化药1205张建刚 120150121 甘草皂苷的提取方法和含量测定

甘草皂苷的提取方法和含量测定研究概况 张建刚 化工与制药专业化工与制药1205班学号120150121 指导老师刘雪凌讲师 摘要本文综述了甘草中有效成分甘草皂苷的提取和测定方法的研究概况。稀醇溶液对甘草酸的提取效果较好,添加稀氨水后可提高甘草皂苷的提取收率;超声波强化或微波辅助提取可提高甘草皂苷的提取效率并节约提取溶剂和提取时间 ,CO2超临界流体法无毒、高效且不需加热即可将甘草皂苷与溶质分离开来;TLC ,HPLC ,CE方法可实现甘草皂苷含量的快速、准确测定。 关键词甘草甘草皂苷提取测定概况 1 甘草是我国常用的中草药品种之一 ,除主要医药用外 ,还广泛地应用于烟草、食品、酿造以及化妆品工业等领域[1]。甘草的主要有效成分为甘草皂苷(glycyrrhizic acid)或甘草甜素(glycyrrhizin)及甘草次酸(glycyrrhetinic acid)等三萜类化合物、甘草黄酮类化合物以及甘草多糖等[2]。药理研究表明 ,甘草酸及甘草次酸具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用 ,近年来 ,还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病等[3]。甘草酸及甘草次酸的提取和含量的测定在甘草研究中具有举足轻重的地位。我国虽是甘草生产和出口的大国 ,但对甘草主要有效成分甘草酸的生物合成、作用机制、精制加工和综合利用的深入研究还落后于日本等国。受技术条件和工艺限制 ,应用传统方法提取的甘草酸粗品的纯度低 ,在国际市场上的价格低 ,并且提取效率也低 ,对甘草资源的利用不充分 ,影响了我国甘草产业的发展。目前 ,国内外涌现出许多先进的提取技术(如超临界流体提取法、微波辅助提取法等) ,以及高效灵敏的测定方法(如高效液相色谱、毛细管电泳[4]等) ,对这一领域研究的一些进展进行简单的概括 ,希望有助于我国甘草的研究和利用开发。 1甘草酸粗提液的制备方法 1.1 传统提取方法 从甘草及其制品中提取甘草皂苷的传统方法包括室温冷浸法、渗漉法、煎煮和热回流法以及索氏(Soxhlet)提取法。室温冷浸法是在室温条件下 ,将过一定目数筛的甘草粉末直接加入到适当容器中 ,加入适当比例的水、氨水或醇等溶剂浸提 ,其提取的效率较低 ,时间相对较长;渗漉法需要使用特制的渗漉设备 ,不断加入溶剂 ,使与渗出液一直保持相当的浓度差 ,提取效率较冷浸法高 ,但与冷浸法一样提取时间较长 ,溶剂消耗量较大;煎煮和热回流法是通过加热处理 ,增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度 ,热回流法避免了乙醇等低沸点溶剂的挥发损失 ,提取效率较高;索氏(Soxhlet)提取法又称连续回流提取法 ,其利用索氏提取器对甘草粉末进行提取 ,加热蒸发的溶剂经冷凝后又回到样品管中 ,经约 10 个循环后 ,基本可将甘草中的甘草酸提取完全 ,提取效率较高 ,同时节省了溶剂 ,但时间相对较长。 1.2 超声强化提取法(ultrasound wave extraction ,UE) 超声波的频率为20 kHz ,通过超声波的空化作用产生极大的压力 ,造成细胞壁的破裂 ,并在瞬间完成 ,同时产生的振动作用一起强化了细胞内物质的释放、扩展和溶解 ,加速了样品中组分的溶出 ,提取效率较高 ,时间较短。赵茜等[5]以氨水为溶剂研究了超声介入强化提取甘草酸的作用效果 ,通过对施加超声场的功率、温度、浸渍时间、 pH以及搅拌速率等参数进行了研究 ,认为与未施加超声场的传统方法相比 ,超声辅助提取可显著缩短提取时间 ,并获得较高的提取率。 