左旋咪唑增强新城疫灭活疫苗和DNA疫苗免疫效果研究（可编辑）

左旋咪唑增强新城疫灭活疫苗和DNA疫苗免疫效果研究（可编辑） 中国农业大学 博士学位论文 左旋咪唑增强新城疫灭活疫苗和DNA疫苗免疫效果的研究 姓名:尹江梅 申请学位级别:博士 专业:生理学 指导教师:王宾 20060601摘要 新城疫是一种急性、高度传染性疾病,主要感染鸟类尤其是禽.因其分布广泛、死亡率高而 对养殖业造成巨大的经济损失。实践中常用油佐剂灭活疫苗免疫动物来预防新城疫的感染,但这 类疫苗有一定的缺点,如诱导的细胞免疫水平较低,副作用较大。因此为了提高新城疫灭活疫苗 的免疫水平,尤其是细胞免疫水平,本研究在小鼠和鸡中评价了改进的左旋咪唑作为佐 剂对新城疫灭活疫苗免疫效果的影响。研究结果表明,与传统的油佐剂疫苗相比,新城疫惦 佐剂疫苗,在不降低体液免疫水平的条件下,能显著提高一、?、细胞增殖和水平, 即能增强细胞免疫水平。进一步研究发现,这种佐剂能诱导姗、共刺激分子 的表达和细胞的 成熟,这表明这种佐剂疫苗可能是通过促进细胞的成熟、激活抗原呈递和共刺激分子表达来 增强免疫反应的,而且这种佐剂的新城疫疫苗能给鸡提供%的保护。这些结果表明了,佐 剂可以增强新城疫灭活疫苗的免疫水平,尤其是细胞免疫水平。 随着疫苗技术的发展,疫苗因其制各简单、且能同时诱导体液和细胞免疫反应等优点而 备受瞩目。本研究利用新城疫病毒株的和基因制备了新城疫的疫苗,同时为提 高疫苗的免疫效果,本研究利用鸡的?表达质粒为分子佐剂和左旋咪唑为化学 佐剂来加强新城疫疫苗的免疫效果,并研究其对免疫效力保护率的影响。结果表明,与 不使用佐剂的疫苗相比。含有和佐剂的疫苗能显著增强体液和细胞免疫反 应,表现在其能增强抗体水平和细胞增殖能力,同时它们也能增强鸡整体的细胞因子,如 ?、一、一、和一的表达,在致死剂量病毒攻击后,免疫后的鸡可以得到 %的保护,而单独疫苗免疫的动物得不到保护。同时,通过实时定量检测攻毒后存活 动物体内的病毒含量还发现,以?和为佐剂与疫苗免疫,在攻毒后鸡体内的病毒含 量最低,这些结果证明?和作为佐剂不仅能协同增强新城疫疫苗的保护率,同时也 有助于降低病毒在体内复制。 免疫方式是影响疫苗免疫效果的另一重要因素。本研究采用疫苗初免,灭活病毒疫 苗加强的方式,来增强疫苗的免疫效果。结果表明,与疫苗组相比,疫苗和灭活病 毒鞋合免疫组产生了更高的、细胞增殖和反应水平;与灭活病毒疫苗组相比,联合免 疫组在末降低体液免疫反应的前提下,显著地增强了细胞免疫水平。结果表明,这种联合免疫方 式在一定程度上可以提高新城疫疫苗的免疫效果。 总而言之,本研究证明了作为佐剂可以增强新城疫灭活疫苗的免疫效果,并为研究佐 剂的作用机制提供了部分理论依据。同时,我们也制备了新城疫的疫苗,并通过?和 的协同作用增强了新城疫的免疫水平和保护率。最后,采用疫苗初疫,病毒灭活疫 苗加强的方式增强了新城疫疫苗的免疫效果。概括来说,本研究分别通过采用新型佐剂和不 同的免疫方式增强了新城疫疫苗的免疫效果,为生产实践奠定了基础。 关键词:新城疫,左旋咪唑,佐剂,灭活病毒疫苗,疫苗,细胞免疫,保护效果 . , . ? . . ., ? ..,,?,. , % .. ... , ’. ,, , . , .,. , 吖 , . ,吖,,, .,% . . . .,. ? ,, .? . .溢 .% . . , . , .: , ,,, , 插图和附表清单 图 新城疫病毒的结构和基因组 图? 佐剂的疫苗免疫/小鼠后的抗体水平 【抗体水平 图卜 十佐剂的疫苗免疫/小鼠后的 图卜 ?法检测佐剂疫苗的细胞因子,和共刺激分子的表达 图卜 疫苗佐剂免疫小鼠和鸡后细胞的增殖 图一 检测佐剂疫苗免疫小鼠的反应 图卜 流式细胞仪检测佐剂疫苗免疫小鼠的细胞 表卜 小鼠细胞因子、和共刺激分子引物序列及条件 表卜 佐剂疫苗免疫后鸡的抗体水平和攻毒后的保护率 图 、基因的克隆 图 一和一?的酶切分析 图 和一重组质粒的酶切分析 图 和?重组质粒的酶切分析 图 质粒的体外表达 ?检测一、?、一和 图 检测?、?、一和一在细胞上清中的表达水 正 图 间接免疫荧光检测、一、一、和?在细胞中的表 达 图 检测不同重组质粒免疫小鼠后血清中抗体水平。 图 不同重组质粒免疫小鼠后淋巴细胞增殖结果 表 不同疫苗对鸡 抗体的影响 图 方法鉴定??质粒的表达 图 不同佐剂的疫苗对鸡细胞增值的影响 图 检测不同佐剂的疫苗对鸡细胞因子表达的影响 圈 不同佐剂对的疫苗的保护效果 图 不同佐剂对攻毒后鸡体内的病毒数量的影响 表一 佐剂对 疫苗的影响实验的分组 表 鸡细胞因子的引物序列和条件 表 荧光定量混合物 表 不同佐剂对鸡 蚰抗体的影响 表 不同佐剂对鸡 抗体的影响 图 和灭活病毒联合免疫对小鼠抗体水平的影响 图? 和灭活病毒联合免疫对细胞增殖反应的影响 图 和灭活病毒联合免瘦对小鼠细胞因子表达的影 响????????????????????????????????????????????????????????一 图? 和灭活病毒联合免疫对小鼠的影响 圉 联台免疫和灭活病毒的鸡的攻毒结果 表一 和灭活病毒联合免疫对鸡抗体的影响 附录 载体质粒图谱 附录 /?载体质粒图谱 附录 的和基因测序结果 缩略词表 新城疫病毒血凝素一神经氨酸酶蛋白融合蛋白 免 小时 微克 ? 微升 咖 酶联免疫吸附测定法光密度值 伴刀豆球蛋白牛血清白蛋白左旋 昧唑 邮 椰 ,一一一一? 一 呈 甲氨蝶呤】吩嗪刺激指数 既 反转录聚合酶链反应 ?