖,改变被感染细胞的
[28]
病理生理过程 。包括以下四个信号传导通路:1.丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated
kinase,MAPK)是细胞内重要的信号转导系统之一。到目前为止,在哺乳动物中至少发现
了4种MAPK信号通路:细胞外信号调节激酶(Ex-tracellular-signal
regulated protein kinase,
ERK), c?JunN端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) P应激激活的蛋白激酶(Stress-activated
protein kinase,SAPK),p38MAPK,ERK5-BMK1(big mitgen-acti-vated
protein kinase,
BMK1)。心肌中ERK1/2活性水平与心肌中CVB 病毒滴度及心肌炎症严重程度呈正相关。
3
4暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
研究结果表明ERK1/2信号级联的活化可能是CVB 易感性增高的一个决定因素。JNK途径
3
可能由病毒复制及病毒蛋白所激活。因p38MAPK与多种病毒感染有关,在心肌中也有表达,
故推测CVB 感染时也能引起心肌细胞中p38MAPK的活化,并参与病毒复制及病毒对心肌
3
的损伤作用。2.PI-3K/Akt途径:CVB 感染宿主细胞后可出现PI-3K/Akt通路的活化调节病毒
3
复制,同时能减少病毒感染引起宿主细胞的凋亡。 3.NF-KB信号通路:CVB 感染激活NF-KB ,
3
通过调节各种促炎因子的水平影响病毒对心肌细胞的损伤。4.泛素P蛋白酶体信号通路:蛋
白酶体抑制剂减弱CVB 的侵袭力、拮抗凋亡的作用可能是通过抑制病毒RNA的复制和蛋
3
白翻译而实现。虽然细胞内信号传导通路在病毒性心肌炎的发病机制中起重要作用,但其
作用具体的机制并不是很清楚。柯萨奇病毒B 基因组及其变异与心肌的损伤也有密切的关
3
[29]
系 。
综上所述,病毒性心肌炎严重危害人类健康,其机制复杂,目前临床尚无有针对性的
治疗手段。病毒复制过程中的相关酶类如Pro2A、与细胞因子表达密切相关的转录因子如
NF-KB,细胞凋亡相关酶类如caspase-3等都有可能成为治疗柯萨奇B 病毒诱导的病毒性心
3
肌炎药物的新靶点。中药方剂因为兼具抗病毒、调节免疫和增强心功能的多方面作用,而
[30]
应用于临床治疗多年 ,疗效肯定。因此,从中药活性成分中寻找治疗柯萨奇B 病毒诱导
3
的病毒性心肌炎的药物,是我国药学工作者当前面临的机遇及挑战。
2 三七皂苷研究现状
2.1 三七简介三七为五加科(Araliaceae)人参属三七 Panax notoginsen(Burk)//.n 的干燥块
根(见图 1),味甘、微苦,性温,归肝、胃经,具有化瘀止血、活血定痛等功效,主治
体内外各种出血之症、跌打损伤及瘀滞肿痛等。三七是常用的传统中药,为
我国特产,主
产于云南、广西及四川等地,在我国有悠久的临床应用历史。在《本草纲目》、《医门秘
旨》、《跌损妙方》等历史经典医
和《中国医药大词典》、《中华人民共和国药典》等
文献书籍中均有记载,素有‘金不换”、“参中之卫”、“南国神草”等美誉。三七化学
成分类型较多,主要包括皂苷、黄酮、氨基酸、多糖、脂肪酸、脂肪族炔烃类及肽类化合
物等。其中,达玛烷型四环三萜类皂苷被认为是三七的主要生理活性成分,其含量占三七
[31,32]
根总重量的 12% 。迄今为止,从三七不同生长部位中己分离到 50 多个单体皂苷成分,
这些单体皂普成分大多数为达玛烷型四环三萜类皂苷,其结构特点:C 位有角甲基,且为
β-构型,C13位有β-CH13,C17位β-侧链,C-20构型多为 S,此类皂苷根据其位碳上是
否有羟基分为人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷。人参二醇型皂苷的苷元为 20(S)-原人
5暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
参二醇 [20S-protopanaxadiol],人参三醇型皂苷的苷元为 20( S) -原人参
三醇
[20S-protopanaxtriol]。
图 1 三七
2.2 三七皂苷的药理学研究
