细菌脂多糖体外诱导子宫内膜细胞炎症模型的建立

细菌脂多糖体外诱导子宫内膜细胞炎症模型的建立 细菌脂多糖体外诱导子宫内膜细胞炎症模 型的建立 第11卷第3期 2005年6月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.11.No.3 Jun.,2005 ? 方法探讨? 细菌脂多糖体外诱导子宫 内膜细胞炎症模型的建立 付灵梅,游慧,尤昭玲,谭朝阳 (湖南中医学院中西医结合系,湖南长沙410007) 子宫内膜是衬于子宫腔内面的一层粘膜.它成分复杂, 功能多样,每月都要经历一次增生,分泌和剥脱的特征性变 化.临床上炎症因素所导致的妇产疾病尤为常见.有 表明,异常子宫出血患者子宫内膜细菌检出率为79.5%,其 中金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌比例最高,被认为是异常出 血的主要致病菌….本实验采用大肠杆菌产生的细菌脂多 糖(LPS)(SIGMA公司0127:B8)诱导子宫内膜炎症模型,为进 一 步对子宫内膜炎症相关机理的研究和治疗药物疗效的评 定奠定了基础. 1材料和方法 1.1主要试剂及仪器LPS(SIGMA公司0127:B8,溶于D— MEN/F-12(含10%胎牛血清)的培养液中,用0.22ttm滤膜加 压过滤除菌,置4oC过夜备用),D—MEM/F-12培养基(GIBCO 产品,加入青霉素100U/mL,链霉素100U/mL,肝素50mg/mL), 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)胰蛋白酶 (配制成0.25%浓度后4~C冷藏过夜),乙二胺四乙二钠盐 (EDTA),四氮唑蓝(M'IT),二甲基亚砜(DMSO).主要仪器设 备:CO培养箱(德国贺利氏Heracel1),超净工作台(苏州SW- CJ.2FD),倒置显微镜(重庆光学仪器厂),酶标仪(芬兰 LabsystemMK3),荧光显微镜(江南光学仪器厂).检测药盒: 鼠抗人波形蛋白抗体(vimentin),鼠抗人角蛋白抗体 (cytokeratin)(鼎国生物),人白介素.1t3(IL-113)定量EIA试剂 盒,人肿瘤坏死因子.a(1'NF_a)定量EIA试剂盒(上海森雄). 1.2标本来源及子宫内膜细胞的培养方法组织标本均来 自于门诊病人,患者年龄18—45岁,3个月内未服用任何激 素类药物,如避孕药,氟灭酸等影响内分泌的药物.刮取月 经周期714d患者的子宫腔前,后壁正常内膜各2条.全过 程均在无菌条件下完成,标本在30rain内低温转送到实验室 进行处理.取病理检查正常的子宫内膜组织进行实验. 培养方法参照文献.用0.25%的胰蛋白酶2—3mL, 置37?恒温水浴箱中振荡消化10min后,加入D.MEM/F-12 (含胎牛血清15%)终止消化.反复吹打未消化的组织块,经 台盼蓝染色证明活细胞数大于90%,并调整细胞密度为1× 收稿日期:2004-03.12 基金项目:国家自然科学基金资助项目(C30271633) 通讯作者:付灵梅,Tel:(0731)5381112 ?70? lO'/mL,吸出细胞悬液放入培养瓶,置于37?,5%c0培养箱 中培养.传代后的细胞接种于96孔培养板中,待细胞重新 长满汇合后,用于以下实验. 1.3实验方法(1)LPS的药物剂量确定筛选实验.细胞分 组:取96孔细胞培养板中生长良好的处于对数生长期的细 胞,随机分为6组(5个不同浓度的LPS组,浓度分别为(1, 10,100,1000,10000)ttg/mL,和1个空白对照组),每组5个孔, 各LPS组换液后添加100~tL不同剂量的LPS,空白对照组添 加100~tL的D—hanks.放入37?,5%c培养箱中培养48h. 48h后每孔加入5mmL的MTI'20~tL,继续温育4h.吸去培养 液,加入含100~tL的DMSO,震荡5rain,使微小黑色结晶溶解, 形成均匀蓝紫色溶液.用酶标仪测定吸光度(A),测定波长 570rim,以不加细胞的孔调零,计算药物对细胞的抑制率(m ?10%),确定LPS的最佳浓度进行下面的实验,同时进行形 态学观察. 抑制率=对照组吸光度一实验组吸光度 照组×10o% (2)炎症模型实验.