[考试]农药残留的危害及农残速测仪检测方法的研究

[考试]农药残留的危害及农残速测仪检测的研究 农药残留的危害及农残速测仪检测方法的研究 在我国，农药残留是危害着食品安全的一个重要原因，提高农残检测技术可以有效的防止农残食品进入市场。常用的农残检测技术主要有NY-8D型农残速测仪检测法、光谱法、色谱法、生物检测技术及活体检测技术等。 1.农药的危害 农药残留超标的危害，一般人注意力主要是在对人体的损害方面，实际上这种危害远远的大于这个范围，除了人之外，它还直接损害我们赖以生存的环境，损害与我们共生的野生动、植物等。 (一) 农药对土壤、农作物的污染 半个多世纪以来由于农药的大量、大面积使用，不当滥用，以及农药的不可降解性，已对地球造成严重的污染，并由此威胁着人类的安全。据统计，中国每年农药使用面积达1.8亿公顷次，50年代以来使用的666达到400万吨、DDT 50多万吨，受污染的农田1330万公顷。农田耕作层中666、 -6-6DDT的残留量分别为0.72×10和0.42×10;土壤中累积的DDT总量约为8万吨。粮食中有机氯的检出率为100%，小麦中666含量超标率为95%。20世纪80年代禁止生产和使用有机氯农药后，代之以有机磷、氨基甲酸酯类农药，但其中一些品种比有机氯的毒性大10倍甚至100倍，农药对环境的排毒系数比1983年还高，而且，这些农药虽然低残留，但有一部分与土壤形成结合残留物，虽然可暂时避免分解或矿化，但一旦由于微生物或土壤动物活动而释放，将产生难以估计的祸害。 (二) 农药对环境的污染 由于农药的施用通常采用喷雾的方式，农药中的有机溶剂和部分农药漂浮在空气中，污染大气;农田被雨水冲刷，农药则进入江河，进而污染海洋。这样，农药就由气流和水流带到世界各地，残留土壤中的农药则可通过渗透作用到达地层深处，从而污染地下水。 -12-12据世界卫生组织报道，伦敦上空1吨空气中约含10微克DDT，雨水中含DDT7×10,400×10，全世界生产了约1500万吨DDT，其中约100万吨仍残留在海水中。中国南方某省1994,1998年，渔业水域受污染面积达45万多公顷，污染事故800多起。水域中的农药通过浮游植物--浮游动物--小鱼--大鱼的食物链传递、浓缩，最终到达人类，在人体中累积。 (三) 农药对生态的破坏 农药的不当滥用，导致害虫、病菌的抗药性。据统计，世界上产生抗药性的害虫从1991年的15种增加到目前的800多种，我国也至少有50多种害虫产生抗药性。抗药性的产生造成用药量的增加，乐果、敌敌畏等常用农药的稀释浓度已由常规的1/1000提高到1/400,1/500，某些菊酯类 农药稀释倍数也由3000,5000倍提高到1000倍左右。大量和高浓度使用杀虫剂、杀菌剂的同时，杀伤了许多害虫天敌，破坏了自然界的生态平衡，使过去未构成严重危害的病虫害大量发生，如红蜘蛛、介壳虫、叶蝉及各种土传病害。此外，农药也可以直接造成害虫迅速繁殖，这种使用农药的恶性循环，不仅使防治成本增高、效益降低，更严重的是造成人畜中毒事故增加。长期大量使用化学农药不仅误杀了害虫天敌，还杀伤了对人类无害的昆虫，影响了以昆虫为生的鸟、鱼、蛙等生物;在农药生产、施用量较大的地区，鸟、兽、鱼、蚕等非靶生物伤亡事件也时有发生。生物多样性的减少，破坏了生态平衡，最终将威胁到人类在地球上的生存。 (四) 农药对人类的危害 1983年禁用有机氯农药后，我国的农药向高效、低用量、低残留的方向发展，但许多农药的毒性比有机氯农药强十倍乃至百倍。如有机磷、氨基甲酸酯类农药中相当一部分是高毒和三致(致癌、致畸、致突变)的品种。由于农民缺乏用药知识和技术，个别使用者或不法经营者漠视相关的管理法例和法规，由此而产生的急性中毒事故屡屡发生。除了急性中毒外，在自然界中不能降解的农药，通过食物链的传递和浓缩，最终到达人类体内，在内脏、脂肪中累积而引起各种疾病，甚至癌症。(摘自《绿色化学》) 2.现阶段农药检测技术 目前农药残留分析的主要方法是气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。正是由于这些原因才使得农药残留速测仪和农残速测仪开始成为检测农残的主力技术。目前国内外文献中报道的方法主要有光谱法、色谱法、生物检测技术及活体检测技术等。 2.1光谱分析法 光谱法是根据有机磷农药中的某些官能团水解、还原产物与特殊的显色剂在特定的环境下发生氧化、磺酸化、酯化、螯合等化学反应，产生特定波长颜色反应来进行定性或定量(限量)测定。