试论HPLC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量

试论HPLC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量 试论HPLC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量 [摘要] 目的: 采用RP-HPLC法测定保健食品银杏叶软胶囊中总黄酮的含量。方法: 采用Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇-水(用磷酸调pH 为2.5 )(50?50)，流速为 1.0 ml/min，检测波长为360 nm，柱温为30?。结果: 槲皮素、山奈素、异鼠李素的线性范围分别为0.050,0.400、0.005,0.040、0.005,0.040 μg;3批样品中总黄酮含量分别为6.46 6、6.45 5、6.838 mg/粒。结论: 本法简便、准确、分离效果好，适合于银杏叶软胶囊总黄酮的含量测定。 [关键词] 银杏叶软胶囊;总黄酮;槲皮素;山奈素;异鼠李素;含量测 定 Determination of Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules by HPLC YE Xiubo1, CEN Guoying2, LI Ruiming2 ( 1.Traditional Chinese Medicine Hospital of Haizhu District, Guangzhou 510220, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China) [Abstract] Objective: To establish an RP-HPLC method for quantitative determination of Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules. Methods: The analytical column was Agilent C18 (4.6 mm× 250 mm, 5 μm) column. The mobile phase was posed of methanol and water (with phosphoric acid pH=2) at a flow rate of 1.0 ml/min. The wavelength of UV detector was 360 nm and column temperature was 30?. Results: The linear ranges of Quercetin, Kaempferol and Isorhamnetin were 0.050-0.400, 0.005-0.040, 0.005-0.040 μg, respectively. The contents of Total Flavonoid in three batches of samples were 1 Capsule 6.466, 6.455, 6.838 mg. Conclusion: This method is sensitive, repeatable and suitable to determine the content of Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules. [Key s] Yinxingye Soft Capsules; Total Flavonoid; Quercetin; Kaempferol; Isorhamnetin; Determination 银杏叶软胶囊是由银杏提取物与适量的基质制成的软胶囊，银杏提取物中含有黄酮类化合物和银杏总内酯两类生物活性物。其中，总黄酮类包括槲皮素、山奈素、异鼠李素等，共同作用于心脑和外周末梢血管系统，促进血液循环和改善末梢血液的运行，从而预防血管系统循环障碍所引起的各种症状。另外，黄酮类化合物有清除游离氧的抗氧化等药理作用[1]。本文用HPLC法测定总黄酮的含量，为建立银杏叶软胶囊质量控制方法提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器 LC-2017高效液相色谱仪(日本岛津公司);KQ-300超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);色谱柱Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。 1.2 试药 槲皮素对照品(供含量测定用，批号: 10081-201706，中国药品生物制品检验所);山奈素对照品(供含量测定用，批号: 110861-201703，中国药品生物制品检验所);异鼠李素对照品(供含量测定用，批号: 110860-201705，中国药品生物制品检验所);甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为纯，银杏叶软胶囊(批号: 0805 10、0809 20、091026，广州美丽康有限公司)。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 采用Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇-水(50?50)(用磷酸调pH为2.5)，流速为 1.0 ml/min，检测波长为360 nm，柱温为30?。在本条件下，槲皮素、山奈素、异鼠李素能达到较好分离，其他成分对测定无干扰，结果见图1。 2.2 溶液的制备 2.2.1混合对照品溶液的制备精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量加甲醇制成槲皮素浓度为 1.0 mg/ml、山奈素浓度为0.1 mg/ml、异鼠李素浓度为0.1 mg/ml的一成分对照品贮备液。