脱氧核糖核苷三磷酸 趾州椰 次磺嘌呤磷酸核糖基转移酶 帆一 干扰素 删 ?白细胞自介素一 叶 主要组织相容性复合体 眦互补 脱氧核糖核酸 洲叭町 异硫氰酸荧光素 ????????????????????????????????一 实验主要仪器 兰塑 型呈 堡矍垒整 江苏金坛市医疗仪器厂 气浴恒温振荡器一型 一 德国 / 电子天平 瑞士 型 电子天平 亚美公司日本 微波炉 美国 超纯水仪 ?卜一 苏净集团 超净工作台 上海跃进 一一 恒温培养箱 德国 型 热空气消毒柜 德国水浴箱 美国 ? 德国 台式冷冻离心机 删 美国 台式冷冻离心机 美国 叮 台式冷冻离心机 美国 仪 型 中国北京 水平电泳槽, / 美国 电泳仪 . 美国 垂直电泳槽, . 美国 凝胶成像仪, 干浴块 美国德国 可调恒温水浴器 幔 × 中国上海 温箱 中国哈尔滨 摇床美国 超纯水仪 日本 全自动高压灭菌 美国 超低温冰箱 美国 冻干机 ? 蛋白转移印记仪 美国? 性 美国. 电泳仪 / 美国. 电泳仪 美国. 电泳槽 ? 美国. 电泳槽???????????????????????????????????? 实验主要仪器续 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 时间:?年‖月日 研究?:夕。啦关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此 研究生签名 时间: 阳。年‖月“?日 尹掐 、 导师签名 时间:彩年‘月,日 、多、 ‘中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第一章新城疫和新城疫病毒 第一篇文献综述 第一章新城疫和新城疫病毒 .新城疫概述 新城疫 ,是由新城疫病毒 ,引 起的一种急性、高度传染性疾病,主要危害鸡和火鸡,亦可感染其他禽类、鸟类和人“。年 新城疫首次爆发于英国的纽卡斯尔艾佛顿??和印度尼西亚的爪哇”’”。此 后,在世界范围内发生过几次大的流行”。首次爆发起源于东南亚,并慢慢传播到欧洲,经年 的时间传遍全世界。第二次大流行始于世纪年代后期的中东,到年遍及大部分国家。第 三次新城疫大流行起源于年代的中东,主要侵害鸽,这次流行到年传至欧洲,然后迅速传 遍世界各地。第四次大流行在年代发生于欧洲和亚洲,新城疫从鸽子又传入鸡“。在这几次 新城疫的大流行中,每一次均造成世界养禽业的重大损失。据统计,仅年全世 界就有个国 家报道该病的发生,这次爆发仅捕杀鸡就造成经济损失达万美元,这还不包括其他的花费。 因此,新城疫被世界动物卫生组织列为类传染病,而我国也将其列为一类动物疫病”。 年我国有过类似的报道,但一直至年才证实了新城疫的存在?。尽管如此,到目前为止 新城疫一赢都是我国养禽业危害最严重的禽病之一。为此,许多国家投入大量的人力和物力对此 病进行研究。经过科学工作者多年的努力,尤其是上世纪七十年代后分子生物学的发展,使人们 对已有了较为清楚的认识。 .新城疫病毒 ..新城疫病毒的基本特征 ...新城疫病毒的形态 新城疫病毒由个核苷酸组成,是一条单链病毒。病毒粒子分子质量平均为.。 新城疫病毒粒子呈多形性,成熟的病毒粒子的真径为?,有囊膜的病毒粒子通常里圆形, 囊膜破损后则形态不规则。病毒囊膜表面覆有大小两种纤突,病毒粒子内部为直径约的核 衣壳详见图”。 ..,新城疫病毒的分类 新城疫病毒属于副黏病毒科腮腺炎病毒属 根据分离株的致病性可将新城 疫病毒分为三类:缓发型毒株 ,毒力比较弱,通常不在成年鸡中引起疾病; 中发型毒株 ,能引起鸡的呼吸道疾病,导致幼鸡的死亡;速发型毒株 第页共页中国农业大学博二学位论文 第一篇文献综述第一章新城疫和新城 疫病毒 ,毒力较强,通常很少的剂量就可以引起死亡。根据对不同组织器官的亲 嗜性不同将新城疫病毒分为嗜神经型和嗜内脏型,前者可导致 神经症状和呼吸道损伤,盾者可引起消化道出血“”。 ?蛔单州曲 ?神?? 蝴日 ?朗?蛳“仲州埘删蛔由轴‘懈 确啪甜砷‘ 口?船 ?讲哦 。‘ 一 曲 蛙 ? 。’ ?’?爪 图新城疫病毒的结构和基因组川 ...新城疫病毒的复制 新城疫病毒的复制过程总体上是负链病毒的复制过程。首先新城疫病毒通过血凝素一种经氨 酸酶蛋白的介导而吸附于细胞受体上,然后经过融合蛋白的作用,病毒与宿主细胞膜发生 融合,最后核衣壳复合体进入细胞内,在胞浆中进行病毒的复制。因为病毒为负链,所以必 需在依赖的聚合酶作用下产生正链,参与转录过程。与此同时。由正链复制大 最完整的病毒基因组,参与病毒的装配。病毒的装配发生在胞浆内,合成的病毒蛋白被运到细胞 膜,细胞膜因这些蛋白的整含而被修饰,接着在靠近细胞膜的被修饰区组装核衣壳,以尚不明了 的形式出芽形成病毒粒子““。 第页共页第一嫡文献综述第一章新城疫期颏城疫病毒 中国农监大学博士学位论文 . 舅舞寮 麓寰曼黑寰. .。额城疫病毒的基因及其相应的蛋白 ?舻一 新城疫病毒基因组的结构为 ,分别编码种结构蛋自:核衣壳蛋白 ,、基质蛋白 ,、磷蛋白曲 ,、 融合蛋白 ,、血凝素一神经氨酸酶蛋白嘲. ,斟 和大蛋白 ,基因组 端为 长的弓导序列 , ’端为 或 长的尾随序列 。引导序列及尾随序列为病毒基因组 重要的调控区,在病毒的复制及转录过程中起重要的调节作用。 蛋白为依赖的聚会酶,与核衣壳捆连;蛋白具有血凝素和神经氨酸酶的活性, 构成病毒的大纤突,可使病毒吸附子细胞受体,并通过血凝素和神经氨酸酶这薅种生物活性 破坏受体的功能;为融合蛋白,构成小的表面纤突,参与病毒的穿入、细胞融合和溶血等过程, 作为弓起病毒的囊膜和宿主的细胞膜融合的媒介物;为磷酸化的核衣壳相联蛋白;为基质蛋 白,在的合成和病毒的自身装配中起重要作用?