1.3 微波辅助提取法(microwave2assisted extraction ,MAE) 利用微波强化固液浸取过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术[6,7]。该技术具有选择性高、提取时间短、易挥发性成分的提取率高以及不需要特殊的分离等优点。微波是频率介于 300 MHz和 300 GHz之间的电磁波 ,可促使细胞内的介质转动能级跃迁 ,加剧热运动 ,尤其是水分子 ,吸收微波能量 ,使胞内温度迅速上升 ,液态水气化产生的压力将细胞壁和细胞膜冲破 ,形成孔洞和裂纹 ,使胞外的溶剂容易进入细胞内 ,溶出胞内有效成分。其穿透力强、选择性高、加热效率高 ,操作简便、安全、快速、节能。潘学军等研究了微波辅助提取甘草酸的条件[8],发现当微波提取 4~5 min ,乙醇含量为50 %~60 % ,氨水含量为1 %~2 % ,液固比为10∶1(mL· g- 1)时 ,甘草酸的回收率与热回流法、索氏(Soxhlet)提取法、室温提取法等传统提取方法相当 ,但 MAE比传统方法更节约时间和溶剂 ,效率更高。 1.4 超临界流体提取法(supercritical fluid extraction ,SFE) 原理是通过调节压力和温度 ,使物质的气相和液相消失 ,形成超临界流体 ,溶解力与液体相似 ,但扩散系数接近气体 ,因此 ,可对中草药中的成分进行选择性提取 ,提取的效率较高 ,提取液的杂质少 ,提取时间较短。通常使用的超临界流体为CO2 ,其临界温度为31106 ℃,不需要加热就能将溶质和溶剂分开 ,无毒、高效、价廉 ,并具有灭菌功能。李巧玲等[9]研究了超临界流体技术萃取甘草酸的各种因素 ,并与冷浸法、热提法、超声波法提取甘草酸作了比较研究 ,结果表明 SFE法的萃取率高于上述 3 种方法 ,而萃取周期大大缩短 ,并且节省提取溶剂;付玉杰等[10]通过调节温度、压力、CO2流速以及夹带剂与甘草粉末的液固比研究了甘草酸水解产物甘草次酸的超临界 CO2提取的工艺。 2 甘草酸测定的方法 2.1传统测定方法 传统测定甘草皂苷含量的方法是根据甘草酸遇酸沉淀或酸碱反应的理化性质采取重量法或滴定法测定 ,或根据其颜色反应采取比色的方法测定 ,以及根据其紫外吸收特性采用紫外分光光度法测定。重量法是将甘草酸提取液进行过滤 ,加入浓盐酸或硫酸 ,使甘草酸沉淀析出 ,过滤烘干后精密称定 ,即得到样品中含有的甘草酸重量。我国 1977 年版药典规定的甘草测定方法即采用重量法。滴定法是先用酸性丙酮浸出甘草粉末中的甘草酸 ,然后加入氨水 ,生成甘草酸铵沉淀 ,加水溶解后 ,加入已中和过的甲醛溶液 ,用氢氧化钠进行滴定。比色法则一般采用亚甲兰比色法、香草醛2硫酸比色法或 Huang试剂显色等比色法 ,样品甘草酸含量根据曲线求出。刘岩[11]等研究发现甲醇、乙醇等溶剂对显色有干扰 ,需要先将溶剂挥发后再进行比色 ,可提高灵检测的敏度。由于甘草酸的40 %~60 %乙醇溶液在 252 nm有吸收峰 ,可通过测定甘草样品提取液的紫外吸光度来确定甘草酸的含量。一般可先用薄层色谱的方法先将甘草酸在薄层板上分离出来 ,再用乙醇溶液洗脱定容后 ,紫外分光光度计测定250 nm左右的吸光度 ,根据标准曲线计算出甘草酸的含量。 2.2薄层扫描法(TLC) 该方法原理与比色法或分光光度法有类似之处 ,通过测定薄层扫描仪的单色光透过薄层板上的组分斑点的透光度或反光度 ,来定量测定样品中组分的含量。由于采用了薄层色谱与微型计算机扫描相结合的技术 ,因此可同时对大量的样品进行测定 ,操作简单、快速 ,灵敏度好 ,精密度较高。袁珂等[12]采用薄层扫描法测定了复方冬凌草含片中甘草酸的含量 ,不用显色剂在紫外灯下定位 ,操作简便。