[word格式] 别嘌呤醇对未成熟鼠脑白质损伤保护作用的研究

[word格式] 别嘌呤醇对未成熟鼠脑白质损伤保护作用的研究 别嘌呤醇对未成熟鼠脑白质损伤保护作用 的研究 ?l82?2OO6年3月第44卷第3期ChinJPediatr.March2006,Vol44,No.3 别嘌呤醇对未成熟鼠脑白质损伤 保护作用的研究 胡勇邵肖梅王莹朱列伟杨毅 . 新生儿医学 【摘要】目的探讨别嘌呤醇对未成熟鼠脑白质损伤的保护作用.将新生1日龄sD 大鼠84只随机分为假手术组(Sham)(n=28),双侧颈总动脉结扎(BCAO)组(n=28)及别嘌呤醇干 预组(ALLO)(n=28),BCAO制作脑白质损伤模型.观察BCAO后 )和14d 7d(fr7,每组各6只 (P14,每组8只)脑组织病理改变及MBP免疫组化变化;RT—PCR荧光定量法检测fr7(每组6只)和 P14(每组8只)脑组织MBP.mRNA的表达.结果BCAO组白质改变明显,ALLO组较之明显减轻; P14平均脑室大小指数,ALLO组较(2.44?0.71)%BCAO组(3.27?0.73)%明显减小(P<0.05). P14MBP阳性染色光密度值,BCAO组(6.60?0.68)较Sham组 (9.404-0.53)明显降低(P<0.01), 而ALLO组(7.10?0.18)较BCAO组明显升高 (P<0.05);P7,P14MBP—mRNA拷贝数(/ogl0), BCAO组和ALLO组均明显低于Sham组(P<0.01),而ALLO组则 较BCAO组明显升高(P<0.05). 结论利用1日龄大鼠行BCAO可较好地制作早产儿脑白质损伤模型. 别嘌呤醇对缺血引起的未成 熟大鼠脑白质损伤具有保护作用. 【关键词】别嘌呤醇;婴儿,早产;缺氧缺血,脑;髓磷脂碱性蛋白类;大 鼠 ProtectiveeffectsofallopurinolonwhitematterdamageinprematureratsHUy0’,SHA0 Xiao—mei,WANGYing,ZHULie—wei,YANGYi.DepartmentofNeurolo gy,ChildrensHospitalofFudan Shanghai200032,China,’DepartmentofNeurology,ShanghaiFirstMaternityandInfantHealth Hospital,Shanghai200040,China 【Abstract】 OMectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsofallopurinol(ALLO)onwhitematter damageinprematurerats.MethodsAnanimalmodelforwhitematterdamage wasestablishedbybilateral carotidarterypeculation(BCAO).Eighty—fournewbornSDrats(1dayold) wereusedintllisstudyand weredividedrandomlyintothreegroups[shamsurgery(Sham);BCAOgroup(BCAO);allopurinol—treated group(ALLO)].Pathologicalchangeswerestudied7daysand14daysafterBCAO,respectively.Myelin basicprotein(MBP)wasdetectedbyimmunohistochemistry7daysand14daysafterBCAO, respectively.MBP?mRNAexpressionwasdetermined7daysand14daysafterBCAOrespectivelybyreverse transcription?polymerasechainreaction(RT—PCR)withfluorescentquant itativemethod.ResultsInBCAO group,mildor~vererarefactionwasfoundin10casesinthecorpuscallosumaIea,especiallyatthe cingnlum.Pathologicalchangesofwhitematterwerefoundin4casesininternalcapsule.Subeortexwhite matterrarefactionwasfoundin8cases.TheextentofwhitematterrarefactioninALLOgroupwasreduced