植物组织培养设计方案

组织培养自主选材实验方案 组员： 材料： 月季茎段、10-15cm高的健壮干净的芦荟幼苗茎段、健康干净的百合花 所需用品及数量： 超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、电热炉X1、镊子X4、解剖刀X2、解剖剪X2、1L搪瓷量杯X1、500ml烧杯X2、100ml烧杯X2、1L量筒X1、250ml三角瓶X3、100ml量筒X2、培养皿X10、滤纸、吸水纸、保鲜膜、牛皮纸、100ml三角瓶X30、胶头滴管X4、100ml量筒X2、广口瓶X2、玻璃棒X1、酒精棉球、橡皮筋X70、3%次氯酸钠、无水乙醇、0.1%升汞 实验步骤： 1、玻璃器皿清洗 2、母液配制 MS培养基配方（单位：mg） 大量元素（母液Ⅰ） 成分 称取量 （母液500ml） 称取量 （母液1000ml） 扩大倍数 配1L吸取量（ml） NH4NO3 16500 33000 20× 50 KNO3 19000 38000 MgSO4·7H2O 3700 7400 KH2PO4 1700 3400           CaCl2·2H2O 4400 8800 20× 50           微量元素（母液Ⅱ） ZnSO4·7H2O 860 1720 200× 5 H3BO3 620 1240 KI 83 166 NaMoO4·2H2O 25 50 CuSO4·5H2O 2.5 5 CoCl2·6H2O 2.5 5           铁盐（母液Ⅲ） Na·EDTA·2H2O 3725 7450 200× 5 FeSO4·7H2O 2785 5570           有机物（母液Ⅳ） 甘氨酸 100 200 200× 5 盐酸硫胺素（B1） 20 40 盐酸吡哆醇素（B6） 25 50 烟酸 25 50           肌醇（单配） 5000 10000 100× 10           按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化：30g，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂：9g。搅拌加热使琼脂完全溶化，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，并用蒸馏水定容至终体积：1L。 3、各激素培养基和灭菌 月季：MS基础培养基+0.5 mg/L6-BA+0.05mg/LNAA，250ml，分装为10瓶 芦荟:  MS基础培养基 +3mg/ L6-BA+0.3mg/LNAA，250ml，分装为10瓶 百合花：MS基础培养基+1.0mg/LN AA+0.2mg/L6-BA，250ml，分装为10瓶 分装时应特别注意不要污染瓶口，用裁成适当大小的二层牛皮纸封口，橡皮筋轧口。用记号笔在瓶口的牛皮上写上组号及处理组名称。 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。注意要把锅内气体放掉。 培养基体积与灭菌时间的关系 培养基体积（ml） 灭菌温度（℃） 灭菌时间（min.） 20－50 121 20 50－500 121 25 500－5000 125 35       4、其他所需灭菌物品： 10套培养皿，若干滤纸，无菌水，若干吸水纸，解剖刀柄，剪刀，镊子等。 5、接种操作方法 1、材料预处理： （1）月季茎段洗净，带入无菌室； （2）、用自来水冲洗芦荟茎段10分钟，带入无菌室； （3）、将百合花放在0.5%-1.0%的洗衣粉水中漂洗15min，再用清水冲洗30min，带入无菌室。 2、用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的、工具、培养基等准备好放入工作台。打开紫外灯和风机至少20分钟后开始操作。 3、用自来水将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，才可进入超净工作台开始接种操作。 4、关闭紫外灯，点燃酒精灯。 5、取一无菌培养皿： 1 先用75%酒精浸没月季茎段并轻摇10秒进行预消毒； 2 倒出酒精，加入3%次氯酸钠浸没，轻摇11分钟； 3 倒净次氯酸钠，用无菌水冲洗5遍以上，倒出无菌水。 将消毒后的月季茎段放入无菌培养皿中，用解剖剪和解剖刀将嫩叶剪成1*1大小接种到三角烧杯中，每瓶3—5个，接10瓶，用牛皮纸封口，并用油性记号笔写上接种日期。 4 将预处理的芦荟用75%的酒精浸泡30s-60s，然后用无菌水冲洗三次 5 用0.1%的升汞浸泡8分钟，再用无菌水冲洗三次 ⑥、取出芦荟外植体，放入无菌培养皿中进行切割, 切割完毕后将芦荟茎段1*1放入培养基中，每个三角烧瓶放6-7块，接10瓶，用牛皮纸封口, 并用油性记号笔写上接种日期。 ⑦、将预处理的将百合花瓣,用75%的酒精浸泡30s-60s，然后用无菌水冲洗三次 ⑧、用0.1%的升汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗4~5次， ⑨、取出百合花瓣，放入已灭菌的培养皿中进行切割，每次切割花瓣下部2*2大小 ，切割完毕后将材料放入培养基中，每个三角烧瓶放3~4块, 接10瓶，将锥形瓶用牛皮纸包好，并用油性记号笔写上接种日期。 6、接种后的三角瓶用保鲜膜再次封口。置于培养室（靠窗部分）25℃条件下，黑暗或光照培养2-3周，直至愈伤组织形成。 茎尖为材料，诱导、继代（丛生芽）培养基为MS+BA 2.5mg/l（以下单位同）+IAA 1.5