张继等[13]采用双波长(λs = 425 nm ,λr = 700 nm)反射锯齿扫描法测定了乌拉尔甘草中甘草酸的含量 ,展开剂为醋酸乙酯2甲酸2冰醋酸2水(30∶ 2∶ 2∶ 4) ,10 %硫酸乙醇喷雾 ,110 ℃条件下显色扫描。研究表明 TLC测定甘草酸的含量重复性好 ,但薄层板的厚度、均匀度、显色的时间、显色的温度等对测定结果有影响 ,需要掌握严格的技术条件 ,才能取得较好的测定效果。 2.3气相色谱法(GC) 一般甘草酸先水解为甘草次酸并酯化后测定 ,取一定量溶液注入 DMCS的玻璃柱内 ,在 290 ℃操作 ,氮气为载体 ,流速60~80 mL· min - 1,火焰离子化检测 ,由标准曲线得出甘草酸含量[14]。 2.4高效液相色谱法(HPLC) 与 TLC和 GC相比 ,HPLC具有重复性好、受环境和操作影响小、操作简单、测定迅速的特点 ,成为近年来中药有效成分的重要方法 ,在甘草研究中已获得广泛应用。流动相通常为甲醇2水2醋酸或水2乙腈2醋酸等 ,紫外检测波长为 254nm ,色谱柱为ODS C18 ,流速110 mL· min- 1,柱温 30 ℃。梁月琴等[15]用 HPLC测定甘草及其制剂中甘草酸含量 ,发现此法提取简单 ,测定迅速 ,精密度较好。色谱条件:流动相甲醇201066 mol· L - 1醋酸溶液(65∶ 35) ,pH 310 ,流速 1 mL· min - 1,检测波长255 nm ,色谱柱 C18 (319 mm × 150 mm) ,最低检测量为011μg ,甘草酸的进样量为 2144~19156μg。在 HPLC中采用最多的为反相液相色谱(RP 2HPLC) ,与正相色谱相比, RP 2HPLC操作比较方便。李巧玲等[16]对3种反相色谱技术和流动相的组成、离子抑制剂浓度、流速等影响因素进行了研究 ,找到了分离效果较佳的反相离子抑制分析甘草酸的条件(流动相醋酸2甲醇2水比例为2∶ 73∶25 ,流速015 mL· min- 1) 。 2.5毛细管电泳法(CE) CE的原理是以高压电场为驱动力 ,以毛细管为分离通道 ,根据样品中各组分之间电淌 度或分配行为差异而实现分离的液相分离方法。其特点是样品用量小、柱效高、速度快、自动化程度高 ,可简化样品前处理并有利于多组分分析 ,目前已成为药用植物有效成分分析的主要高效定量分析技术之一 ,在甘草酸的测定中发展也较快。彭军等[17]比较了HPLC、毛细管区带电泳(CZE) 、胶束电动毛细管电泳(MECC)测定甘草制品中甘草酸的含量 ,认为MECC与 HPLC分析数据接近 ,但比 HPLC分离效率高、溶剂用量少 ,是一种很有潜力的分析方法。祖元刚等[18]采用高效毛细管电泳法测定了甘草中甘草酸的含量 ,其采用的电泳条件为:270A2HT型毛细管电泳仪 ,在pH 518的磷酸缓冲液中 ,检测波长为252 nm ,分离电压为25 kV ,进样压力2167 kPa ,温度30 ℃。 3.结论 甘草及甘草制品中有效成分的提取和测定分析技术是研究和控制甘草及其制品质量的重要技术手段 ,不断提高甘草酸提取、分离、纯化和检测技术水平 ,有利于甘草酸药品质量控制的现代化、标准化和化。在甘草酸的提取过程中要求提取快速、完全 ,杂质较少 ,目前以氨性醇的提取效果较好 ,但由于其存在氨气污染等缺点 ,在实际工艺中需要改进加以完善;在甘草酸的测定方法中除本综述的几种分析方法外 ,还有电位滴定法、极谱法、棒状薄层分析法等 ,但目前分析测定方法在向操作简单、快速、自动、高效、经济方向发展 ,在甘草酸的实际测定中主要以液相色谱法为主。 参考文献 [1] 王照兰, 杜建材, 于林清, 等. 甘草的利用价值、研究现状及存在的问题[J]. 中国草地, 2002 ,24(1) :73. 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