检出限在微克级，见下。 表中反映的是微量化学试验法，主要用于商品农药的鉴别试验，灵敏度不高、试验干扰因素多,含不同基团的有机磷的反应也不一样，易出现假阴性。为提高灵敏度，现在大部分使用波谱法，即用分光光度计来测定有机磷。经典的比色法是Ellman发展起来的，其基于乙酰胆碱酯酶对底物催化，与显色剂作用显示黄色，进行测定时以碘代硫化乙酰胆碱作为底物，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸 )(DTNB)为显色剂。碘代硫化乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的作用下水解成碘代硫化胆碱，与DTNB作用显黄色，在410nln处测定溶液的吸光度变化，可以进行农药的检测和筛选。 现如今研究较多的是化学发光技术，主要是利用发光物质鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸和过氧草酸等与有机磷进行特殊化学反应，在反应中吸收了释放的化学能，从而处于电子激发态的反应中间体或反映产物由激发态回到基态时产生光辐射，检测限达到ng/L水平。 2.2色谱法 2.2.1薄层色谱法 薄层色谱法是一种较成熟的、应用也较广的微量快速检测方法。先用适宜的溶剂提取农药， 经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后与农药比较来进行定性测定，用薄层扫 描仪进行定量测定，检出限达0.1-0.01µg。由于样品中农残成份复杂，农药含量较低，为此， 国内外针对该方法的不同实验步骤，如提取方法、纯化方法、浓缩方法、薄层板的吸附剂种类、 展开剂的配制、展开方式(如单向和双向展开)以及显色方法都作了深入的研究和改进。 2.2.2气相色谱法(GC) 气相色谱法是检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的农 药注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的农药在固定相中分离，经不同的检测器检测扫描 绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面积与标准曲线对照来定量。该方法具有 即定性又定量、准确、灵敏度高，并且一次可以测定多种成分的优点。用于农药残留量检测的 检测器主要是电子捕获检测器(ECD)、火焰光度检测器(FPD)、氮磷检测器(NPD),采用的色谱柱 主要是填充柱和毛细管柱。毛细管色谱柱具有比填充柱分离效能高(可达到1000000理论塔板 数)、速度快、样品用量少等优点,近年来越来越广泛应用于农药残留量检测。最近几年采用双 柱(不同极性)、两检测器(相同或不同)可同时进行定性、定量检测,并且可以和质谱连用 (GC-MS)，以减少干扰物的影响，提高仪器的灵敏度，但仪器价格昂贵。 2.2.3液相色谱法 1) 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是在液相柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而发展起来的色谱分析方法。一般来说，HPLC法的检出限要高于GC法，HPLC能对GC不能分析的高沸点或不稳定的农药可以进行有效的分离检测，是农药残留定性、定量分析的有效手段。HPLC在进行农药残留分析时一般以甲醇、乙腈等水溶性溶剂作流动相的反相色谱，用C18、C8作填料。与GC相比，HPLC的流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值可以灵活调节，这样更利于分离。 2) 液相色谱-质谱联用法 对于高极性、热不稳定性、难挥发的大分子有机化合物，使用GC-MS有困难，而液相色谱的应用不受沸点的限制，并能对热稳定性差的试样进行分离、分析。然而液相色谱的定性能力更弱，因此液相色谱与质谱的联用，其意义是显而易见的。LC-MS对分析技术和仪器的要求高，但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。 3) 超临界流体色谱法(SFC) 超临界流体色谱法既可以分析热不稳定的农药、同时还具有GC的分析优点、并且GC和LC的检测器它都可以使用，另外硫化学发光检测器在SFC上应用不论是重复性还是稳定性都取得很好的结果，其检出限达到pg级。