现代化学和药理学研究发现三七总皂苷在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力等方面的
[33]
药理作用显著优于人参总皂苷 ,且三七总皂苷和部分单体皂苷在血液系统、心脑血管系
[34]
统、神经系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好活性 。
2.2.1 活血补血作用三七根总皂苷能抑制血小板聚集,其主要有效成分为三七中人参皂苷 Rgl 及其他原人
[35]
参三醇型皂苷,它们可能通过提高血小板 cAMP含量而抑制其聚集功能 。单体皂苷 G-Re
能促进红系的发生,同时对巨粒系、粒系、红系混合集落的发生亦有明显促进作用,但对
粒单系造血集落无促进效应。三七皂苷可能通过诱导细胞增加分泌造血因子,从而促进粒
系和红系造血祖细胞的增值。
2.2.2 镇静和镇痛作用
三七皂苷能减少动物的自主活动,表现出有显著的镇静作用,并能协同中枢抑制药的
[36]
作用,这种中枢抑制作用是通过减少突触体谷氨酸含量来实现的 。三七皂苷对化学性和
热刺激性引起的疼痛均有明显的镇痛作用,且三七皂苷是一种阿片肽样受体激动剂,不具
有成瘾的副作用。
2.2.3 保护心肌和抗心律失常作用
三七皂苷对大鼠、家兔、犬的心肌缺血-再灌注损伤有很强的保护作用。三七皂苷能
明显增加 Gs αmRNA表达,增加量与三七皂苷剂量呈显著正相关,并可增强腺苷酸环化酶
[37]
活性,增加 cAMP 生成 。心肌缺血-再灌注能刺激中性粒细胞内 NF-KB 的活化,活化
的 NF-KB 启动中性粒细胞 ICAM1 的表达而参与心肌缺血-再灌注损伤的发生过程;三
七皂苷能抑制中性粒细胞内核因子 NF-KB 的活化,减少细胞间黏附分子表达及中性粒细
6暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
[38] [39]
胞浸润而起到心肌保护作用 。实验显示 ,三七皂苷对各种药物诱发的心律失常均有保
护作用。其机理与 PNS对心肌的直接抑制作用有关,其中三醇组皂苷能明显缩短乌头碱所
致大鼠心律失常的维持时间,减少室性早搏,降低房颤的发生,减少氯仿所致小鼠的室颤
发生率;明显对抗大鼠结扎冠状动脉诱发的缺血性心律失常及再灌注性心律失常,并可使
[40]
缺血再灌注引起的心肌梗塞范围明显缩小 。
2.2.4 降血脂降血压作用
动脉壁内皮损伤可能是动脉粥样硬化的始动因素,而高脂血症可导致血管内皮损伤、
脱落,血小板粘附、聚集。通过体外培养血管平滑肌细胞(SMCS)研究三七皂苷对其保
护作用,发现三七皂苷能明显抑制低浓度高脂血清对 SMCS 的作用,对动脉粥样硬化的发
生、发展及主动脉内膜斑块的形成具有一定防治作用。可能是三七皂苷有较强抗氧化作用,
[41]
与降血脂作用共同构成了三七皂苷延缓或抑制动脉粥样硬化的部分机制 。三七皂苷及
Rg型皂苷均有明显的降血压作用。目前普遍认为三七皂苷是一种钙通道阻滞剂,其扩血管
2 + [42]
机理可能是三七皂苷具有阻断去甲肾上腺素所致 Ca 内流作用 。
2.2.5 抗炎作用
三七皂苷能明显抑制角叉菜胶、巴豆油、蛋清等多种致炎剂所致大鼠足肿胀和小鼠耳
廓炎症,对摘除肾上腺鼠也有一定抗炎作用。三七皂苷对急性炎症引起的毛细血管通透性
[43]
升高、炎性渗出和组织水肿以及炎症后期肉芽组织增生也均有抑制作用 。
2.2.6 抗肿瘤作用
三七皂苷可通过直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡或
[44]
诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强和刺激机体免疫功能等多种方式起到抗肿瘤作用 。三
七单体 Rb1、Rb2、R 可通过对抗肿瘤坏死因子(TNF)引起的恶病质而对肿瘤感染患者
C
[45]
具有保护作用,可较完全地阻止 TNF引起的脂肪细胞形态学变化 。为了开
发和合理应用传统中草药,对三七皂苷进行全面、深入、细致的研究是非常必
要的。本研究目的是研究三七皂苷中的皂苷元 20S-原人参三醇抗柯萨奇 B 病毒的作用及
3
其作用机制。实验主要分为体外药效学和体内药效学部分,机制研究主要采用流式及蛋白
质组学来对其作用机制进行初步的研究和探讨。
7暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
第一章 20S-原人参三醇体外抗 CVB 的活性作用及机制研究
3
1 实验材料