朝。 ...盘凝素一神经氨酸酶嗍 耿蛋白是构成囊膜上较大的纤突样糖蛋自的主要成分,它兼有血凝素和神经氨酸酶两种 活性。的血凝素成分负责识别易感细胞的含唾液羧的受体并吸附上去。神经氨酸酶剡有分解和 破坏受体的能力,并促进新生的病毒粒子从感染的细胞膜上释放。渊糖蛋白还有促进膜融合的功 能九。 蛋白的分予量为,其非活性前体的分子质量为。蛋白近末端的个氨 基酸残基中,第残基在质膜内,第残基是跨膜区,其余个残基为质膜外氨基酸残 基副。的核酸序列分析表明,基因编码的是一个个氨基酸的蛋白分子,含有个潜 在的与天冬酰氨连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖位点,其中有个簇集在蛋白分子的 末端一半内,糖基对于转运到细胞表面是非必需的,但对其神经氨酸酶活性则是必需的引。 的骶蛋白根据分子质量大小,可分作、和三个亚型。是烈的 菲生物活性前体,通过水解作用移去一个糖多肽而转化为分子。核酸序列分析也表明?的 和糟之阉的肽键发生裂解而产生甜的,仅存在予新城疫最低的毒力株中如, ,等毒株?;而另外两个亚型则是已活化的产物,是典型新城疫强毒的特征 或为强弱毒共有,和的差异可能是点突变的结果引。 烈中和抗体的结果可以确定分子中有个相互交叠的抗原位点,这些位点在一级结构上 是截然分开的个区域,也就是说在自然结构中涨分子受体结合位点可能是由于分子中非连续 区域集聚在一起构成的?。。 。..融合蛋白 基因长,编码个氨基酸九。蛋白位于病毒的囊膜上,是病毒感染细胞所磐须的 第啖共页中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第一章新城疫和新城疫病毒 重要成分““。通过它可以完成病毒囊膜与细胞膜的融合,便病毒穿过细胞膜而进入到细胞内进行 复制。由于介导感染病毒的细胞和相邻细胞之间的融合,也导致了多核巨细胞或合胞体的产生。 蛋白是毒力的主要决定因素“”,在前体蛋白氮基端有信号肽序列,羧基端有跨膜区和 胞质区,已发现的抗原表位有个,分别位于第、和个氨基酸残基上,它们对蛋白 的抗原性起着主要作用”“. 蛋白是新城疫病毒致病性的基础,它不依赖于的变化,主要负责病毒与宿主细胞的融合, 该病毒入侵宿主细胞通常需要和蛋白的协同作用”。 由于蛋白位于病毒粒子的表面,在生存过程中面临巨大的选择压力,因此相对其他个基 因而言变异率比较高。现今对基因演化规律的研究主要集中在对蛋白裂解位点附近的氨基酸 序列和基因部分片段 位或 ~ ~ 位进行分析“。 蛋白裂解位点附近的氨基酸序列基本上能反应的毒力.它在强毒株中序列一般为 “/?旷/?儿,而在弱毒株上一般为”//一妒/“””。在的复胄周期中, 蛋自首先产生无活性的前体,必须在裂解区第位至第位氨基酸的位与 位氨基酸之间被裂解为和两条多肽后,才能使病毒粒子具有感染性。对于强毒株来说, 裂解位点的氨基酸序列可被机体很多组织器官的多种蛋白酶裂解,因此可以导致全身性感染, 而弱毒株的裂解位点的氨基酸序列仅能被呼吸道和消化道上皮分泌的胰酶样酶裂解,所以弱毒 株仅能引起呼吸道或肠道等局部感染?。 ...基质蛋白 , 基因长 ,编码个氨基酸。蛋白位于囊膜的内表面,构成囊膜的支架,不仅对 病毒起保护作用,而且通过与细胞膜、病毒糖蛋白的胞质区以及核衣壳的相互作用而参与病毒的 装配过程“”。蛋白还有抑制宿主细胞转录和蛋白质合成的作用?。为了确定蛋白的抗 原表位,用 蛋白的不同单克隆抗体进行研究发现,在蛋白中至少有个非重叠表位和 个部分重叠表位,而且这些高度保守的表位主要与结构有关””。 ...核衣壳结构蛋白、磷蛋白和大分子蛋白 基因长, .编码个氨基酸。是核衣壳的主要组成蛋白质,每个病毒粒子 含有 个~ 个单体,它不具有免疫保护功能? 基因长, ,编码 个氨基酸。蛋白是依赖的聚合酶的两个亚单位之一,也是蛋白的分子伴侣,它 可以阻止蛋白对非病毒及病毒的“非法”衣壳化。基因长, 或, , 但都编码,个氨基酸。“。蛋白是病毒聚合酶的两个亚单位之一,它与蛋白形成的复 合物具有完整的聚合酶活性。参与转录和复制的大部分酶的活性都存在于上,如病毒 多聚酶、加帽酶、多聚酶和磷酸激酶等””。基因在转录过程中会在其位 从 发生编辑现象而产生两个额外的蛋白质及,它们和蛋白含有相同的端,但 是具有不同的端?。蛋自古有个氨基酸,而蛋白含有个氨基酸““。和是病毒 第页共负蛋白还与病毒的毒力有关。“。 复制的必需成分。最近的研究表明, ..新城疫病毒致病陛分子生物学基础 对新城疫病毒结构分析表明,不同毒株的内部蛋白、、的结构比较保守,而外部 蛋白、、的氨基酸序列却有明显的差异,而且外部蛋白的氨基酸差异越大,毒株的毒 力也差异越大”。这说明、、可能与的致病性有关。进一步研究发现的致病性 的分子基础是,蛋白通过识别、结合细胞表面的受体来启动病毒的感染,蛋白位于病毒的 囊膜上,通过其融合多肽的穿膜作用将病毒的核衣壳转移到细胞内。另有报道说蛋白可通过 抑制宿主蛋白质的合成。协同、蛋白的致病性““。洲和蛋白的存在形式和对宿主细胞 中蛋白酶的敏感程度不同是导致不同毒株间毒力差异的主要原因。基因先编码一个无活 性的蛋白的前体.蛋白。只有蛋白经过加工、修饰才能成为有活性的蛋白,而这一过 程最主要的一环是蛋白的切割。