预防兽医学专业毕业论文 [精品论文] 牛γ干扰素抗原捕获elisa检测方法的建立及初步应用

预防兽医学专业毕业论文 [精品论文] 牛γ干扰素抗原捕获elisa检测方法的建立及初步应用 预防兽医学专业毕业论文 [精品论文] 牛γ干扰素抗原捕获 ELISA检测方法的建立及初步应用 关键词:牛结核病 牛结核分枝杆菌 IFN-γ ELISA检测法 摘要:牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核 γ作为病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配 -γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗对建立牛IFN rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有 -γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然效检测天然牛IFN IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度 包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle 对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 正文内容 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以 本研究通过对应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ -γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛多抗血清配对建立了牛IFN IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与 -4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-BoIL rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检 测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有 -扑杀”策略控制疾病传播。结效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫 核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对 -BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，本室研制的13株小鼠抗rHis McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛 方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γIFN-γ夹心ELISA检测 多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM 刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及 -γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有牛IFN 效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结 由于目前尚无有核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检 -γ作为Th1型测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物 素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检 -γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及测方法能有效检测天然牛IFN 牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通 过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM -γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。刺激奶牛全血产生的天然BoIFN 将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛 率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检IFN-γ的符合 测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物 。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3素化，同时用HRP标记单抗8D3 效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以 -γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWMrHis-BoIFN 刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多 :6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗血清配对，以1 抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma 获ELISA检测方法的初步应用 Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对 本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通 -γ反应性，最终确定13株单过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN 抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与 -γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN 度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效 -γ抗原捕获ELISA检测方法。 以果不佳。所以我们又建立了BoIFN rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检 测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 -γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与1.抗牛IFN rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单 BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通抗与重组菌BL21(DE3)(pET- 过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行 :80000以上。 2.牛IFN-γ测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1 抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对 -BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，本室研制的13株小鼠抗rHis McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试 γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ 剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN- ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与 -4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-BoIL rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG -blot试验鉴定单诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑 牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病的检 -γ作为Th1型测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛 方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γIFN-γ夹心ELISA检测 多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛 -γ与进口试IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多 抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径感染人类。研究表明，10,的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。结 一直被用于牛结核病的检核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST) 测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN-γ作为Th1型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990年Wood建立抗原特异性牛IFN-γ夹心ELISA方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出3株针对天然牛IFN-γ的单抗，经初步配对建立牛IFN-γ夹心ELISA检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对建立了牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然牛IFN-γ。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然IFN-γ与进口试剂盒符合率为83.9,。这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 1.抗牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 采用Dot-ELISA方法对13株单抗分别与rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定;通过Western-blot试验鉴定单抗与重组菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反应性;通过间接ELISA实验证明13株单抗与商品化rBoIFN-γ反应性，最终确定13株单抗均特异针对rBoIFN-γ而不与无关蛋白成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗9G11，其余单抗腹水效价都在1:80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立 采用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性好的纯化抗体。采用相加ELISA实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针对不同抗原表位的单抗6F8、1G5进行生物素化，同时用HRP标记单抗8D3。得到Biotinylated6F8效价为1:10000，HRP-8D3效价为1:3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做待检抗原，单抗3E6/1C12与 Biotinylated6F8直接配对建立了rBoIFN-γ双抗体夹心ELISA检测方法，灵敏度达0.5ng/mL，并能检出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但检测天然BoIFN-γ效果不佳。所以我们又建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制备了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血产生的天然BoIFN-γ筛选出与之反应的三株单抗5E11、6F8、8D3。将单抗5E11按照40μg/mL浓度包被与1:3000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配对，以1:6000稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法，可有效检测天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的初步应用 用进口试剂盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检测A地奶牛117头，检出禽结核阳性15例，可疑牛结核3例，未检出阳性牛结核。检测B地奶牛场奶牛59头，检出9例牛结核阳性，2例禽结核阳性，可疑牛结核10例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部分临床检测血清样本用牛IFN-γ抗原捕获ELISA方法检测，两种方法检测牛IFN-γ的符合率达到83.9,。 结果表明建立的牛IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法能有效检测天然牛IFN-γ，这为进一步开发牛IFN-γ ELISA试剂盒以及牛IFN-γ ELISPOT检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种有效检测试剂。 《《《特别提醒》》》:正文内容由PDF文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 。如还不能显示，可以联系我q q 1627550258 ，提供原格式文档。 " 垐垯櫃 换烫梯葺铑? endstream endobj 2 x滌?`U '閩AZ 箾FTP 鈦 X飼?狛]P ?燚 \? 琯嫼b?袍*，甒?]颙嫯'??4)=r宵 ?i?]j彺帖B3锝檡骹>笪yLrQ#?0鯖l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛>渓?@擗#?"? #?綫G刿# K芿${` ? ?7.耟? ~??Wa癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb皗E|?pDb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳 $[Fb癳$[F?責鯻0橔C,f薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵 秾腵薍 秾腵% ? 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍G??螪t俐猻覎? 烰:X=[勢} ) [趯飥 ? 媂^s劂 / x?矓w豒庘q?唙?鄰爖媧 \ㄤA|Q趗擓 蒚?緱^ ~鳝嗷P?笄nf( 鱂匧-叺9就菹$