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日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展

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日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展 寄牛虫病与感染性疾病20o5年3月第3卷第1期 ParasitosesandInfectiousDiseasesMar.20o5,Vo1.3No.1 日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展 张莉综述, [中图分类号]R532.21[文献标识码]A 日本血吸虫病是一种威胁6亿人身体健康的严重寄 生虫病,感染人口2亿,患者2千万左右.据2001年调 查,我国现有9千万人口受日本血吸虫病的威胁,有82.1 万日本血吸虫病患者,其中慢性患者79.5万.目前治疗 日本血吸虫病的主要方法是化疗药物吡喹...
日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展
日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展 寄牛虫病与感染性疾病20o5年3月第3卷第1期 ParasitosesandInfectiousDiseasesMar.20o5,Vo1.3No.1 日本血吸虫疫苗候选分子的研究进展 张莉综述, [中图分类号]R532.21[文献标识码]A 日本血吸虫病是一种威胁6亿人身体健康的严重寄 生虫病,感染人口2亿,患者2千万左右.据2001年调 查,我国现有9千万人口受日本血吸虫病的威胁,有82.1 万日本血吸虫病患者,其中慢性患者79.5万.目前治疗 日本血吸虫病的主要方法是化疗药物吡喹酮的应用,但 药物虽能降低感染率和发病率,却不能阻断传播,对已经 形成的虫卵肉芽肿没有作用,再次接触疫水后会再感染. 由于药物的频繁应用,尚不能排除血吸虫有潜在抗药性 的危险,加上重复化疗和长期的监测措施需要昂贵的费 用和大批专业技术人员.为此,促成人们开展寻找控制血 吸虫病的辅助或替代方法一血吸虫疫苗的研究. 1WHO/TDR提出的血吸虫疫苗候选分子 1.1谷胱甘肽S转移酶(26GsT)谷胱甘肽S转移酶是 以谷胱甘肽为共同底物的一组具有解毒功能的同工酶. 血吸虫的谷胱甘肽S转移酶含量丰富,含有217个氨基 酸残基,存在于雄虫的实质组织和雌虫卵黄腺之间的实 质细胞内,日本血吸虫26GST融合蛋白在人体能刺激强 有力的T细胞依赖的对GST反应,能诱导明显的抗尾蚴 攻击感染和抗生殖的保护性免疫j.用含重组谷胱甘肽 S转移酶(rSjc26GST)基因免疫水牛,能诱生保护性免疫 力,预防血吸虫尾蚴感染.同时,能减少雌虫产卵,被免 疫动物体内虫荷数和组织中的虫卵数均明显减少,明显 减轻肝组织肉芽肿病变,另外,还可以使虫卵孵化为毛蚴 的能力减少约40%. 1.2副肌球蛋白(Paramyosin)副肌球蛋白是一种糖蛋 白,位于日本血吸虫成虫,尾蚴,童虫的肌肉层.编码日本 血吸虫副肌球蛋白的基因含2600bp,编码866个氨基酸 残基,各虫株(大陆株,菲律宾株,日本株)间副肌球蛋白 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性极高,副 肌球蛋白在虫体发育过程中分泌结合到虫体表面,虫体 移行时成为靶抗原激起保护性免疫.体外实验,副肌 球蛋白能刺激小鼠T淋巴细胞产生IFN-^y,活化巨噬细 胞,对入侵童虫进行杀伤.McManus用重组副肌球蛋白对 水牛和小鼠进行了免疫原性和疫苗有效性的研究,发现 作者单位:四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教 研室,形态学实验室(四川成都610041) 作者简介:张莉(1972一),在读硕士生,大理学院讲师,研 究方向为分子病原生物学 ? 31? 【综述】 陈建平审校 [文章编号]1672—2l16(2005)01—0031—04 小鼠体内产生高水平的特异性IgG抗体,水牛的减卵率高 达42%,45%』.表明副肌球蛋白免疫动物可引起宿主 对攻击感染的免疫保护力,减少虫荷数,是一个有前途的 疫苗候选分子. 