弱毒和强毒的毒力差异主要体现在切割位点氨基酸的差异, 强毒株为含有成对的碱性氨基酸;”/“,弱毒株则仅古有单一的碱性氨基酸: ”。成对的碱性氨基酸能形成特定的空间构象,可作为多种宿主细胞中的蛋白酶 底物,因而强毒株的蛋白合成后能迅速被裂解成有活性的蛋白形式。的存在形式也与 的致病性相关,但目前研究发现,仅见于无毒或弱毒株中,强毒株中未见到前体。所以 和蛋白是的致病主要原因,也是制备疫苗的首选基因““。 .新城疫的症状及流行特点 ..新城疫的症状 每次新城疫的爆发都有其症状,最早典型的新城疫症状是:呼吸困难、咳嗽、气喘等呼吸道 症状,鸡冠呈青紫色,绿色稀便,嗦囊蓄积大量酸臭液体,倒提病鸡液体从口中流出,病程稍长 者会出现神经症状,如鸡腿翅麻痹和头颈扭曲等。剖检病鸡可见腺胃乳头或乳头间点状出血,十 二指肠及小肠黏膜有暗红色出血,肠黏膜处常见有枣核状大小的纤维素性坏死,泄殖腔充血、出 血,产蛋鸡输卵管充血、出血明显。发病无明显的季节性。 在新城疫的流行过程中,又出现了非典型性新城疫,其症状及特点是:死亡率不高,~般不 超过%。对于产蛋鸡来说,产蛋率下降,畸形蛋增多;对于非产蛋鸡可能出现不同程度呼吸道 症状,如摇头、咳嗽、甩鼻等;剖检病死鸡可见气管黏膜充血、出血,十二指肠及小肠黏膜有出 血和溃疡,但均不如典型性新城疫的症状明显““。 除了典型性新城疫和非典型性新城疫外,近年来还出现了高致病性新城疫,除其发病症状与 典型性新城疫一样外,还有发病急,传播快,死亡率高的特点。其潜伏期较短,一般为?天。 在某些鸡突然发病后,很快会导致全舍甚至是全场的鸡群发病,而且进行紧急疫苗免疫接种无效。 高致病性新城疫的主要发病日龄为?天龄?天龄两个日龄阶段的鸡群。 虽然非典型性新城疫在各个季:宵都可以发生,但大多发生在秋冬季节,尤其是气候突变、季 第页共页节交替等情况下易发生。其发病时间主要是在首免与二免之间,育雏期与育成期之间多发,产蛋 鸡在开产前后和开产高峰期多发。发病鸡群都有疫苗接种史,该病初发时无群体性,表现进行性 缓发过程,逐渐在全群及相邻鸡群蔓延,极易诱发其他疾病。 ..我国新城疫流行特点和防治 由于国情的不同和经济水平的差异,我国新城疫具有独特的流行特点。年以前,由于鸡 新城疫疫苗特别是油乳剂灭话苗在临床中尚未得到广泛应用,鸡群多爆发典型新城疫。鸡群发病 急,有较高发病率和死亡率.甚至全群覆没,给养鸡业造成沉熏的打击。?年,随着人 们防病意识的增强和冻干苗及灭活苗的广泛应用,鸡群发病多以非典型新城疫为主,发病率和死 亡率都较低。至今,在发生非典型新城疫的同时,典型新城疫发病率逐渐增加。单独免疫 鸡新城疫冻干苗已控制不住疫病发生。即使联合使用冻干苗和灭活苗免疫鸡群仍可感染发病,只 不过发病率低,症状轻,死亡率低而已。 目前我国新城疫的流行具有以下特点: 本病一年四季皆可发生,但在秋冬交替、寒流 突袭的寒冷时节多发。每年秋冬,初春时节鸡新城疫发生率最高。发病日龄提前。? 龄易发生典型新城疫,?日龄、?日龄段多发非典型新城疫。易感品种较多。鸡、 鸭、鹅、鸽子、鹦鹉等都可感染本病。近几年鸽新城疫经常发生,鸭、鹅的新城疫发病率也有增 高趋势,但仍以鸡易感性最高,最易发病,它既是易感品种,同时也是主要的传染源,发病面最 广‘“。 尽管现用的新城疫疫苗对防治新城疫起了很大的作用,但近年来世界范围内仍不断有新城疫 的爆发。年月日瑞典蛋鸡爆发新城疫易感鸡只,销毁只,在周围公里地区内 的所有的家禽采取扑杀方式来控制新城疫。同期,日本的地区??镇和市 的农场中的鸭子也爆发了新城疫。在我国由于新城疫疫情复杂,发病死亡率高,新生雏鸡都要进行 新城疫免疫,每年使用新城疫疫苗在~百亿羽份以上,但即使如此,我国各地仍然不断有新城疫 爆发,给养殖业造成很大的损失,所以在深入了解新城疫病毒的基础上,研究新型新城疫疫苗是 目前预防和控制新城疫的关键环节。 第页共页第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 中国农业大学博士学位论文 第二章新城疫疫苗 目前新城疫的防治主要是采用疫苗接种的方式“”。现有的新城疫疫苗主要有:油佐剂灭活疫 苗,弱毒活疫苗,亚单位疫苗和基因工程疫苗。生产中常用油佐剂的灭活疫苗和弱毒活疫苗,这 两者在新城疫的防治方面发挥了重要的作用,但其在制作方法和应用效果上仍有一定的不足“”。 因此,新城疫疫苗的研究仍然需要进一步的深入。 .常规疫苗 常规新城疫疫苗主要包括油佐剂的灭活疫苗和弱毒活疫苗。灭活疫苗主要指油佐剂的 灭活疫苗“?。这种疫苗以鸡胚培养的全病毒经提纯灭活后作抗原,具有良好的免疫原性,免疫动 物后产生良好的体液免疫反应。目前许多国家使用的就是此种疫苗。灭活疫苗的缺点是热稳定性 差,需要低温保存,免疫持续期短,抗病毒谱有限,细胞免疫反应较弱。此外,由于油佐剂很难 被动物机体降解,易在注射部位形成小结、肉芽肿,有些动物甚至会产生无菌性化脓性炎症反应等 副作用。新城疫的弱毒活疫苗“”能诱导鸡血清里表达高水平的,和抗体“”, 也可诱 导粘膜抗体?,它具有免疫期相对较长,制各与操作简单的优点。通过对接种弱毒活疫苗的 鸡进行攻毒试验,结果证明,弱毒活疫苗可以保护鸡抵抗致死剂量强毒的攻击,但这类疫苗 有毒力反强的危险?。 由于这些常规灭洒疫苗的免疫保护期往往不长,虽然商品鸡群在整个饲养期内多次进行免疫 接种,仍有可能感染新城疫病毒,造成非典型的流行。常规弱毒疫苗和中等毒力疫苗还可能在 鸡呼吸道进彳于复制,引起温和病变,增加了对细菌继发感染的敏感性。 .