significanfly.Enlargementofbilateralventricleswasfoundin6of8casesinBCAOgroup.Theaverage ventriclesizeinALLOgroup(2.44?0.71)%wasreducedsignificanflyascom paredwiththatinBCAO group(3.27?0.73)%(P<0.05).StrongMBPpositivestainingwasfoundinsub?codex,corpus callosum,hippocampusgyms,andinternalcapsuleofP14shamsurgerygroup.InBCAOgrouptheMBP stainingextentwasreduced.TheextentofMBPstainingofALLOgroupwasbetweentlleotllertwo groups.Theopticaldensity(OD)ofMBPpositivestaininginBCAOgroup(6.60?0.68)wasfoundhigher thanthatinshamsurgerygroup(9.40?0.53),thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05). ComparedwithBCAOgroup,ODvalueinALLOgroup(7.10?0.18)increasedsignificantly(P<0.05). RT.PCRdatashowedthatMBP—mRNAcopies(1oglO)inP7andP14ratsofb othBCAOandAUgroups werelowerthanthatinshamsurgerygroup(P<0.01);However,MBP?mRNAcopiesinALLOgroupwere highertllanthatinBCAOgroup(P<0.05).ConclusionsBCA0couldbeusedinnewbornrats(1day 作者单位:200032上海,复旦大学附属儿科医院新生儿科(胡勇,邵肖 梅),病理科(朱列伟);复旦大学儿科研 究所分子生物学实验室(王莹,杨毅) 第一作者现在工作单位:200032上海市第一妇耍保健院新生儿科 2006年3月第44卷第3期ChinJPediatr,March2006,Vol44,No.3 old)toestablishaprematurewhitematterdamage(WMD)animalmode1.Allopurinolmayhaveapotential DrotectiveeffectonprematureSDratwithischemicWMD. 【Keywords】 Newborn;Prematureinfant;Bilateralcarotidarteryocclusion(BCAO); Oligodendrocyte(OL);Myelinbasicprotein(MBP);Cerebralanoxia;Cerebralischemia;White matter;Braindamage;Allopurinol;.epartmentofNeurology,shanghaifirstcarehospitalformother andinfant.Shanghai200032,China 早产儿脑白质损伤是临床上一个非常重要的问 ,脑室周围白质软化(periventricularleukomalacia, PVL)是其主要神经病理类型.PVL最常见于极 低出生体重(<1500g)的早产儿,是导致早产儿 伤残的重要原因,在胎龄32周以下的早产儿中发生 率为5%,15%.发生于新生儿期的PVL常与晚期 严重的神经疾患如脑瘫,智力低下,视觉损害相关. PVL因其高发病率及其严重后果而日益成为近年来 国内外围产医学和新生儿学领域的研究热点.虽 然PVL的发病机制病理生理机制尚未完全清楚,但 近期的研究证实,PVL的发病机制与分化早期少突 胶质细胞(oligodendrocyte,OL)对缺血再灌注损伤, 特别是对自由基攻击的易感性密切相关_3.4J.因 此,使用自由基清除剂别瞟呤醇(allopurinol,ALLO) 以防治氧自由基对OLs的毒性损害有望成为防治 PVL的有效手段.2002年7月至2003年6月,利用 1日龄新生大鼠以BCAO方式制作早产儿脑白质损 伤模型,探讨黄嘌呤氧化酶抑制剂和自由基清除剂 别嘌呤醇对早产儿脑白质损伤的影响. 