猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突变体病毒免疫原性研究

猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突变体病毒免疫原性研究 猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突 变体病毒免疫原性研究 猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影 响及 突变体病毒的免疫原性研究 委员会 主席 王涟教援:蝗昱?浙江太堂 委员 友维缝数援:蝗昱 逝江太堂 鱼送莹塾拯熊昱 逝、江太堂 塑松垡数握:盟昱一逝江太堂 丛数援:擅昱 差国里纳酉太堂 征: ? ? :. , ,,.. ,目录 浙江大学博十学位论文 目录 摘要? 第一部分文献综述??。 猪圆环病毒的一般生物学特征?.. .猪圆环病毒的发现和分类. 的形态和理化特性??. . 的体外培养特性. 猪圆环病毒的分子生物学特征? . 分子特征和主要元件? . 毒株的遗传进化分析 的复制与转录??.. 感染性克隆技术的研究进展及其在疫苗开发中的应用感染及其相关疾病的 研究进展? . 相关疾病的研究 .断奶仔猪多系统衰竭综合征?. . 的感染和致病机理.. 的感染. .. 的致病机理? . 的流行病学研究 的检测 .酶联免疫吸附试验??. .免疫组化试验 .间接免疫荧光 . 技术? .核酸杂交技术. .限制性长度多态性分析? 参考文献:第二部分研究??... 第一章浙江省及周边省市分子流行病学调查及病毒的分离鉴定。 .材料与方法??. .细胞、载体与试剂? .病料采集?一 .病毒提取. 特异性检测引物的设计及病料中的检测? .不同地区、不同时间毒株的扩增和测序? .. 产物纯化..连接 .. 法制备. 感受态细胞? ..转化 ..碱裂解法抽提质粒. ..重组质粒鉴定和测序??. . 病毒分离. 分离株的和间接免疫荧光鉴定 .分离毒株全基因组扩增、克隆和测序.病毒纯化及形态观察 .序列分析?. .结果分析.. .病理学变化观察.组织病料中的检测结果目录 浙江人学 .不同地区、不同时间毒株的序列分析? . 的分离和鉴定??.. . 分离株全基因组序列分析~ .病毒纯化? .讨论 参考文献? 第二章浙江省及周边省市感染的血清学调查?. 材料与方法 .细胞、载体与试剂 .猪血清样品采集。 . 和 蛋白的表达纯化? .多抗的制备 .融合蛋白和免疫反应性分析. . 鉴定多抗的反应性和特异性.猪血清样品中抗体检测方法的建立. .浙江省及周边省市猪群感染的血清流行病学调查. 结果? . 蛋白和 蛋白的表达纯化一 .纯化蛋白 鉴定一 . 和兔多抗特性的鉴定. 抗体检测方法的建立一 .浙江省及周边省市猪群血清流行病学调查. .讨论??.. 参考文献第三章猪圆环病毒型蛋白核定位信号原件的定位??。 .材料与方法 .载体与试剂一 .细胞及病毒? .病毒抽提:?一 .重组真核表达质粒的构建?.. . 扩增产物的磷酸化处理:??. .转染级别超纯质粒的抽提?. .细胞转染及荧光观察 .各融合基因在转染细胞内的转录分析??. .结果分析? .重组表达质粒的构建及转染级别质粒的抽提??. . 鉴定感染细胞中病毒核农壳蛋的定位 . 及其截断序列与融合表达产物的细胞定位?. . 蛋白中核定位信号元件的分析和确定 、讨论参考文献:? 第四章、及其突变体感染性克隆的构建和体外复制能力研究??. .材料与方法 .细胞和病毒??.? .工具酶和试剂 .引物设计和感染性克隆的构建??. .高纯质粒抽提和细胞转染及检测? .体外感染稳定性实验和测定??. .体外复制能力比较试验??. . . 体系的建立? 、结果:? 目录 浙江大学博 :学位论文 .感染性克隆的构建和鉴定?. . 