亚单位疫苗 亚单位疫苗是指将病原的主要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达,纯化其表达产物辅 以佐剂制成的疫苗。其特点是:该疫苗只含有病毒的衣壳蛋白,不含有核酸,因而具有很高的安 全性。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染 的动物。该疫苗适用于发病快,病程急,中和抗体能有效控制发病的传染病““。 新城疫的亚单位疫苗以杆状病毒系统作为主要表达工具,这种系统是以昆虫杆状病毒为外源 基因载体,以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比, 杆状病毒表达系统具有表达产量高,产物可进行翻译后加工的特点。该系统表达产物的抗原性、 免疫原性等生物活性与天然蛋白相似,并可通过感染昆虫幼虫从而大量提取基因工程产品。迄今 为止,已有 株、株、株的和基因在杆状病毒系统中表达。经检 测表达的和蛋白均经过糖基化加工,蛋白还具有神经氨酸酶和血凝素两种活性。用感染 重组杆状病毒的家蚕或组织细胞加一制各成油佐剂疫苗,能使免疫接种的试验鸡产生对强毒攻击 的抵抗力”“。等构建了表达基因的重组杆状病毒,用该重组病毒免疫的鸡除能抵 抗强毒攻击外,还不诱导产生针对和的抗体,这表明强毒在免疫鸡体内没有复制。这 样就能方便地用血清学试验来区分重组杆状病毒免疫鸡和自然感染的鸡?。虽然亚单位疫苗显示 第页共页中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 了良好的免疫性能,而且不会对公众健康和生态环境产生任何潜在的不良影响,但是亚单位疫苗 的制作成本较高,实践中往往难以推广和利用。 .病毒活载体疫苗 病毒活载体疫苗是指利用低致病力的疱疹病毒、瘟病毒、沙门氏菌等作为载体,将其它病原 的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体,在同源或兼容性好的启动 子驱动下随载体的复制来表达插入的外源基因。 ..疱疹病毒载体疫苗 火鸡疱疹病毒是最近发展起来的新型载体,由于其对鸡及其它动物均无致病性,使用 安全,接种鸡体后病毒可在鸡体内形成长达数周的病毒血症,且终生潜伏感染,可刺激机体产生 较高抗体水平并维持终生,接种一次即可获得终生免疫,因此作为构建禽用基因工程苗的载 体,已成为国内外研究的热点?。年等将、基因分别克隆入火鸡疱疹病毒 的复制非必需区区,利用肉瘤病毒的强启动子构建了重组。重组在组织培 养和鸡体内都十分稳定,保持了充分的感染性。用该重组腹腔接种日龄自来航鸡,第 天后以 肌肉注射攻毒,表达的重组有%的保护率,表达的有%的 保护率,但均不能完全抵抗强毒的攻击””。含有和母源抗体的日龄商品肉鸡接种 表达基因的重组,受强毒攻击时能产生与活疫苗相当的保护率%。 国内陈溥言、张雪莲等将新城疫病毒株的基因克隆到火鸡疱疹病毒的非必须 片段载体 中,成功的构建了含有基因表达盒的转移质粒载体,为进一步研究表达基 因的载体疫苗奠定了基础”。目前疱疹病毒载体疫苗的研究正在不断的深入。 ..沙门氏菌载体疫苗 沙门氏菌是~种可产生局部或全身感染的胞内病原体。腺膘呤甲基化酶 和转录激活因子是控制沙门氏菌毒力的主要因子。基因和基因突变 后可使沙门氏菌毒力显著下降,但不影响其繁殖和侵袭能力,仍可直接将真核表达质粒带入动物 细胞内,并表达相应的蛋白。沙门氏菌侵入细胞后质粒从细胞外转移到细胞核的具体机制还不清 楚,可能是细胞感染沙门氏菌后引起部分细胞的凋亡、溶解和“泄漏”效应而发挥作用。我国扬 州大学将毒株的基因克隆载体后转入减毒的沙门氏菌中,并免疫动 物,检测抗体和进行攻毒实验,结果表明,这种疫苗是安全的,并能使鸡有效地抵抗新城疫强毒 的攻击”“。方维焕、粱雪芽等将的融合蛋白基因插入到的启动子 下游,电转化和基因突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌株。和斑点杂变证 明减毒鼠伤寒沙门氏菌已将.带入细胞中,而且得到转录表达,但从总体上 来说表达量不是很高?。这些都为进~步研究减毒沙门氏菌为载体的服疫苗创造了条件。 第页共页第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 中国农业大学博士学位论文 ..痘病毒载体疫苗 ,属于痘病毒科禽痘病毒属,它含有较大的双链分子, 鸡痘病毒 约,其中许多是病毒本身复制的非必需区,预计可容纳的外源基因,这可用于研究和 开发基因工程多价苗,为禽类和其他动物的疾病防治奠定了很好的基础。鸡痘病毒载体外源基因 的表达产物具有良好的免疫原性.可诱导机体产生持续的细胞和体液免疫反应,该病毒是严格的 胞浆内复制,避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能性。 用重组的痘病毒表达新城疫的基因,制备成删重组瘟病毒疫苗。活的重组痘病毒可 以在鸡体内复制,并能完全抵抗强毒的攻击,灭活的重组痘病毒必须在佐剂存在时或者增 加倍的剂量下才能保护鸡免于病毒攻击”’。等已经成功地在上表达了鸡新城疫 病毒和蛋白,并进一步与一型共表达,用该疫苗免疫日龄的鸡胚或刚孵化的小鸡, 结果表明,被免疫过的鸡可以抵抗新城疫强毒的攻击?’。这类以鸡痘病毒为表达载体,表达新城 疫蛋白的重组鸡痘病毒,奠定了新城疫一鸡痘基因工程活载体疫苗的基础”“”。