5株放线菌对植物病原菌的拮抗作用初探

5株放线菌对植物病原菌的拮抗作用初探 文章编号:1673—887X(2012)05—0072—03 doi:10.3969/j.issn.1673—887X.2012.05.001 5株放线菌 对植物病原菌的拮抗作用初探 摘要该试验采用平板对峙法从所 提供的放线茵中筛选出高抑茵效果的 菌株,同时对其进行液体发酵,采用生 长速率抑制法测定其发酵液粗提取物 的抑茵活性.通过筛选得到抑茵效果较 好的放线菌菌株H33,茵株710,$20的 发酵液也表现出较好的抑茵效果,但由 于其发酵液均为原液的粗提取物,因其 含有放线茵孢子,故不能说明其所表现 的较好的抑茵效果是由其抗生素产物 所致,需要进一步纯化才能确定. 关键词放线菌植物病原茵拮抗 作用 作者简介刘慧平(1956一),女,教 授,博士生导师. 项目基金山西省科技攻关项目 (20100311038),山西省留学归国基 金(2009043) 山西农业大学农学院余玲刘慧平 天津农学院田小卫 1引言 生物农药主要包括生物体农药和 生物化学农药:生物体农药指用来防 除病,虫,草等有害生物的活体生物商 品;生物化学农药是指从生物中分离 出的具有一定化学结构的,对有害生 物有控制作用的生物活性物质.目前 生物化学农药中,农用抗生素用得较 多,多是由放线菌等微生物产生的代 谢产物. 2概念 放线菌是一类具有丝状结构的革 兰氏阳性细菌,营养细胞能分化形成 菌丝并能产生分生孢子.在这一过程 中细胞发展了丰富而灵活的次生代谢 来合成各种控制分化和细胞周期的专 一 性物质.放线菌是人们研究最早并 应用到农业生产中的生防微生物,在 已知的放线菌中,半数以上被发现有 拮抗性.应用于生物防治的放线菌主 要是链霉菌属的种类,其次有诺卡菌 属,游动放线菌,小单孢菌属等. 从农药学的角度对放线菌进行应 用性开发有两条途径:一是直接采用 放线菌代谢产物研发新农药,二是从 中发现具有活性的先导化合物,再进 行结构优化,合成活性化合物.目前, 与其他天然药物开发一样,从放线菌 发现新药物是越来越困难了.第一个 困难是包袱沉重,去重复难度极大;第 二个困难是病原菌的抗药性增加很 快;第三个困难是国内外的研究一致 ,尽管已经描述,保存了大量放线 菌,但仍然有至少90%(甚至99%)的 放线菌未被发现,要拿到这些未被发 现的放线菌难度很大.据相关文献,主 要从化学,菌种,基因三方面突破限制 放线菌药物研发中的瓶颈.即是优化 化学研究手段,探寻放线菌新菌株,结 合基因技术进行菌种改良等. 3试验 3.1试验材料 3.1.1供试病原茵棉花枯萎,甜瓜 枯萎,小麦赤霉,茄子枯萎,苹果腐烂, 番茄早疫. 3.1.2供试放线菌放线菌H33,放 线菌L1,放线菌$20,放线菌N3,放线 菌710,天津农学院植物病理学实验室 提供. 3.1.3培养基?高氏一号琼脂培养 基:葡萄糖2.0%,KNO30.1%,NaC1 0.02%,K2HPO40.1%,MgCO30.03%, FeSO40.001%,CaCO30.05%,琼脂1.5%, pH7.2.@PDA培养基:水1000mL,葡 萄糖20g,琼脂20g,马铃薯200g.液 体发酵培养液:1%/b米浸出汁1000 mL,葡萄糖10.0g,蛋白胨3.0NaC1 2.5g,CaCO32.0g,pH值7.2~7.4. 3-2方法 3.2.1供试病原菌及放线菌的活化培养6种供试病原 真菌进行活化培养,在无菌条件下,将病原菌菌种接种在 PDA平板培养基上.25%恒温培养3,4d,备用.将保存的 5株放线菌在高氏一号培养基上进行划线培养,25%恒温 培养5—7d,备用. 3.2.2抑菌活性作用测定?平板对峙法:在无菌操作 条件下,倒PDA平板,冷却,用直径4mm的打孔器分别打 病原菌和放线菌菌饼.在PDA平板中间接种病原菌,距离 病原菌两边各2.5cm处接种两块放线菌菌饼,3组重复, 25?恒温培养4d,测量抑菌带宽度.?