由于超临界流体色谱需要一定的特殊设备，使目前广泛应用受到限制，但它同时具有许多独特的优点，使其在多种农药残留的分离提取和检测中得到应用，是农药残留分析最具有吸引力的技术之一。 2.2.4毛细管电泳法 毛细管电泳 (CE)，是近年来发展起来的一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析方法，是现代分析化学研究的前沿领域之一。毛细管电泳在分析检测杀虫剂、杀菌剂以及除草剂残留方面取得了不断进展，尤以各种除草剂的分离、单种农药制剂及复配农药的有效成分含量测定为多。随着愈来愈多的开拓性工作的不断推进，毛细管电泳在将来的农药分析中会得到更广泛的应用。 2.3生物检测技术 2.3.1免疫检测法 免疫检测法是利用抗原和相应抗体在体外也能特异性结合的原理发展的一类特异、灵敏、快速的检测技术，用于检测农药残留所面临的两个主要问题是农药抗体的制备和检测样本基底的影响。酶联免疫吸附测定技术(ELISA)是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微凉的测定技术，其原理是通过在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下，复合物伤的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解 底物浓度与显色程度成正比，通过分光光度计测定从而确定是否存在未知抗原及其含量。已有大量文献报道ELISA技术，而且一些发达国家已开发出商品检测试剂盒应用于食品、蔬菜和环境的农药残留分析。最近在分析化学领域日益受到关注的分子印迹技术，可以利用化学手段合成一种被称为分子印迹聚合物(MIP)的高分子聚合物，MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物，在免疫分析中可以取代生物抗体，被科学家誉为塑料抗体，与生物抗体比较，MIP具有稳定性好、制备周期短、费用低、易于保存和可在粗糙环境中应用等优势。 2.3.2生物传感器 生物传感器是利用生物活性物质如酶、抗原、抗体、细胞、组织等作为传感器的识别元件，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应(形成复合物、发色、发光等)转换成可以输出检测的信号(电压、频率等)，通过分析信号对待测物进行定性和定量检测。目前在农药残留分析中，除酶生物传感器、免疫传感器等传统生物传感器外，还出现了一些新型生物传感器。 1) 酶生物传感器 酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。它是利用酶在生化反应中的特殊催化作用，当酶浸入被测溶液，待测底物进入酶层的内部并参与反应，大部分酶反应都会产生或消耗一种被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的浓度可以通过电位或电流的模式进行测定，从而得知酶的活性被抑制的程度来推算样品中农药残留的水平。酶生物传感器的关键在于酶源的选择和酶敏感层的制备，不同来源酶制作的传感器，灵敏度和稳定性可能相差很大。酶生物传感器一般只能检测对酶有抑制作用或作为酶底物的一类化合物，作为农药残留初步筛检的方法，具有简便、快速的优点，但所用酶几乎都是从自然界筛选，来之不易，成本较贵，不易保存，难以多次反复使用。 2) 免疫传感器 免疫传感器是将抗体或抗原固定在电极上，抗原抗体的结合反应通过换能器产生可测定的信号，它结合了免疫反应灵敏、特异和传感器实时、快速的优势，在农药残留分析中受到较多的关注。 3) 其他生物技术 利用分子印迹聚合物制作的仿生生物传感器，原理为:原理:模板分子与功能单体在合适分散介质中依靠相互作用力，如共价键、氢键、离子键、范德华力、疏水作用以及空间位阻效应等，形成可逆结合的复合物;再加入交联剂在光、热、电场等作用以及引发剂和致孔剂辅助下形成既具有一定刚性又具有一定柔性的多孔三维立体功能材料，并且将模板分子有规律的包在其 中;合成后用一定方法把模板分子去除，从而获得与模板分子互补有特异识别功能的三维孔穴， 以便用于与模板分子再结合。 