等 用干扰素作佐剂的重组鸡痘病毒接种火鸡的鸡胚,结果证明接种后鸡胚的有丝分裂反应没有被抑 制,且对帅的攻击具有保护作用”。早在年公司将新城疫的两个病毒蛋白基因导入 失活的鸡痘病毒中,制成商品化的疫苗。实践证明提供的保护不如传统的疫苗好, 但将传统的疫苗和?疫苗联合应用比单独使用的免疫效果更好。目前,扬州大学刘秀 梵等构建了表达新城疫病毒/删及干扰素基因的重组鸡瘟病毒疫苗?’。解放军军需大学金宁一 等成功地构建了分别表达鸡传染性法氏囊病病毒蛋白和新城疫病毒蛋白的重组鸡痘病毒 .疫苗 疫苗,也称核酸疫苗,是指将编码引起保护性免疫应答的目的基因片段插入真核表达 质粒载体中,然后将重组质粒直接导入机体,通过宿主细胞的转录系统表达目的抗原,进而诱导 保护性免疫应答的~种生物制剂。发现外源注射入机体细胞内可以使外源基因 在体内表达,年,,和分别发表了质粒为疫苗注入体内引起机体 产生免疫应答反应及保护性的研究‘一’,以此为标志,疫苗技术诞生了。从此,疫苗作为 继灭活疫苗、减毒疫苗和基因工程多肽苗后的第代疫苗成为国际疫苗研究的热点。 ..疫苗的优点 与传统疫苗相比,疫苗具有制备简单、生产速度快,成本低、容易控制质量、免疫期长、 热稳定性好、便于贮藏和运输等优点已在免疫学领域引起了一场重大的革命。该疫苗还具有其独 特的优势:疫苗在接种后,蛋白抗原在宿主细胞内表达,加.,处理过程与病原的自然感染 相似,抗原提呈过程也相同,因而可以同时诱导机体产生细胞免疫和体液免疫;外源基因在体 内存在较长时间,不断表达外源蛋白,持续给免疫系统提供刺激,因此能够刺激机体产生较强而 第页共页中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 持久的免疫应答;疫苗具有共同的理化特性,因此可以将含有不同抗原基因的质粒混合起 来进行联合免疫;质粒载体没有免疫原性,因此可以反复使用;疫苗在母体产生的传递 保护性存在的条件下也能发挥作用”?。 ..疫苗的免疫机制 目前对疫苗的研究和开发还处于起步阶段,其免疫机制还不能用现有的理论加以解释, 只能做一些推断。抗体反应是发挥免疫保护作用的主要免疫反应之一,首先被证实的对于蛋白的 抗体反应是鼠和非人类灵长目动物针对流感病毒蛋白的抗体反应”“。细胞介导的免疫应答反应是 疫苗诱导机体抵抗病原体攻击的又一主要机制。核酸疫苗免疫后主要有三种作用途径: 核酸疫苗接种后,结合在游离核糖体上的?翻译而表达,合成的内源性抗原蛋白,其中一部 分以合适的比例结合到泛肽上,呈递到蛋白酶,降解为多肽,通过抗原肽转运结构运送到 内质网腔,与?类分子以亲和吸附方式形成聚合体,多肽?类分子聚合体通过内质网进 入高尔基体,最终到达细胞膜的表面。诱发细胞毒性细胞应答的产生。另一部分分泌 到胞外的蛋白抗原,被抗原提呈细胞的?类途径呈递。具体为,进入姗类呈 递途径的蛋白在内吞后,在溶酶体中水解,产生大约~个氢基酸的多肽片段,这些溶酶 体和包含删?分子的囊泡融合,瑚?分子结合合适的多肽形成瑚异聚体,成熟的异聚 体在细胞膜表面呈递给细胞,并激活而引发偏向体液免疫反应的应答。也有~部分抗 原多肽递呈给细胞,使细胞自身活化,产生特异性抗体.诱发体液免疫。另外 递呈后的限 制性细胞活化、增殖可产生多种细胞因子,进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫反应““ ? 近年来的研究表明,虽然疫苗具有广泛的优越性,并有两个疫苗产品被美国批 准上市。但大部分疫苗在大动物和人体中的免疫效力却还不及减毒活疫苗有效,尚未达到人 们的期望值。 ..疫苗的设计 ..选择目的基因 由于在动物免疫中,选择不同的外源目的抗原基因会引起不同的免疫效果。另外也有资料表 明,单个的抗原基因可能不足以产生足够的保护性免疫反应,多个抗原基因的选择对于免疫反应 可能更有效。因此,对于那些具有不同亚型的病原体应该选择较保守的保护性抗原基因,同时在 基因疫苗中克隆入同一病原体的多种保护性抗原基因,也可以使机体对该病原体产生较全面的免 疫力?’。 ..载体的选择 在选定外源目的基因后,该基因能否在机体内得到高效表达成为影响基因疫 苗免疫效果的关 第负共页第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 中国农业大学博士学位论文 键,故外源基因载体的选择成为核酸疫苗能否高效表达的主要因素。载体的启动子、增强子、翻 译起始序列、的终止信号等都可影响外源基因的表达,其中启动子类型是影响外源基因表达 的主要因素之一。现在基因疫苗的研究多采用启动子,也有报道表明用肉瘤病毒 的启动子亦有较好表达。 ..免疫途径及接种方式 目前许多研究者认为肌肉包括心肌和骨骼肌在内的横纹肌注射疫苗是核酸疫苗免疫 的主要方式。但是由于核酸疫苗注射后,需通过肌束膜、肌内膜才能达到肌细胞,且肌细胞分泌 极少量或有时不分泌合成的抗原蛋白。只表达极少量?类抗原而不表达删一?类抗原及共同 刺激分子、缺乏专职抗原递呈细胞等都可影响核酸疫苗的免疫效果,而且易引起免疫耐受,因 此许多学者已在探索核酸疫苗免疫的新途径。等报道,皮内接种含流感病毒核蛋白抗原基因 的裸质粒,免疫效果明显高于肌肉接种 等报道,呼吸道上皮是转录和表达外 源基 因的主要靶细胞,这表明核酸疫苗经粘膜免疫也可能获得较好的效果?’”’。等报道,甲 型流感病毒血凝集索疫苗肌肉内、静脉内、鼻腔内和皮下混台接种小鼠优于单种方法接种的 效果?。 ..新城疫疫苗的研究现状 在新城疫疫苗研究方面,日本学者等将 基因插入质粒载体,以巨细胞病毒 早期增强子和鸡肌动蛋白启动子调控。