放线菌的发酵培 养:取已活化的高氏一号平板上25%放线菌,连同培养基 放入已灭菌的150mL发酵液中,置于恒温摇床上培养,摇 床的培养温度为28’:E,摇床转速为170r/min,培养时间为 5d.?生长速率法:发酵液与PDA(PDA中加入少许农用 链霉素)以2:8的比例混匀,倒平板,冷却,每个平板中分别 接种3种不同的病原菌菌饼(直径4mm),病原菌之间等距 离,3组重复,同时设置对照,在不加发酵液的PDA平板上 接种病原菌,25%恒温培养45d,采用十字交叉法测定菌 落直径,计算抑菌率. 抑菌率(%)=(1一处理供试菌菌落直径/对照供试菌菌 落直径)×100% 4结果分析 4.1对峙试验结果 表15株放线菌对6种病原菌的抑菌带平均宽度mm 放线菌菌株 病原菌 71OH33L1N3$2o 棉花枯萎菌2.o04.0oO.o01.0o1.2O 甜瓜枯萎菌1.256.004.2OO.0o4.50 小亦_每困2.255.854.OO0.OO5.1O 茄枯萎菌1.5O4.50O.0oO.o03.33 苹果腐烂菌2.853-331.2O1.702.oo 番茄早疫菌7.8O5.0o3.001.105.10 采用对峙培养法,由表1可知,5种放线菌对6种供 试病原菌均有一定程度的抑制作用,其中放线菌H33对 供试病原菌抑菌带相对较大,其对甜瓜枯萎病菌的抑制 效果最明显,抑菌带可达6mm,对小麦赤霉病菌的抑菌带 达5.85mm,抑制效果最小的是苹果腐烂病菌;其次是菌株 $20,其对6种供试病原菌也均有不同程度的抑制作用,抑 制效果最明显的是小麦赤霉病菌和番茄早疫病菌,抑菌带 距离均为5.1mm;抑菌带最小的是菌株N3,由此说明,菌株 H33抑菌效果最好,$20次之,抑菌效果最差的是菌株N3. 4_2发酵液抑菌活性测定 表25株放线菌发酵液对6种病原茵的抑菌作用 放线菌菌株 H33L1N3$20710CK 抑菌直径抑菌直径抑菌直径病直径抑菌抑菌 cm 径 率%cm率%率%cm 原室直径 菌cm%cm率% 棉花2:3347. 992.7738.172.6O41.962.8037.5O2.2O50.894.48枯萎 甜瓜18360. 222.6941.521j870.oo2.2052.172.1O54-354.60枯萎 小麦3 . O359.6O2.9860_272.5865.6O3_3O56.273.0O60.0O7.5O赤霉 茄子 枯萎1.8865382.9445.861-2576.982-3O57.642.8048.435.43 苹果1 . 4852-262.5617.421.8541.931.6050.OO1.8O41.943.10腐烂 番茄 早疫1.0861.841-2854.771-2555.831.2059-360.7075_272.83 为了进一步表明5株放线菌对病原菌的抑制作用,我 们对5株放线菌进行液体摇瓶发酵,发酵液过滤后,采用 菌丝生长速率法对6种病原菌进行抑菌活性测定.结果 从表2可以看出,5株放线菌发酵液均有一定的抑菌活 性,其中,Ll菌株的发酵液提取物抑菌活性较差外,其他 菌株表现出较高的抑菌活性.H33,710菌株发酵液粗提 取物均表现出较好的抑菌活性,H33菌株发酵液除了对 棉花枯萎的抑制作用较差之外,对其他病原菌的抑菌率 均达到了50%以上;而710菌株对番茄早疫的抑制效果 最好,抑菌率达到了75.27%.综合对峙试验的结果,推测 H33菌株及其发酵液对6种供试病原菌具有较高的抑制 作用,因此H33菌株是几株试验放线菌中抑菌活性最好 的菌株. 5结论 对峙培养法的结果表明,5种放线菌对6种供试病原 菌均有一定程度的抑制作用,其中放线菌H33对供试病 原菌抑菌带相对较宽,其对甜瓜枯萎病菌的抑制效果最 明显,抑菌带可达6mm,对小麦赤霉病菌的抑菌带达 5.85mlTl,抑制效果最小的是苹果腐烂病菌;其次是菌株 $20,710和L1菌株,N3菌株的抑制效果最差. 