生物芯片技术，原理为:在一小片固相载体上储存大量的生物信息(多至几十万个)，并与 生物化学处理等技术相结合而发展起来的一种新兴技术。将抗有机磷抗体固定于生物芯片上， 通过被标记过的抗原(有机磷与其他大分子物质的结合物)与抗体的特异性结合反应达到对农药 的检测。在有机磷农药中，最常用的显色技术是酶标技术、荧光素标记技术与发光免疫标记技 术。 2.4酶抑制法 酶抑制法是利用有机磷的毒理特性建立的一种快速检测方法。在一定条件下，有机磷农药 对某些酯酶催化水解的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度正相关。这些酯酶包括: 各种动物来源的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶以及从某些植物中提取的植物酯酶。使这些酶与 样本进行反应，如果试样中没有农药残留或者残留量极少，酶的活性就不被抑制;反之，如果农 药残留量比较高，酶的活性就会被农药所抑制，再利用一些特定的颜色或pH值等的变化，从而 达到检测有机磷农药的目的。依据酶抑制法原理的农药残留检测方法主要有试纸法(速测 卡、速测箱)、比色法和酶传感器法。 2.5活体检测法 活体检测法是使用活的生物直接测定，如农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，通过 细菌发光情况，则可测出农药残留量。但该法只对少数药剂有反应，无法辨别残留农药的种类， 准确性较低，使用家蝇检测水果和蔬菜中的农药残留，过程简单，无需复杂仪器，农户便可自 行检测，缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的水果和蔬菜。 2.6 农残速测仪检测方法 农残速测仪是浙江托普仪器有限公司根据国标GB/T5009.199-2003，采用酶抑制原理和光电比色法原理研制而成。主要型号一般为NY-8D/NY-16D、NY-8DL/NY-16DL。 农残速测仪用途 农药是把“双刃剑”，对促进农业增产有着及其重要的作用，但由于农药本身固有的化学性和对其使用不当，导致农产品农药残留超标，危害广大人民的身体健康。2012年全国各地《基层农技推广体系建设项目》已经启动，农药残留速测仪可以快速检测水果、蔬菜中的农药残留，从而能够有效的控制农药的使用量。同时该仪器广泛应用于产品质量监督检验、卫生防疫、环境保护、工商管理、蔬菜批发市场、蔬菜生产基地、超市、商场、农药残留监测系统等部门的蔬菜和水果中的农药残毒检测。 农残速测仪原理 在一定条件下，有机磷和氨基甲酸类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计测定412nm下吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留。可以实现有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的现场快速检测。它可以广泛应用于产品质量监督检验、卫生防疫、环境保护、工商管理、蔬菜批发市场、蔬菜生产基地、超市、商场、农药残留监测系统等部门的蔬菜和水果中。 农残速测仪的功能特点: 多通道测试，支持多样品同时检测 测试结果定性和定量均可，定性显示结果为抑制率，定量显示结果为mg/kg(PPM) 主机上可以自动判别检测结果是否合格 仪器自带嵌入式微型打印机，与仪器一体，可以直接将定性定量的结果同时打印出来。 带有反应时间设定和合格标准设定 具有自动保存检测结果，并能查询保存的记录 7寸彩色液晶大屏幕触摸屏显示，可直接点击屏幕操作也可用鼠标操作,柱状图显示，直接读数。 主机内置客户管理系统，每个用户可设定密码并支持多用户分别登陆，可按检测日期和检测编号查阅，打印，删除存储测量数据。 带USB通讯接口和网络接口，电脑操作和仪器独立操作两用。 上位机软件功能: 具有合格不合格的着色示警提示功能。 上位机软件包含农药检测、数据读取、基础资料管理、数据、图形报表、数据管理等模块，对样品的检测结果进行读取、编辑、统计、管理、查询、打印等功能。 