研究结果表明,线性质粒和线性质粒与脂质体转染剂的 混合物都能诱导高水平的针对蛋白的抗体,而闭环状的质粒不能产生抗体。免疫周后,有抗 体的鸡能抵抗致死剂量强毒的攻击?。等将新城疫和传染性法氏囊价疫苗与二 甲亚枫:混匀后,免疫周龄的鸡,周后加强免疫,攻毒结果表明%的鸡被保护””。姜永 厚、刘忠贵等构建了共表达鸡一和 基因的重组真核质粒,用该共表达质粒比单表达 基因的质粒和单表达基因的质粒混合使用的方法免疫效果要好,这为疫苗的应用提供了极大 便利,免疫接种时.一针注射即可完成,而不需分别注射种质粒,省时、省力,节省费用,而且 缩小了疫苗的体积,可提高的吸收效率”“。此外,等研究发现的佐剂作用有赖 于同编码病毒抗原质粒的共同注射,如果间隔几小时后分 ?注射,则观察不到?对产生特异 抗体数量的增强作用。虽然上述质粒可在鸡体内表达,但如何提高质粒在体内的表达量,提高免 疫效率仍是一个难题。表面活性剂在医药领域有广泛的应用,等将一系列表面活性 剂、、与中性磷脂按一定比例混合制成了带有表面电荷的阳离子脂质体,当与质粒 结合后,在体外转染鼠细胞,能明显提高报告基因的表达能力?。脂质体可提高质粒 表达主要原囡是:脂质体包裹可有效降低机体细胞内核酸酶对质粒的降解作用:脂 质体与受体细胞结台可促进质粒被组织细胞吸收。现阶段有许多研究者利用脂质体或阳离子 脂质体作为非病毒基因的转移载体。为单层或多层磷脂双分子层组成的环形囊状结构, 主要成分为阳离子脂质,与其结合后被包于中心水相中,起运载的作用”‘?。 第页共页第一篇文献综述第二章新城疫疫苗 中国农业大学博士学位论文 疫苗虽然是近年来才发展起来的一项新的生物技术,但是其初期临床应用成 功的数量令 人吃惊,对动物医学的发展已起到了巨大的推动作用,展示了诱人的前景。同时我们也应该清醒 地看到目前疫苗的应用仍然存在着许多问题,如有效目的基因的选择问题、完美载体的构建 问题、目的基因的高效表达问题、应用对象问题、安全性问题、免疫耐受性问题、抗原进入机体 后表达难以调控问题、婴儿免疫后因代谢太快而无法持续表达问题和污染问题等,这些都是 疫蓖发展尚待解决的问题。但是我们相信,随着基础研究和临床应用的进~步深化,这些问题都 将会得到更客观的评价和解决。在不久的将来,疫苗将会以其它疫苗无可比拟的优点而获得 广泛的应用,使动物医学得到更进一步的发展。 第页共页第一篇文献综述第三章免疫佐和 中国农业大学博士学位论文 第三章免疫佐剂 免疫佐剂一词源于拉丁语,最早见于于年的描述:“与特异性抗原 共同使用,以产生比单独使用抗原更加强烈的免疫应答”。现在,免疫佐荆是指与抗原同时或预 先应用,能增强机体针对抗原的免疫应答能力,或改变免疫反应类型的物质。一种免疫效果确实 的疫苗往往需要一种与之相匹配的佐女才能更好地发挥疫苗抗感染的特性。近年来随着现代生物 技术的进步,各种新型疫苗亚单位疫苗和疫苗的研究逐渐成为热点问题,其中佐剂的研究几 乎决定了新型疫苗的诞生。虽然经典的铝胶佐剂成为美国食品与药品管理局批准的唯一的 人医用佐剂,但是很难满足现代各种新型疫苗的需要和发展。目前国内外已经试验的佐剂有 多种?。 佐剂的作用原理 佐剂可以通过下述途径促进疫苗抗原的免疫反应:增加弱抗原的免疫原性;提高免疫反 应的速度,增加其持久性;调节抗体的亲和力和特异性;促进细胞免疫反应和刺激产生; 促进粘膜免疫的诱导:增强免疫未成年或老化个体的免疫反应;有助于克服联合疫苗 中的抗原竞争””。由于免疫通常激活一连串复杂的反应,佐剂的主要效应很难清晰地被观测到, 故大部分佐剂的作用机制目前尚未明确。 .佐剂的种类 ..化学佐剂 传统的化学佐剂主要有油佐剂、铝胶佐剂及其他化学类佐剂等。新型的化学 佐剂有免疫刺檄 复合物等。 ..油佐剂 油佐剂是目前新城疫疫苗等常用的佐荆。经典的油乳剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐 剂。内含有死亡的分枝杆菌,是的既能诱导体液免疫反应又能诱导细胞免疫反应的 佐剂。不完全弗氏佐剂是不含分枝杆菌的乳化剂。具有较强的佐剂功能,常用作动物疫 苗如鸡新城疫病毒、马流感病毒、副流感病毒等疫苗的佐剂,主要能诱导型细胞因子”?。 但是由于配方中含有矿物油含有致癌成分稠环芳烃,其致癌性在雄性、鼠中已经得到 证实,因此至今没有被批准为合法的佐剂””。此外,由于矿物油 , 很 难被动物机体降解,与其配伍的乳化剂单磷酸脂质抗原依赖性降解后会释放出游离的脂肪酸。上 述两种原因造成该佐剂在注射部位局部形成小结、肉芽肿,有些动物甚至会形成无菌性化脓性炎 症反应。 第页共:中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第三章免疫佐剂 ..铝胶佐剂 铝胶佐剂是以氢氧化铝或磷酸铝水合凝胶的形式,高效吸附水溶性抗原,缓 慢释放不断刺激 机体产生体液免疫反应。铝胶使用方便,成本低廉,安全无毒,是至今唯一被批准用于人用疫 苗的佐剂?。铝胶佐剂存在的主要问题是:?主要激活型免疫细胞。“,只诱导体液免疫应答, 适用于以抗体保护为主的疾病疫苗;?铝胶佐剂在注射部位缓慢释放抗原的效应较低,对很多抗 原效果不确实。 ..其他化学佐剂 化学药品类佐剂很多,其中研究最多的有左旋咪唑船、西米替丁、阿弗西丁、异丙肌苷、 硒和维生素等;中草药类的冬虫夏草、皂素、黄芪、苦参、当归、芦荟、酸枣仁、远志、蜂胶、 复方柴术散、苍芪散、玉屏风散等均有佐剂作用。 