各个染色具体步骤终极版

各个染色具体步骤终极版 HE染色 Hematoxylin-Eosin stains 1 脱蜡至水(30min)?流水冲洗 2 苏木精染核20min左右?流水冲洗?镜观 3 盐酸酒精分化10—15s?流水冲洗 4 弱氨水返蓝10—15s?流水冲洗 5 伊红染色20min左右?流水冲洗 6 系列酒精脱水 7 二甲苯I、II分别透明10min左右 8 树胶封固 结果:细胞核呈紫蓝色，细胞浆、基底膜、胶原纤维、肌纤维成粉红色，可观察细胞的种类和数量。 HE染色可充分显示肾小球的细胞增生，但不能区分内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞的种类。可显示中性多核和嗜酸性粒细胞浸润。由于上皮细胞的被覆，肾小球基底膜呈略厚的假象。苏木素小体呈淡紫红色。纤维素样坏死呈深粉红色。碎核呈深蓝色细胞核碎片。微血栓呈粉色。HE染色可以很好的显示肾小管上皮细胞的损伤和肾间质水肿以及炎细胞浸润。 PAS染色 Periodic acid-Schiff reaction 1 脱蜡至水?流水冲洗 2 1%过碘酸溶液10min?流水冲洗?吹干 3 雪夫试剂37度孵浴?镜观?流水冲洗 4 苏木精染核5min?流水冲洗 5 盐酸酒精分化10—15s?流水冲洗 6 弱氨水返蓝10—15s?流水冲洗 7 系列酒精脱水 8 二甲苯I、II分别透明10min左右 9 树胶封固 结果:细胞核呈蓝色，肾小球和肾小管基底膜、细胞浆、肾小球系膜基质、胶原纤维和肌纤维等呈红色。 PAS与HE染色一样可显示肾小球内的细胞增生和浸润，因其可很好的显示基底膜，可依细胞的位置区分内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞。尚可观察基底膜是否增厚、皱缩和毛细血管塌陷。可观察肾小囊和肾小管基底膜是否增厚。尚可观察肾小球硬化、系膜基质增生、系膜溶解。PAS阳性的蛋白滴可见于蛋白尿患者的肾小球和肾小管上皮细胞浆内。可显示细动脉硬化时的玻璃样变。细胞性排异反应的肾小管炎在PAS染色中也可很好显示。 注意:第四步染色时间过长容易，颜色过深不容易分辨，所以一定要把握时间～～～ PAsM染色(六胺银套马松三色混合染色) 1 脱蜡至水?流水冲洗 2 1%过碘酸溶液10min?流水冲洗 3 六胺银溶液65度1h?镜观(注:如果六胺银溶液染色过深就要用氯化金分化) 4 3%硫代硫酸钠定影?水洗 5 苏木精染核20min左右?流水冲洗 6 盐酸酒精分化10—15s?流水冲洗 7 弱氨水返蓝10—15s?流水冲洗 8 Masson染色: ,Masson溶液染色1min左右?1%冰醋酸洗?镜观 ,亮绿橘黄剂溶液染色10S左右 ?1%冰醋酸洗 9 高浓度系列酒精脱水 10 二甲苯I、II分别透明10min左右 11 树胶封固 结果:基底膜、网状纤维和IV型胶原呈黑色，细胞核呈蓝黑色，背景呈粉红色，免疫复合物呈红色，III型胶原呈蓝色或者绿色。 由于基底膜可清楚而精确显示，所以免疫复合物定位精确，而对于肾小球内增生的胶原成分可区分III型(蓝色或者绿色)和IV型(黑色) Masson染色 Masson's trichrome stains 1 脱蜡至水?流水冲洗 2 媒染剂染30min(媒染剂配方:10%重铬酸钾+10%三氯醋酸。 二者等量混合，有色融 入无色里)?流水冲洗 3 苏木精染核20min左右?流水冲洗 4 盐酸酒精分化10—15s?流水冲洗 5 弱氨水返蓝10—15s?流水冲洗 6 Masson染色: ,Masson溶液染色1min左右?1%冰醋酸洗?