分别精密量取上述槲皮素对照品贮备液4 ml、山奈素对照品贮备液4 ml、异鼠李素贮备液1 ml，置10 ml量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得槲皮素浓度为0.438 4 mg/ml、山奈素浓度为0.042 2 mg/ml、异鼠李素浓度为0.010 0 mg/ml的混合对照品溶液[3-6]。 2.2.2 供试品溶液的制备取本品装量差异下的内容物2 g，精密称定，加20 ml甲醇超声提取30 min，滤过，滤液加入 1.5 mol/L盐酸溶液20 ml，水浴回流3 h，冷却后用甲醇定容至50 ml量瓶，摇 2.3 线性关系的考察 精密吸取“2.2.1”项下槲匀，过0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。 皮素、山奈素、异鼠李素备用对照品溶液加甲醇配制成含一系列浓度的混合溶液: 对照品溶液1(含槲皮素0.050 mg/ml、山奈素0.005 mg/ml、异鼠李素0.005 mg/ml)，对照品溶液2(含槲皮素0.100 mg/ml、山奈素0.010 mg/ml、异鼠李素0.010 mg/ml)，对照品溶液3(含槲皮素0.150 mg/ml、山奈素0.015 mg/ml、异鼠李素0.015 mg/ml)，对照品溶液4(含槲皮素0.300 mg/ml、山奈素0.030 mg/ml、异鼠李素0.030 mg/ml)，对照品溶液5(含槲皮素0.400 mg/ml、山奈素0.040 mg/ml、异鼠李素0.040 mg/ml)。精密吸取上述对照品溶液各进10 μl峰面积， 以峰面积Y为纵坐标，进样量X(mg/g)为横坐标进行线性回归，得槲皮素、山奈素、异鼠李素的回归方程分别为: 槲皮素Y=31 248 671X-15 558(r=0.999 5);山奈素Y=30 421 567X + 614 692(r=0.999 9);异鼠李素Y=24 180 214X-225 760(r=0.999 7)。结果明槲皮素、山奈素、异鼠李素进样量分别在0.050,0.400、0.005,0.040、0.005,0.040 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。 2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μl，重复进样5次，记录峰面积。结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为 1.8%、 1.7%、 1.6%。结果表明本法精密度良好。 2.5 稳定性试验 取银杏叶软胶囊(批号: 080510)的供试品溶液，分别于(0、 1、 2、 4、 8、 12、24 h)进样20 μl记录峰面积，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为2.8%、2.5%、2.8%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。 2.6 重现性试验 取同一批号银杏叶软胶囊(批号: 080510)各6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μl，记录峰面积，计算含量，再按总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51计算，样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量分别为2.3 3、0. 19、0.06 mg/粒，总黄酮醇苷平均含量为6.46 mg/粒(RSD= 1.5%)。结果表明本法重复性良好。 2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批号银杏叶软胶囊(批号: 080510)适量，按表1精密加入对照品，按供试品溶液制备项下操作测定，结果见表1。 表 1 回收率试验结果(n=9) Tab.1 Results ofrecovery test (n=9) 2.8 样品含量测定 分别取3批银杏叶软胶囊样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μl及供试品溶液20 μl，注入色谱仪，记录峰面积。按外标法计算样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，并换算成总黄酮醇苷 的含量，结果见表2。 表 2 样品含量测定结果(%，n=3) Tab.2 Content determination results of samples (%，n=3) 3 讨论 在提取过程中，比较采用甲醇-25,盐酸溶液(4?1)的混合溶液水浴加热回流法、甲醇超声提取、盐酸加热水解法三种不同的提取方法，结果表明盐酸水解法效果较好，能将黄酮醇苷类成分水解完全。 为了使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间合理，试用甲醇-0.4,磷酸溶液(50?50)及甲醇-水(50?50)(用磷酸调pH=2.5)，结果选用甲醇-水(50?50)(用磷酸调pH=2.5)作为流动相时各个色谱峰的分离效果好。 [参考文献] [1]李冶,郑伟文.银杏叶提取物的药理研究与临床应用[J].现代食品与药品杂志,2017,2(31):1452-1454. 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2017:153. 卫生部.保健食品检验与评价技术规范手册[S].北京:清华同方电子出版社,2017. 马梅芳,吕文海.HPLC法同时测定南葶苈子饮片中槲皮素、山奈素及异鼠李素的含量[J].中国药事,2017, (1):65-67. 杜瑞芳,王雨梅,刘卫东,等.高效液相色谱法同时测定沙枣中槲皮素和异鼠李素的含量[J].时珍国医国药,2017,4(19):831-832. 丁立新,李春英,孙启芬.高效液相色谱法同时测定小叶金钱草中槲皮素和山奈素的含量[J].黑龙江医药科学,2017,32 (5):458.