1.3照射减毒抗原5(IrV-5)IrV一5是曼氏血吸虫肌球 蛋白片段中的一个分子量为62kDa的重组蛋白.重组的 IrV一5能被紫外线致弱尾蚴免疫鼠血清识别,与慢性感染 鼠血清也能发生弱反应,但免疫小鼠未取得免疫保护作 用.用VR1020载体构建的62kDa核酸疫苗(VRSj62)免 疫小鼠产生了高滴度(?1:25000)的IgG类抗体,并获 得27%的减虫率,表明IrV一5具有抗血吸虫感染的免疫保 护潜能j. 1.4磷酸丙糖异构酶(TPI)TPI是一种参与血吸虫生 命代谢活动的重要功能分子,催化磷酸二羟丙酮分子二 磷酸甘油醛之间的可逆反应,是血吸虫糖代谢过程的一 个关键酶(二聚体糖酵解酶).在血吸虫的各期均有TPI 抗原的合成,并分布于血吸虫的各种组织中.天然SjTPI 抗原加弗氏佐剂能诱导小鼠产生明显的抗尾蚴攻击感 染,肝组织减卵率达57.8%,60.3%,被认为是一种有 希望的抗血吸虫疫苗抗原.用日本血吸虫中国大陆株 TP1分子的DNA疫苗pcDNA3.1-SjcTPI免疫C57BL/6小 鼠,获得了27.9%的减虫效果,有同时诱导免疫鼠产生细 胞免疫和体液免疫的作用. 1.5完整膜蛋白23kDa23kDa膜蛋白存在于血吸虫尾 蚴,童虫及成虫,尤其是晚期童虫的表膜上,对维持血吸 虫的生长和发育起着重要的作用.Zhu等将全长的 Sjc23基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建成功 Sjc23DNA疫苗,并与已构建好的细胞因子佐剂pcD- NA3.1.IL.12联合免疫C57BL/6小鼠,获得26.9%, 35.4%的减虫率和22.2%,28.4%的减卵率,提示 Sjc23DNA疫苗是一种有发展前景的疫苗. 1.6脂肪酸结合蛋白基因(FABP)日本血吸虫FABP 存在于雌虫卵黄细胞和肌层以及雄虫表膜下实质的脂滴 内.血吸虫本身不能合成长链脂肪酸和类固醇,必须利用 细胞膜和质膜中FABP来吸收,运输和吞噬宿主各种衍生 脂肪酸.在代谢过程中,血吸虫释放出的脂肪酸衍生物在 抵御宿主免疫系统的攻击时发挥重要的作用,因此,FABP 成为血吸虫合成脂肪酸过程中所必须的载体,是极具吸 引力的候选分子.SjFABP全长612bp,编码133个氨基 酸,Waine等:将SjFABP的cDNA片段克隆入真核质粒 ? 32?寄生虫病与感染性疾病2005年3月第3卷第1期 Parasit0sesandInfccti0usDiseasesMar.2005.V01.3.N0.1 表达载体pRSV—BL,构建DNA疫苗,研究保护性免疫效 果,但结果未能诱导出保护力,也未检测出特异性抗体,有 关~FABP诱导动物保护性免疫力的研究还在继续. 除上述6种候选分子外,国内外学者又寻找到了日本 血吸虫疫苗的其他候选分子. 2其他候选分子 2.1组织蛋白酶血吸虫的营养来源于宿主红细胞,红 细胞被血吸虫食管分泌的溶血素溶解后释放出血红蛋 白,血红蛋白被血吸虫肠管中的蛋白水解酶大量降解.血 吸虫通过分解宿主血红蛋白获得生长,发育和繁殖所需 氨基酸,所以在血红蛋白消化过程中所涉及到的每一种 蛋白水解酶均可成为新的抗血吸虫药物和疫苗的靶标. 血吸虫的组织蛋白酶主要包括组织蛋白酶B,组织蛋白酶 L和组织蛋白酶D.组织蛋白酶B属于半胱氨酸蛋白水 解酶,分子量为31kD,定位于肠道.半胱氨酸蛋白酶抑制 剂在体外能抑制血吸虫降解血红蛋白,并能减少血吸虫 病小鼠体内血吸虫数量和血吸虫虫卵的产量.经证实血 吸虫成虫肠道排出物中含有组织蛋白酶B,具有水解血红 蛋白的作用J.组织蛋白酶L有2种亚型:L1和L2. 组织蛋白酶L1是血吸虫组织提取物和成虫肠道排出物 的主要组织蛋白酶,位于血吸虫肠道,是降解血红蛋白的 关键酶.组织蛋白酶L2与血吸虫的生殖有密切关 系….组织蛋白酶D属于肠相关天冬身酸蛋白酶,存在 于血吸虫的分泌物和排泄物中,可以降解夭然人体血红 蛋白和其敏感底物Phe—Ala.Ala—Phe(NO,)Phe.Val—Leu— OMP4,并且抑胃酶肽可抑制活性.Verity等"用重组组 织蛋白酶D分子免疫小鼠,获得2l%,38%总减虫率和 22%,40%雌虫减虫率,以诱导细胞免疫为主. 2.2发育调节相关基因 2.2.1卵壳蛋白基因(ESG)血吸虫雌虫产卵在血吸虫 致病和传播中起关键作用.研究发现,血吸虫雌雄合抱是 雌虫性成熟的关键,而性成熟又是雌虫产卵的前提,因此, 控制血吸虫生殖和抑制其虫卵成熟成为一个重要研究策 略.