研究证明是一种良好的免疫增强剂,它能使受抑制的吞噬细胞和淋巴细胞功能恢复正常, 而且可以增强细胞免疫机能,大大提高疫苗的免疫效果。目前船还应用于癌症的免疫治疗上。 本实验室研究证明不但能够增加口蹄疫核酸疫苗的抗体水平,还能激发有效的细胞免疫?, 同时也可以促进病毒灭活疫苗的免疫水平”’。 ..免疫刺激复合物 , 免疫刺激复合物 ,是由抗原物质与由皂树皮提取的一种 糖苷及胆固醇按::混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。每个小泡 直径,约含~个分子的蛋白质。是一种具有较高免疫学价值的新的抗原递呈系 统,对辅助性细胞、细胞毒性细胞和细胞都有作用,对抗原递呈和免疫调节过程发挥重要 作用。可增强机体对大多数抗原的体液免疫和迟发型变态反应,诱导?分泌,调节瑚 类抗原表达,刺激机体产生抗非感染性抗原的 类限制的细胞毒细胞。作 为吞噬性抗原,可直接通过 分子处理并递呈给细胞,也可以通过皂素与膜结构相互螫台 到达胞质”’?。 作为一种全新的抗原递呈系统,对机体有免疫增强作用,具有佐剂和抗原递呈的双重 功能,应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗,具有产生“全面”免疫应答的效力,可长期增 强特异性抗体应答。年英国的等通过小鼠口服含有蛋白抗原的免疫刺激复合物试验, 证实含佐剂的亲脂性对口服给予的蛋白抗原能诱导局部和全身免疫应答,实验还证 实是通过调节局部固有免疫应答和肠抗原吸收而发挥作用。作者指出,可通 过对抗 原摄取和局部辅助细胞的联合影响来增强肠道抗原的免疫原性?。年,荷兰学者 等将含有新城疫病毒蛋白和蛋白的病毒颗粒与结合制各成疫苗,皮下注射到鸡体内, 试验证明,免疫该疫苗的鸡受新城疫强毒攻击后,保护率人于%,作为免疫佐剂人大提 高了抗原的递呈和吸收效率””。至今,已有许多弧单位疫苗和基因工程疫苗采用了技术, 针对相应的疾病防治,取得了良好的效果。但火多数的制品仍处于研究试验阶段。 第页共瓤第一篇文献综述第三章免疫佐剂 中国农业大学博上学位论文 ..分子佐剂 随着核酸疫苗的发展,分子佐剂得到了广泛应用,它主要包括:细胞因子、趋化因子和共刺 激因子三类”?。其中细胞因子佐剂能够增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭,对肿 瘤免疫和临床应用都有显著作用。 ..细胞因子佐剂 ...细胞因子佐剂的种类 细胞因子是机体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性 的异质性肽类调 节因子,在体内能激活和调节免疫活性细胞,对免疫应答的产生和调节具有重要作用,可作为免疫 佐剂来增强疫苗的免疫效果,主要包括干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、 集落刺激因子、表皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子等“?。细胞 因子通过旁分泌或自分泌方式发挥生物学作用,它有特定的靶细胞.并通过靶细胞膜上的特异性 受体发挥作用“ 细胞因子具有免疫调节、抗肿瘤与增殖、促进造血与组织修补、参与炎症 反应以及神经内分泌效应等多生物学功能”?。目前,通过分子生物学手段,已克隆出多种细胞 因子基因。在国内外,一、、、、等细胞因子的基因工程产品已经获准生 产,用于感染性疾病、肿瘤、器官移植、血细胞减少症和自身免疫症等的治疗中”?。 鸡细胞因子基因的鉴定、克隆和表达比哺乳动物细胞因子相对滞后,其主要原因是它们基因 序列的同源性通常很低约/%。目前研究较多的鸡细胞因子有:?、、 ?、一、一和一等。 ...细胞因子佐剂的优点 相对于传统的佐剂,细胞因子佐剂表现出特有的优越性:制备简单.易规模化生产,纯化 技术简便,质量易于控制,成本低廉,易于保存和运输;一次少量给予即可诱 导长时间表达. 无须频繁连续补给:在宿主体内合成所编码的肽类,在构象上接近天然的细胞因子;有效性, 多项研究表明疫苗质粒与细胞因子质粒共免疫可大大增强疫苗的免疫效果;安全性,细 胞因子作为机体内本身存在的免疫效应分子,对人体无毒副作用:易于构建和改造,利用分子 生物学技术在基因水平可自由地选择细胞因子种类,使免疫诱导人们所期望的免疫应答类型。 一般情况下,接种某种类型的细胞因子或类质粒可促进相应类型的免疫反应“??。具 有佐剂效应的细胞因子包括一、一、一、一、一、、和?等“?。初步 实验结果表明,细胞因子作为疫苗佐剂已显示出广阔的应用前景。 ...细胞因子佐剂的作用机制 细胞因子具有“泛的生物学活性。可通过不同作用环节调节和增强疫苗的免疫反应, 每一种细胞因子的免疫调节作用均具多样性。目前,对细胞因子的佐剂效应的研究主要集中 第页共负中国农业大学博士学位论文 第一篇文献综述第三章免疫佐剂 曼皇曼鼍?量蔓寰皇鼍量皇曼毫曼舞量曼曼皇鼍置量葛 疫苗诱导免疫反应的强度和类型,而对各种因子确切的作用机制尚不清楚。大量研究表明““?, ?、卜、一、?以增强型细胞应答为主。?明显抑制疫苗激活的细胞 毒性细胞效应,诱导机体细胞向型分化。粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子删一 以增强型细胞应答为主,明显加强体液免疫。一能同时加强体液免疫和细胞免疫,主要倾 向于加强细胞免疫。细胞因子发挥佐剂作用