镜观 ,亮绿橘黄剂溶液染色10S左右 ?1%冰醋酸洗 7 高浓度系列酒精脱水 8 二甲苯I、II分别透明10min左右 9 树胶封固 结果:细胞核呈红色，免疫复合物呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝或者绿色(染色液III中若为甲苯胺蓝则显蓝色，若为亮绿则显绿色) 该方法优点是显示各部位的免疫复合物，呈红色或者嗜复红蛋白。可区分肾间质水肿和肾间质纤维化(III型胶原)，前者呈淡蓝色，后者显深蓝色并可见蓝色胶原纤维。 直接免疫荧光 1 冰冻切片(3um) 2 风扇吹干2h?4度冷藏过夜?风扇吹干1h左右(或者4度冷藏 过夜?风扇吹干2h) 3 加稀释抗体 [Antibody:PBS液(A=1:30、M=1:90、C=1:80、C=1:34 30、Cq=1:60、 F=1:10、G=1:80)] 1 4 37度孵浴1h左右 5 生理盐水I、II各洗片5min 6 甘油稀释液封片 7 4度冷储 结果:异硫氰荧光素显绿色，罗丹明显红色 间接免疫荧光 1 冰冻切片(3um) 2 风扇吹干2h?4度冷藏过夜?风扇吹干1h左右(或者4度冷藏 过夜?风扇吹干2h) 3 1抗 4 37度孵浴1h左右 5 生理盐水I、II各洗片5min 6 2抗 7 37度孵浴1h左右 8 生理盐水I、II各洗片5min 9 甘油稀释液封片 10 4度冷储 结果:异硫氰荧光素显绿色，罗丹明显红色 高锰酸钾刚果红染色 1 脱蜡至水?流水冲洗(切片厚度5 um) 2 高锰酸钾—硫酸混合液处理3min?流水冲洗 (高锰酸钾—硫酸混合液配制:5%高锰酸钾+0.3%硫酸等量混合，现配现用) 3 5%草酸3min处理?水洗 4 苏木精染核2min?流水冲洗 5 碱性刚果红染色10—20min?无需水洗直接镜观 (碱性刚果红配制:0.3ML1%NaOH+30ML80%酒精氯化钠+饱和刚果红) 6 快速高浓度酒精脱水 7 二甲苯I、II分别透明10min左右 8 树胶封固 注意:刚果红染色是在阴性的基础上做此染色(去掉2、3步骤)，检测鉴别蛋白质的性质，若为阳性(系膜区和小动脉有砖红色物质沉积)则加上2、3步骤从新做此染色。 PAsM染色快速法 1 组织固定:把肾穿标本组织完全浸入10%中性甲醛中微波固定 20S(微波处理600W) 2 组织脱水:80%?85%?90%?95%?100%?100%乙醇中进行微波(600W)脱水各15S，共计90S 3 透明: 二甲苯I、II在微波(600W)中各15S，共计30S 4 浸蜡:常规浸蜡，蜡缸I、II分别10min 5 包埋、切片、烤片:切片厚度为2um，94度烤烤箱中95min 6 常规脱蜡至水，已备染色 7 染色:HE。PAS按常规染色。PASM染色采用微波600W，90S。与步骤与常规PAM套Masson染色相同。 注 解 Explanation1 文中说左右意思是时间可以随情况把握，苏木精和伊红可以适当延长时间，不必拘泥于课本。 2 PAM染色第3步，洗片时候:蒸馏水、蒸馏水、3%硫代硫酸钠、 氯化金 3 系列酒精脱水浓度依次: 80%?90%?95%?100%?100% 70%? 4 高浓度系列酒精脱水: 90%?95%?100%?100% 5 六胺银溶液配制(顺序依次由上到下): 25ML 3%六次甲基四胺 2.5ML 5%硝酸银 22.5ML 蒸馏水 4.5ML 5%四硼酸钠 数滴 硼酸 6 Masson染液的配制方法: 3.2g 磷钨酸 4ML 冰醋酸 400ML 蒸馏水 2.4g 变色液2R 1.2g 亮绿 7 冰醋酸(1%)洗掉Masson液和亮绿液 乙肝二抗浓度之比(抗体:PBS液=1:10) 8 肌酐的浓度值与新月体形成有关 9 光镜组织固定液为10%的中性甲醛 10 电镜液为2.5%的戊二醛 11 缓冲甘油的浓度为10%