卵壳蛋白基因是一种能被调控的雌虫特异性基因,与 雌虫的成熟,产卵和雌雄虫交互作用密切相关,具有阶段 特异性,性别特异性和雌虫特异性表达的特点.目前筛选 到2种卵壳蛋白基因J,对它的基本结构和生物功能 已经明确,但它的作用机制和抗卵免疫效率还待进一步 研究. 2.2.2卵黄铁蛋白基因(Ferritin1)卵黄铁蛋白基因是 血吸虫雌虫特异基因的产物,在卵黄腺高水平表达,是一 种具有性别和组织特异的发育调节蛋白.2000年周金春 等首次证明了卵黄铁蛋白能诱导抗血吸虫病保护性免 疫.王敏等采用电泳层析法进行纯化重组铁蛋白,用 低温透析沉淀去除SDS,保留铁的免疫学活性,用纯化的 rSjFerritin免疫小鼠,不仅降低了小鼠虫荷,又降低了虫卵 数,减虫率,减卵率分别为24.5%和45.8%,表明卵黄铁 蛋白免疫小鼠可产生较好的抗日本血吸虫感染的免疫保 护,为血吸虫病的疫苗研究提供了又一候选分子. 2.2.314—3—3信号蛋白14—3—3信号蛋白是由Moore和 Pertz在1967年根据一组蛋白质在二维DEAE层析及电 泳凝胶中的迁移位置取其名14-3—3,是一组高度保守的多 功能胞浆蛋白,广泛存在于真核生物的细胞内.它是一种 信号接头蛋白,可与多种信号转到蛋白相互作用,调节它 们的活性,参与有丝分裂原的信号转导,细胞凋亡和细胞 周期调节,因此被认为是发育过程中的关键分子.血吸虫 14—3.3通过其酸性C.末端与TH和TPH作用,激活TH产 生儿茶酚胺类如多巴胺等,激活TPH产生5一羟色胺,既刺 激虫体的糖酵解,也刺激虫体的呼吸.Zhang等从日本 血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆,表达了日本血吸虫 l4—3-3,证明其存在于日本血吸虫生活史各期,具有较好 的免疫原性.用rsi14—3—3免疫BALB/e小鼠后,进行尾蚴 攻击感染实验,获得减虫率为34.2%,减卵率为50.74%, 提示14—3—3具有一定的抗血吸虫潜能. 2.3热休克蛋白(HSP70)HSP是生物在不利情况下产 生的保护机体的蛋白,又称"看家蛋白",具有重要的生理 作用,如促进器官组织的正常发育,作为分子伴侣参与蛋 白质的折叠,装配,降解,修复和转移,以保护细胞不受机 体内外环境不良条件的损害.寄生虫感染宿主过程中,宿 主因寄生虫的入侵而处于应激状态,产生HSP作为对虫 体入侵应激应答的一种形式,而寄生虫进入宿主体内,由 于环境温度,理化条件的变化,生理和免疫等多因素的作 用,使寄生虫也处于应激状态,产生虫体HSP参与寄生虫 分化,增强寄生虫毒力,诱导宿主产生保护性免疫,逃避宿 主免疫作用,降解宿主蛋白为虫体提供营养.HSP大都为 显性抗原,种特异的HSP可用于寄生虫诊断和疫苗的制 备.研究表明,血吸虫HSP70表达受虫体发育阶段和热 应激调控,HSPT0组成性的表达于胞蚴,童虫和成虫,而在 尾蚴不表达,在尾蚴转化为童虫的过程中,尾蚴脱落是诱 导HSPT0基因表达的全面过程.Scott等于1999年克 隆了日本血吸虫HSPT0,但尚未对其功能作进一步研究. 2.4线粒体蛋白基因(rSj338)线粒体与血吸虫的能量 代谢和代谢调节密切相关.糖作为重要的代谢能源,其代 谢过程中的苹果酸必须进入线粒体进一步代谢才能为各 种生理活动提供能量,另外线粒体内存在有与末端氧化 有关的细胞色素链,无氧电子流,ATP酶及对某些代谢产 物具有特殊的转运机制,从而保证虫体完成呼吸,发育,生 殖,肌肉活动和神经调节等多种生命活动胡雪梅等 用重组蛋白(rSj338/26GST)免疫小鼠,获得了32.3%的 减虫率和46.5%的肝总减卵率,与rSj26GST免疫相比. rSj338抗原可使小鼠获得22.5%的减虫率和30%的肝总 减卵率.说明338可望成为新的疫苗候选分子. 2.5钙激活中性蛋白激酶(Calpain)钙激活中性蛋白激 酶是一种细胞内的蛋白激酶,在细胞的表面及附近激活, 寄生虫病与感染性疾病2005年3月第3卷第1期 PamsitosesandInfectiousDiseasesMa2005,VoIJ3.No.1?33? 在细胞膜及其细胞骨架的更换过程起重要的生理功能. 日本血吸虫的Calpain主要分布在成虫的真皮层及其表 层,段立华等用重组Calpain抗原免疫大鼠获得了特异 性的抗Calpain抗体,证实了Calpain的免疫原性.