材料和方法 一 ,实验动物 新生1Et龄(出生当天计为0Et龄)SD清洁级 大鼠体重,雌雄不拘,6.27,8.95g,由中国科学院 上海生命科学院药物研究所实验动物中心提供. 二,模型制作及实验模型制作 将1Et龄新生SD大鼠70只乙醚吸入麻醉,行 (Bilateralcarotidarteryocclusion,BCAO)双侧颈总动 脉结扎_2J,手术死亡14只,其余56只,随机分为 BCAO组(BCAO,rt=28)及别嘌呤醇治疗组(ALLO, 凡=28).另取1Et龄新生SD大鼠28只作为正常 对照组即假手术组(Sham,rt=28),只麻醉并分离双 侧颈总动脉不结扎(表1). 三,治疗 ALLO治疗组于HI后即刻,24和48h分别腹 腔注射ALLO(0.5%ALLO+0.5%CMC)每次135 mg/kg,假手术组,HI对照组注射等量生理盐水 (0.9%NaC1+0.5%CMC). 表1实验动物分组情况 四,观察指标 1.脑组织病理学及MBP免疫组化染色:观察 BCAO后7d(P7)和BCAO后14d(P14)脑组织病 理改变(脑白质改变,脑室大小指数),并用免疫组 化法检测P7和P14脑组织MBP.13-actin抗体及二 抗:购自SantaCruzBiotechnology公司.脑室大小指 数=(左,右侧脑室面积之和/脑片总面积)× 100%.MBP免疫组化染色积分光密度:采用IMS 细胞图像分析系统,在前囟平面脑片(×10)上取胼 胝体中间部位,两侧扣带及内囊各一个视野共五个 视野(3700pLm,26万pixe1),测量MBP免疫组化染 色积分光密度,结果取其平均值. 2.脑组织MBP-mRNA的表达:RT.PCR荧光定 量法检测P7和P14脑组织中MBP.mRNA的表达. 分别留取前囟至丘脑水平(冠状面)的脑组织,匀浆 后进行组织总RNA提取,RNA逆转录,PCR扩增, 琼脂糖平台电泳,凝胶图像分析,回收纯化DNA片 段作曲线,对全部标本进行实时荧光定量PCR 扩增,各稀释梯度标准品与样本各取5l做PCR反 应(反应条件:94?3min,94?30S,60oC1min,循环 4o次),由标准曲线根据每一个样本中目的基因cl 值测得初始浓度.引物由上海生物公司合成, Trizol购自INVITROGEN公司,RT-PCR试剂盒购自 Takara公司. 五,结果处理及统计学分析 所有数据均以面?s表示,应用SPSS11.0统计 分析软件,多组均数比较用单因素方差分析(one wayANOVA),组间两两比较用q检验. 结果 一 ,神经病理观察 中华儿科杂志2006年3月第44卷第3期 ChinJPediatr,March2006,Vol44,No.3 1.白质改变:在fr7和P14动物中,Sham组:1 只出现脑白质改变,1只出现皮质神经元缺血性改 变;BCAO组:8只出现皮质下白质改变,3只出现凝 固性坏死和囊性病变,而皮质,海马及丘脑部位神经 元缺血性改变分别为2只,1只,1只,有1O只表现 为骈胝体尤其是扣带回部位的轻至重度的白质疏 松,4只有内囊部位的白质改变;ALLO组:各个部位 出现白质病变的只数均较BCAO组明显减少 (图1,12).各组P7,P14动物均无肉眼可见的脑 水肿.与Sham组相比,BCAO组及ALLO组fr7, P14动物均有肉眼可见的脑萎缩,以P14动物为着. ALLO组较BCAO组脑萎缩程度轻. 2.平均脑室大小指数:BCAO组8只P14动物 中有6只出现两侧脑室明显增大,而ALLO组较之 有所改善.平均脑室大小指数比较,BCAO组 (3.27?0.73)%较Sham组(O.76?0.37)%明显增 大(P<0.01),ALLO组(2.44?0.71)%较BCAO 组明显减小(P<0.05,图1,12).fr7动物中,与 Sham组比较,BCAO组及ALLO组亦有程度不等的 脑室扩大,但脑室扩大程度较P14动物轻. 二,MBP免疫组化染色 在P14Sham组鼠脑切片的皮质下,胼胝体,内 囊和海马缴等部位,可以看到较强的MBP阳性染 色,而BCAO组阳性染色明显减弱,ALLO组阳性染 色介于二者之间.比较其阳性染色的光密度值, BCAO组和ALLO组均较Sham组明显降低(P< 0.01),而ALLO组较BCAO组明显升高(P< 0.05).在fr7鼠脑切片中,只有Sham组有较弱的 阳性染色,而ALLO组阳性染色极弱,BCAO组几无 阳性染色,难以比较其阳性染色的光密度值(表2, 图13,15). 表2P14鼠脑MBP免疫组化染色光密度值比较(面?8) 注:’与Sham相比,P<O.O1;与BCAO相比,P<O.05 三,MBP-mRNAlit-PCR荧光定量测定 P7,P14鼠MBP-mRNA拷贝数(/ogl0):BCAO 组和ALLO组均明显低于Sham组(P<0.01),而 ALLO则均较BCAO组明显升高(P<0.05).