农残速测仪的技术参数: 农药定量含量测量范围:0-20mg/kg 抑制率显示范围:0-100% 抑制率测量范围:0-100% 透射比准确度??1.5%; 透射比重复性?0.5%(3分钟); 灵敏度:重铬酸钾溶液?3.17×10(A/ug.ml),硫酸铜溶液?4.50×10(A/ug.ml) 稳定性:预热20分钟后，光电流3分钟内漂移引起的透射比(T)值变化不超过1.0%(或吸光度(A)值0.005)电压:220V?10% 检测时间设定:0,9min任意设定 农残速测仪 农残速测仪使用方法 开机 打开仪器背面电源开关，仪器显示开机画面，按画面提示操作，在进行检测之前先校正仪器零点(开机后，在检测界面下，按“调零”键，对所有通道同时调零)仪器进入待机检测状态。 试剂配制 (配套试剂:LS农残速测试剂) 2.1、缓冲液:取1包缓冲剂加入500mL蒸馏水或纯净水中，搅拌溶解制成磷酸缓冲液(pH7.6), 常温保存。 2.2、显色剂:取1瓶显色剂加25mL缓冲液溶解，使用时取100μL，4?冰箱保存。 2.3、底 物:取1瓶底物加12.5mL蒸馏水或纯净水溶解，使用时取100μL，4?冰箱保存; 或取1瓶底物加2.5mL蒸馏水或纯净水溶解 ，使用时取20μL，4?冰箱保存。 2.4、 胆碱酯酶:酶制剂无需配制，可直接取用，使用时取100μL，4?冰箱保存。 样品提取 取2g果蔬样品(块茎类取4g)，叶菜剪成25px左右见方的碎片，块茎类取横截面样品或取其表皮，放入三角瓶中，加入10mL缓冲液，振荡1,2min ，倒出提取液，静置2min，待测。若提取液混浊或杂质太多可过滤后再测。 测试 1、 对照测试:于反应瓶中加入2.5mL缓冲液，再分别加入100μL酶液和显色剂，混匀，静置反应10min后加入100μL(或20μL)底物，摇匀并立即倒入比色杯中，及时放入仪器的测量室通道中。按〈对照〉键，显示屏延迟设定秒数后，测量时间开始倒计时，计时完毕，显示屏显示对照吸光度增量(ΔΑ)，并提示完成。在进行对照测试时，其他通道可同时进行样品测试。 2、样品测试:于反应瓶中加入2.5mL待测液，再分别加入100μL酶液和显色剂，混匀，静置反应10min后加入100μL(或20μL)底物，摇匀并立即倒入比色皿中，及时放入仪器的测量室通道。按〈样品〉键，显示屏下方延迟设定秒数后，测量时间开始倒计时，计时完毕，显示屏显示样品吸光度增量(ΔΑ)及抑制率，并提示合格或超标。数据可进行自动保存，如有需要按〈打印〉键打印。 3.总结 综合比较以上各种方法，光谱法和色谱法检查精度高，但实验的步骤复杂，设备较贵，适合 于检测部门检查使用。浙江托普仪器的NY-8D型农残速测仪则可以很方便的进行农药残留的检 测，是一种很科学的检测方法。生物检测技术中的ELISA技术具有灵敏度高、快速、方便简捷 的特点,适宜现场筛选和大量样品的快速分析,但是由于它有很强的特异性,一种试剂盒只能检 测单一有机磷农药,并且对结构类似的化合物还有一定程度的交叉,再加上免疫法的开发过程需 投入较多的资金和较长的时间,所以限制了其在农药检测中的广泛应用;酶生物传感器具有检测 时间短、检测大量样本、检测成本低、对于检测人员技术水平要求低、易于推广等特点，是目 前我国控制高毒农药残留的一种有效的方法，也是目前国内应用最为广泛的农药残留快速检测 方法，但该农药残留快速检测方法原理上仅限于胆碱酯酶的功能被抑，因而其检测农药种类只限于有机磷和氨基甲酸酯类农药，不能给出定性、定量检测结果，检测限普遍高于国际和国内规定的残留限量标准值，有待进一步改善。生物传感器在实验条件下使用状态良好，但实际应用中难以广泛推广，主要在于稳定性、精确度和可信度，主要难点有如何筛分高活性酶、如何固定酶以及增强传感器的适用范围。依托现代生物技术如生物酶抑制技术、ELISA、芯片技术等，便携、灵敏、快速、稳定的生物传感器是将来的发展趋势。 现在的快速检测技术主要是集中在酶抑制法的开发上。主要的实际应用有乙酰胆碱酯酶传感器、比色法和残毒速测箱。其中乙酰胆碱酯酶传感器技术有文献提到用金纳米-壳聚糖复合膜固定乙酰胆碱酯酶，有机磷检出限可达到0.03ng/mL，在0.1到20ng/mL浓度范围内和抑制率有较好的线性关系。比色法的优点主要表现在前处理简单、检测时间短、仪器要求简单，分光光度计改装即能满足检测要求，缺点主要表现在干扰因素多、重复性差、抑制率由于操作误差出现负值、监测范围小，植物组织液中的一些成分可能会与显色剂反应等方面，一般用于大量抽检样本的快速筛分。残毒速测箱主要是基于酶片上酶被抑制的情况，检测基质是否水解而导致颜色变化，从而实现检测，主要用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，检测精度较差，适于田间快速筛选大量样本。