1.1 受试药物
20S-原人参三醇样品由中国科学院昆明植物研究所提供。
1.2 动物
出生 1-3 天 SD大鼠乳鼠,雌雄不限,SPF清洁级,购于广东省动物中心。
1.3 细胞人宫颈癌传代细胞(Hela细胞)引自美国 ATCC。原代培养大鼠心肌细胞,由新生 1-3
天的 SD大鼠乳鼠心脏消化而得。
1.4 柯萨奇 B 病毒
3 柯萨奇 B 病毒 Nacy株,由武汉大学病毒研究所馈赠,在单层 Hela细胞上传代,冻存
3
-7.5
于-80?冰箱中。其病毒滴度用细胞病变(CPE)法在 Hela细胞上检测,所得
TCID 为 10 。
50
1.5 试剂及仪器
主要试剂
新生牛血清、胎牛血清杭州四季青公司
DMEM 细胞培养基干粉 GIBCOBRL公司
病毒唑 广州市市桥药业有限公司
四甲基偶氮唑蓝(MTT) 美国 SIGMA公司
二甲基亚枫(DMSO)美国 SIGMA公司
Hepes美国 AMRESCO公司
胰蛋白酶美国 AMRESCO公司
乙二胺四乙酸(EDTA) 美国 AMRESCO 公司NaHCO 广州化学试剂厂 3NaCl 广州化学试剂厂
Na HPO 广州化学试剂厂
2 4
8暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
KH PO 广州化学试剂厂
2 4
KCl 广州化学试剂厂青霉素 G钠 华北制药股份有限公司 链霉素 华北制药股份有限公司主要仪器设备CO 细胞培养箱HERAERS
2
净化生物超净工作台 HEAL FORCE 96孔细胞培养板 CORNING 酶标自动读数仪BIO-RAD 550 型
24孔细胞培养板 CORNING 分析天平SARTORIUS
高压灭菌锅 SANYO
自动双重纯水蒸馏器 上海申立玻璃仪器公司 电子恒温水浴锅上海森信仪器公司
倒置显微镜 德国 Leica 公司
FACS Calibur 流式细胞仪 美国 Bio-rad公司 普通冰箱青岛海尔电器有限公司
超低温冰箱 日本 SANYO公司
2 实验方法
2.1 体外药效学实验
2.1.1 宿主细胞的培养
(1)细胞培养相关试剂配制
DMEM 培养液:将 DMEM 复合培养基按照
操作溶于三蒸水中,0.22μm
滤膜
过滤除菌,4?冰箱保存。
细胞培养生长液:配制好的 DMEM 溶液每 200ml 中加入经灭活的胎牛血清
至终浓度
9暨南大学 2006 级硕士研究生学位论文
为 10%,同时加 7.5%的 NaHCO 溶液 Hepes 缓冲溶液,调 PH至 7.2-7.4 左右。
3
细胞培养维持液:配制好的 DMEM 溶液每 200ml 中加入 4ml 的新生牛血清至终浓度
为 2%。
细胞消化液:称取 0.5g胰酶(终浓度为 0.25%)和 0.04gEDTA(终浓度为 0.02%)溶
解于 200ml 灭菌 PBS 溶液中,轻晃混匀后,于 4?过夜充分溶解后,过滤除菌分装于小青
瓶中,置-20?贮存。使用前室温溶解后可预热至 37?。
NaHCO 溶液:称取 7.5g(终浓度为 7.5%)溶解于 100ml 三蒸水中,高压高温灭菌后
3
分装于青霉素小瓶,配制细胞生长液时调 pH用。
Hepes 缓冲溶液:取 23.8g Hepes 粉末溶于 60ml 三蒸水中,用 5M NaOH溶液调整 pH
至 7.5-8.0,加水到 100ml,过滤除菌分装,-20?保存备用。
MTT溶液:称取 0.05gMTT粉末溶解于 10ml 无菌的 PBS溶液中(终浓度为 5mg/ml),
0.22μm微孔的滤膜过滤除菌后分装于青霉素小瓶中,4?冰箱保存,且于一
个月内使用。
(2)宿主细胞的培养
Hela 细胞培养:将 Hela 细胞用 0.25%胰蛋白酶消化液消化脱落,加入 5mlDMEM 培
养液反复吹打成单细胞悬液,然后用培养液调整到所需浓度。将细胞加到 96 孔一次性细
胞培养板中,100μl/孔,置 37?、5%CO 培养箱中培养,约 24h长成单层后用于试验。
2
大鼠原代心肌细胞的培养:SD 大鼠新生 1-3 天的乳鼠用酒精棉球消毒胸部皮肤,剪开
胸壁,取出心脏,冷 Hank’s 液中清洗三次,剪成碎块。用 0.1%胰酶溶液消化 2 次,每次
消化 10min,弃去消化液。再连续消化 5 次,每次消化 15min,收集后 5 次的消化液,加
入含 10%胎牛血清的培养液终止消化反应,1000rpm,离心 5min,收集得到的细胞,加入
5
含 10%胎牛血清的培养液吹打成细胞悬液,调整细胞浓度为 10 个/ml。将细胞加到 96 孔