采用生长速率法测定5株放线菌发酵液对供试病原 菌的抑菌作用,结果表明,5株放线菌发酵液均有一定的 抑菌活性,除了L1菌株的发酵液提取物抑菌活性较差 (下转第76页) 9l!CHNOLO—GY&EQ—UIPMENT73 8/78/88/98/108/1l8/128/138/148/158/168/178/188/19 图5彩灯与诱芯诱虫效果的比较 诱芯 彩灯 1d.可以看出彩灯的诱虫规律基本可以体现梨小消长动 态,但少于诱芯的诱捕总量. 3讨论 本实验在赵利鼎的研究基础上,运用可见光对梨小食 心虫趋光性进行了进一步研究.结果表明蓝色的彩灯以及 紫色的LED灯对梨小有显着的诱集效果,彩灯的诱集效 果优于LED灯,主要表现表现在:LED灯诱集结果变异过 大,仅蓝色的趋势与总趋势相同,使得实验结果的误差较 大,或因田间不确定因素所致. 各色彩灯的诱集趋势同彩灯总的诱虫趋势表现出很 强的一致性,实验结果变异小,基于此进一步与诱芯诱集 进行对比,发现趋势基本一致,但高峰比诱芯诱集结果整 体推迟1d,由此猜想梨小的趋光性可能与成虫日龄有密 切关系,该假设尚待进一步研究. 由两组实验进行对比发现诱虫数最多的蓝色彩灯与 紫色的LED灯均属于短波光,而诱虫数最少的红色彩灯 与黄色LED灯均属于长波光,且诱集的虫口数最大值与 最小值之间差异显着,因此认为梨小食心虫可能对短波光 有显着的趋性,而对长波光趋性较弱. 本实验所使用的彩灯灯芯一致,颜色变化来自灯表面 的特殊涂料,而LED灯颜色变化来自于其本身不同的波 长范围.从这个角度来看,LED灯对研究光的波长对梨小 食心虫的影响有较大优势.室外诱集效果不理想可能是由 于虫源及光源导致.关于光波长,光强度乃至更多趋光性 方面的研究仍然有待进一步的实验研究. 参考文献: [1】陈梅香,骆有庆,赵春江等.梨小食心虫研究进展卟北方园艺,2009(8):144,147. 【2】焦瑞莲,怎样识别与防治梨小食心虫与梨大食心虫果农之友,2011(6):41 I31赵利鼎,李先伟,李纪刚等不同诱源对梨小食心虫引诱效果的研究U].山西农业科 学,2010,38(5):51—54 f41魏国树,张青文等.不同光波及光强度下棉铃虫成虫的行为反应卟生物物理学 报,2000,(1):89—94 f51江幸福,张总泽,罗礼智草地螟成虫对不同光波光强的趋光性U】,植物保护 2011,36(6):69—73 『61张海强,闫海霞,张顺等.光强度对大草蛉成虫感光性和趋光性行为的影响U1昆虫学 报,2009,52(4):461—464 『7l杨桂华,王蕴生.亚洲玉米螟雌雄蛾对不同光波的趋性卟玉米科学,1995(增刊):70—71 『8]王智光,郑德之.桃小成虫趋光性研究lI1l果树科学,1985(2):34—37 『91王明明.磁场和LED光照对小菜蛾生物学特性的影响【D】.江苏:扬州大学,2010:1—51 [1()]刘晓英,焦学磊,郭世荣,徐志刚基于LED诱虫灯的果蝇趋光性实验卟农业机械学报2009,40(10):178—180 【11】郑月,吴伟坚,符悦冠螺旋粉虱对不同波长的发光二级管的趋光反应[『j_环境昆虫学报2010,32(3):423—426 (上接第73页) 外,其他菌株发酵液均表现出较高的抑菌活性.抑菌活性 较好的放线菌菌株有H33,$20,710,其抑菌率几乎均在 50%以上(除了对某些病原菌抑菌率较小之外). 参考文献: f11张子明生物农药的定义,特点和现状叽.农药科学与管理,1996,60(4):32—33 『21朱昌雄,细良,军红等.我国生物农药产业化现状,发展前景和展望(Mj_中国青年学术农业科学学术年报,北京:中国农业出版社,2002:212—216 f31李文均,张忠泽,姜成林.几种主要稀有放线茵的选择性分离U】.国外医药抗生素,2007,3(2):13—17. f41李一青,李艳琼,李铭刚等.稀有放线菌产生的抗生素[I].中国抗生素杂志,2008,33(4):193—197. 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