提示 BCAO能明显降低MBP-mRNA在新生鼠脑组织中 的表达(表3). 表3脑组织MBP-mRNAlit-PCR荧光定量 结果比较(拷贝数)(面?8) 注:’与Sham相比,P<O.01;与BCAO相比,P<O.05 讨论 一 ,早产儿脑白质损伤动物模型的制备 围产期脑缺血被认为是早产儿脑白质损伤尤其 是PVL的主要发病因素….因此,采用脑缺血较之 感染,放射损伤等方式制作的早产儿脑白质损伤模 型,应更能反映早产儿脑白质损伤的发生和演变. 与Rice法对7日龄新生大鼠行单侧颈总动脉结扎 加缺氧,制作以皮质,海马神经元损伤为主的足月儿 缺氧缺血性脑病模型不同,本实验采用Cai等l2方 法对1日龄新生大鼠行双侧颈总动脉结扎(BCAO) 制作早产儿脑白质损伤模型,结果显示,71%的动物 出现胼胝体部位的白质疏松,出现内囊和皮质下白 质改变的动物分别为28%和57%,而仅有个别动物 出现皮质,海马和(或)丘脑部位的神经元缺血性改 变.作为临床PVL患儿最常出现的脑室扩大,本实 验中BCAO组8只P14动物中有6只出现两侧脑室 明显增大,BCAO组平均脑室大小指数较假手术组 明显升高.BCAO组部分动物出现凝固性坏死和囊 性病变. 目前在脑白质损伤的实验研究中,有两种互补 的手段被用于检测OL的完整性,一种是检测OL数 目的变化,另一种是测定由OL产生的髓磷脂碱性 蛋白(myelinbasicprotein,MBP)及其mRNA.本实 验显示,在P14假手术组鼠脑切片的皮质下,胼胝 体,内囊和海马缴等部位,均可以看到较强的MBP 阳性染色,而BCAO组阳性染色明显减弱,lit.PCR 荧光定量测定的MBP-mRNA拷贝数,无论是在fr7 还是P14鼠,BCAO组均明显低于假手术组. 综上所述,采用1日龄新生大鼠以BCAO方式 能较好地制作早产儿脑白质损伤模型. 二,别嘌呤醇对早产大鼠脑白质损伤的影响 由于缺血等引起的致死性氧自由基的产生和 o.3 别嘌呤醇是临床上用于治疗痛风的老药,兼有 黄嘌呤氧化酶抑制剂和自由基清除剂的作用,尤其 是能直接清除具很强细胞毒性的羟自由基. Giray等[6首次证明了ALLO可以预防氯氰菊酯诱 发的大鼠脑和肝脏组织的脂质过氧化损伤,并认为 这种保护作用是其直接的抗氧化剂和自由基清除剂 的双重作用.实验表明川,缺氧缺血前或后皮下 注射ALLO可以减轻新生动物缺氧缺血性脑损伤. 静脉大剂量别嘌呤醇治疗重度窒息新生儿效果好, 未见毒副作用】.因此我们推测,BCAO后给予别 嘌呤醇干预可能对早产儿脑白质损伤具有保护作 用.实验中我们发现,与BCAO组相比,ALLO组 BCAO后脑组织中MBP的免疫组化染色和MBP- mRNA的表达均增强,提示ALLO通过抑制黄嘌呤 氧化酶和直接清除自由基的作用而减轻缺血性脑白 质损伤.确切的保护机制和疗效有待进一步地深入 研究. 参考文献 1VolpeJJ.Neurobiologyofperiventricularleukomalaciainthe prematureInfant.PediBes,2001,5:553-562. 2CaiZW,PangY,XiaoF,eta1.Chronicischemiapreferentially causeswhitematterinjuryintheneonatalratbrain.BrainBes, 2001,898:126-135. 3VolpeJJ.NeurologyoftheNewborn,4thEdition,Philedelphia, Saunders.2001. 4BackSA,HanBH.LuoNL,eta1.Selectivevulnerabilityoflate oligodendrocyteprogenitorstohypoxia-ischemia.JNeurosci,20O2, 22:455-463. 5PalmerC,VannucciRC,Tow~ghiJ.Reductionofperinatalhypoxic- ischemicbraindamagewitllallopurino1.PedjRes,1990,27:332— 336. 6GirayB,GurbayA,HincalF.Cypermethrin-inducedoxidative stressinratbrainandliverispreventedbyVitaminEorallopurino1. 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