将接种于96孔培养板中处于对数 生长期的细胞,随机分为3组,每组5个样本,空白对照组, 48h模型组,72h模型组.收集(48,72)h两个时间段的细胞 培养液,离心后取培养上清液进行IL-18,TNF-a的检测.同 时每个时间段用倒置相差显微镜进行各组细胞的形态学观 察. 1.4IL-18和TNF-a的测定采用双抗体夹L-ABC—ELISA 法.用抗人IL-113或TNF-a单抗包被于酶标板上,标准品和 样品中的IL-113或TNF.a与单抗结合,加入生物素化的抗人 IL-113或TNF-a抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧 化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出 现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,IL-113 或TNF-a.浓度与OD值成正比,通过绘制标准曲线求出标 本中IL18或TNF-a的浓度. 1.s统计学处理所有数据均用SPSS10.0软件包进行处 理,方差齐用方差分析,两两比较用q检验,方差不齐用秩和 检验. 2结果 2.1LPS的药物剂量确定筛选实验诱导药物LPS剂量筛 选的MTY实验发现,从100t,eCmL的浓度起才有作用,呈浓度 依赖性.最接近IR?10为100ttg/mL组的浓度,所以最后选 取的最佳浓度为100ttg/mL组的浓度.形态学观察:lOOOt,e~ mL组细胞明显收缩,形态不规则,少量飘浮死亡,与空白对 照组相比,细胞出现超微结构的改变包括细胞核极度不规 则,核膜明显内陷.在胞浆中出现大量的空泡和脂肪体,线 粒体肿胀并扩大,溶酶体增多,细胞之间的间隙增宽. 100OOtcc'mL组细胞大量崩解死亡.其余各组形态基本正常. 2.2炎症模型实验见表2,表3.正常对照组在培养期间 IL-113,TNF-a的分泌很低,但是在模型组,随着LPS诱导时间 的延长,这两种细胞因子的分泌呈上升趋势.经统计学分析 显示,48h和72h模型组IL-113,TNF-a的含量明显高于同时段 第11卷第3期 2005年6月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01.11.No.3 Jun..2005 正常对照组(P<O.O1);同时模型组72h时间段IL-113,TNF—a 的吉量明显高于48h时间段(P<0.O1).形态学观察显示, 48h时间段正常对照组细胞接种后,经过贴壁,伸展,分裂增 殖,布满整个培养板的孔底.细胞形态正常,生长良好,间质 细胞形态呈梭形,平行排列成束生长,上皮细胞形态类似蝌 蚪形,形成漩涡状排列,细胞间连接紧密.经LPS作用后的 模型组较多的细胞仍维持正常外观,少数细胞形态发生变 化.倒置相差显微镜和普通显微镜下主要表现为少数细胞 收缩成圆形固缩状,细胞间隙稍增宽,有少部分细胞发生脱 落并出现异常颗粒.72h后再次在显微镜下观察,正常对照 组细胞分裂增殖,数目明显增多.细胞形态正常,生长良好. 而LPS模型组的细胞形态发生显着变化.镜下观察发现较 多的细胞发生严重的收缩,细胞连接消失,间隙较前大大增 宽,细胞脱落数目增加.胞浆中出现大量的空泡和脂肪体, 溶酶体增多.并有大部分上皮细胞失去原有的形态,细胞纵 轴拉长,横轴缩短,表现为成纤维细胞型外观. 表1LPS对正常子宫内膜细胞生长的抑制作用(n=5) 注:与空白对照组相比较P<O.05,P<O.01. 表2LPS对人子宫内膜细胞培养液IL-I~含?的影响 (p~mL,n:5,;?s) 组别 48h72h 注:每组48h和72h时间段相比较,P<O.01;与模型组72h时 间段相比较,.'P<O.01;与同时段正常对照组相比较,P<0.01. (下同) 表3对人子宫内膜细胞培养液TNF-a含?的影响 (pCmL,n=5,4-s,n) TNF—a(pg/mL) 组别—— 48h72h 3讨论 LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁外膜的主要组成成分,是 弓I起炎症反应的关键性介质之一.