周爱琴 等构建pVAC.CalpainDNA疫苗免疫BALB/c小鼠,发 现免疫小鼠所产生的IgG高,并有36.84%的减虫率, 36.36%的减雌率和43.31%的减卵率,提示CalpainDNA 疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用.已证实,日本 血吸虫Calpain重组疫苗在BALB/c小鼠的疫苗模型中得 到高于40%减虫率和显着的减卵率,可作为一个日本 血吸虫病的疫苗候选分子. 2.6新基因的发现将生物信息学技术,表达序列标签 法和步移法测序相结合,构建eDNA文库,随机挑取重组 阳性克隆进行测序,对部分序列进行步移法测序获取全 长eDNA,登录GeneBank,利用BLAST程序对同源性高的 基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较,利用pc gene软件对其蛋白质结构进行分析,从而获得新基因,如 SjMF4等J,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药 物靶点. 3结语 日本血吸虫病是一种人兽共患寄生虫病,终宿主除 人外,还有近40多种哺乳动物,数量大,扩散严重,且中间 宿主钉螺广泛存在,使该病难以彻底阻断传播.至今,获 得的血吸虫疫苗候选分子在小鼠体内产生的免疫保护力 大部分未达到WHO所提出的预期目标一?40%减虫率. 要最终获得理想的疫苗,可考虑针对不同发育阶段,不同 部位和不同抗原成分选择2种或2种以上的多种疫苗候 选分子的联合应用,以达到协同和增强作用.由于血吸虫 抗原成分复杂,寻找保护性疫苗候选分子的工作仍将继 续进行. 4参考文献 [1]LiuSX,SongGC,XuYX,eta1.Immunizationofmicewith recombinentSj26GSTinduceaproducedanti—fecundityeffect afterexperimentalinfectionwithChineseSchutosomajaponi— cttm[J].Vaccine,1995,13:603-605. 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(收稿日期:2004一Il—lO) 黑热病1例?-l',??,,r1lI,1 彭碧,张薇, [中图分类号]R531.6[文献标识]E 1材料与方法 1.1一般临床资料患者,男,36岁,民工,因畏寒,发热 1个多月入院.1月前患者因感冒后出现不规则发热,盗 汗,体温最高达40?,在当地按感冒对症治疗效果不佳. 入院前l天突发鼻衄,量约6OO,700ml.于2004—0l一 27急诊入院.查体:T39.7oC,急性热病容,中度贫血貌, 全身无出血点,无黄疸.心(一),肺(一).B超示:肝正 常大小,脾肋下约8,0cm,余无异常. 病史提示:患者近2年内曾间断在四川阿坝州工作8 个多月. 1.2实验室检查血常规:WBC1.2×10/LRBC2.8 ×10/LHb78g?L一'Pr60×10/L,分类:G0.630 L0.262M0.108,涂片分类未见异常细胞,散在血小板 少见. ? 骨髓涂片检查:查见利什曼无鞭毛体.(图1) 肝功:ALT51U?L,AST85U?L,ALB29.3 GLB40.8A/G0.72. 实验室诊断:黑热病. 2讨论 黑热病,又称内脏利什曼病,是由杜氏利什曼原虫引 起的,经白蛉传播的慢性地方性传染病.地域性强,我省 阿坝州汶JiI一带是黑热病疫区,而此患者有反复去疫区 打工史,故询问流行病学史.尤其是外出务工史就显得极 其重要. 作者单位:绵阳市人民医院检验科(四川绵阳 62l0o0) 李俊玲,张均 [文章编号]1672—2116(2005)ol一0034—0l 【短文】 注:10×100瑞氏染色 图l骨髓涂片所见利什曼无鞭毛体 对于临床上有不规则发热,贫血,肝脾肿大的患者应 反复询问病史以获得早期诊断.对流行病学史,临床症状 均支持黑热病的诊断,骨髓又未能检出利什曼无鞭毛体 的患者,可以考虑诊断性治疗. 由于本病潜伏期长,起病缓慢,导致误诊率增高,如误 诊为血液系统疾病,感染,结核,脾功亢进等.并可因久病 体弱而引起严重并发症,应引起临床医师高度重视. 本病骨髓涂片检出利什曼无鞭毛体可确诊.用斯锑 黑克疗效明确. (收稿日期:2004—12—10)
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