临床上子宫内膜局部发 生炎症反应时,它能刺激单核一巨噬细胞,多形核细胞和子 宫内膜细胞等分泌众多细胞因子如TNF—a,IL-I~.根据有关 文献报道本实验利用最原始的刺激物大肠杆菌型LPS诱 导细胞,模拟临床常见的妇产科炎症的发病机理.选取II广 1p,TNF—a这两个经典的急性炎症早期细胞因子作为衡量模 型成功与否的标准.通过细胞毒实验对诱导剂的5个梯度 浓度进行筛选,确定既适合细胞生长,又可导致炎症模型的 LPS浓度.然后按照此浓度施加于正常子宫内膜细胞,分别 检测48h和72h的细胞培养液中TNF—a,IL-I~的含量.实验 结果证明,在100t~/mL浓度时,细胞可正常生长,且两时段 的TNF—a,IL1]]含量明显高于正常对照组(P<0.O1).且 TNF-a,IL-I~的分泌在72h内与时间成正比.结果显示,该子 宫内膜炎症模型成功,且在72h内存在将炎症反应不断放 大,加重的过程.目前所建立的细胞炎症模型中,关于子宫 内膜细胞的炎症模型甚少.而临床上炎症因素所导致的妇 产科疾病临床却尤为常见.本实验利用最原始的刺激物诱 导细胞,对于诱导时间及用量进行定量化,检测方法标准化, 为进一步的实验提供了必要的基础.本模型的建立为今后 妇产科子宫内膜的炎症反应机理的研究和相关药物疗效的 评价及药理学方面的研究奠定了基础. 本实验的结果表明正常的子宫内膜细胞在筛选浓度的 LPS培养液的诱导下,TNF_a和IL广1B的浓度在72h内与时间 成正相关,分泌的急性炎症早期细胞因子TNF—a,IL-I~的浓 度呈上升趋势,与正常对照组同时间段相比有显着的差别 (P<0.O1).可推测其中存在将炎症反应不断放大,加重的 过程.解放军304医院姚咏明研究员的内毒素增敏假说 从分子和基因水平揭示了内毒素增敏系统——脂多糖结合 蛋白(LPSbindingprotein,LBP)和脂多糖受体(CD14)在严重创 伤后内毒素血症诱发多器官损害中的作用.LPS介导的细胞 激活需要血浆中或细胞表面存在能够与LPS结合的蛋白质 的参与.这些蛋白包括LPS结合蛋白和CD14,IX'S-一LBP复合 物与CD14结合后可介导细胞反应J.创伤,烧伤,休克等应 激状态一方面引起LBP/CD14表达上调,使机体对内毒素的 敏感性增高.另一方面,组织内毒素通过表达上调的LBP/ CD14激活多种炎症细胞,释放炎症细胞因子,致使炎症反应 不断放大,加重,最终导致全身失控炎症反应和多器官功能 障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)o 在炎症反应的复杂细胞因子网络中,核因子-cB(NF-~B, nuclearfactorKB)的激活可能是一个中心环节.NF-JcB是 一 种广泛存在于各种细胞,具有多种调节作用的转录因子. 它在正常情况下在胞浆内与抑制蛋白(kB)结合而呈非活性 状态.当细胞受到各种刺激原,如:紫外辐射,细胞因子(如 TNF—a,IL-1),活性氧作用时,NF—KB与I棚解离并进入细胞核 内,与特定的启动因子结合,从而调控各种基因的表达,如: 细胞因子,炎症因子,粘附分子,趋化因子和急性期反应蛋白 等.在子宫局部发生炎症时,细菌脂多糖(LPS)和白细胞呼 吸暴发过程产生的活性氧均可通过激活腺上皮细胞NF一.cB 引起肿瘤坏死因子一a(TNF—a),白细胞介素一1(IL-I)转录增多, 二者又是NF—KB的激活剂,从而引起中性粒细胞(neutrophils, Neu),M,淋巴细胞NF—KB激活,通过TNF—a,IL-1的正反馈作 ? 71? 第11卷第3期 2005年6月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.11,No.3 Jun.,2005 用,NF—tcB的激活进一步增加,形成级联反应'川,从而使炎 症反应放大及延续. 本实验通过观察LPS诱导的子宫内膜细胞分泌炎症细 胞因子的规律,在一定程度上支持了内毒素增敏假说和NF- B的级联反应.为后续的实验奠定了基础. 参考文献: [1]唐林,施志欣,李志明.异常子宫出血患者子宫内膜的 细菌培养[J].中华妇产科杂志,1998,33(8):502.503. 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