体系的建立? .各感染性克隆转染.细胞后能形成具有感染性的病毒粒子. .重组病毒体外感染稳定性实验.各感染性克隆体外生长能力比较? 、讨论?. 参考文献 第五章重组病毒对/小鼠的致病性和免疫原性比较.材料与方法??. .细胞、病毒、动物和试剂? .重组病毒体外传代和增殖? .试验设计和攻毒.病理学与组织病理学观察.病毒血症的检测.血清学鉴定 及其抗体消长规律分析 .小鼠外周血林把细胞、、亚群分析.结果?. .试验小鼠的组织病理学观察 .、小鼠体内病毒特异性抗体的血清学分析. .、病毒血症检测.、小鼠外周血、淋巴细胞亚群测定:. 、讨论?.: 参考文献?一 结论与展望?。 攻读博士学位期间发表的学术论文? 致谢.. 摘要 浙江大学博十学位论文 摘 要 猪圆环病毒 ,属于圆环病毒科,圆环病毒属,无 囊膜,直径约,是最小的动物病毒之一,其因组为一单链环状。 分为两个基因型,无致病性,广泛存在于猪群中。而被认为是断奶 仔猪多系统衰竭综合征的主要致病因子,可引起消瘦、可视黏膜苍白、 呼吸困难、间歇性腹泻及淋巴结肿胀等症状,对养猪业构成了严重威胁。 和均包含、和三个主要的开放阅读框。其中编 码病毒的衣壳蛋白,并且是的主要毒力因子和免疫原性蛋白。研究表明, 植物单链环状病毒核衣壳蛋白核定位信号的破坏或缺失直接导致 积聚减少,从而影响病毒的复制增殖。核衣壳蛋白有可能通过与复制相关蛋 白的 作用而参与调节病毒基因组的复制。对核衣壳蛋白的研究将有助于深入了 解病毒复制、致病性,开发有效的病毒疫苗。而猪圆环病毒型是引起 猪多系统衰竭综合征的病原之一,严重影响养猪业的健康发展,目前还没有 有效 疫苗。本项目以 为基础,在对浙江省及周边地区猪场感染血 清学和分子流行病学调查的基础上,比较深入地开展了核衣壳蛋白核定位 信号对复制的影响和重组病毒的免疫原性研究。由于该病毒在体外培养细 胞中的增殖较慢,是影响疫苗研发的瓶颈问,本研究针对复制问题开展 的研究,具有重要的理论和实际意义。 首先,分别应用和方法对?年浙江省及其周边上海、 江苏等地猪场采集的份病猪组织和份血清进行了及其特异性抗 体的检测。结果显示,淋巴结中的阳性率为.%/,猪群 抗体阳性率为.%/。其中断奶后仔猪.%,/和 肥育猪血清.%,/抗体阳性率显著高于哺乳仔猪的阳性率 .%,/。进一步扩增株.年不同地区毒株的 基因,进行测序并分析其分子流行特点。结果显示该地区毒株彼此间核苷 酸的同源性较高%.%,但与国内其它地区或国外毒株相比具有明显的氨 基酸变异,特别是衣壳蛋白的两个主要抗原表位区内氨基酸位点变异率非常 高, 导致其亲水性发生明显改变。遗传进化分析发现该地区的所有毒株与部分 国内毒株处于同一分支内,而与大部分国内或国外的毒株亲缘关系较远。摘 要 浙江大学博十学位论文 以上结果说明感染在浙江省及周边省市呈广泛流行并呈上升趋势,而且其 毒株具有独特的分子特征。 衣壳蛋白在胞浆内合成后通过其自身核定位信号的作用转运至细胞核 内参与病毒的复制和组装。预测结果表明 蛋白的端也含有多个可 能的单一型或双分型核定位信号序列。本研究将 及其突变体 与融合,插入真核表达质粒,使其能融合表达两个不同基因。转 染细胞后观察荧光,以分析和确证 蛋白中的核定位元件。试验结果 表明, 蛋白端个氨基酸缺失后不影响融合蛋白的核定位,即 蛋白均集中于细胞核内,与野生型.融合蛋白一致。而其端位 氨基酸序列的缺失导致融合蛋白丧失了核定位功能而使蛋白散布于.细胞 的胞浆内。这说明 蛋白的核定位功能由其端序列决定。进一步对 端序列中的碱性氨基酸残基分别进行点突变,结果表明氨基酸短肽 的突变和中后个碱性氨基酸的突变 导致融合表达产物分布于整个细胞,丧失了完整的核定位功能,说明这两个 序列 为 蛋白的核定位元件,与 蛋白的有较大差异。 应用反向遗传学技术可以详细研究病毒的基因结构和编码蛋白的功能。我们 将基因组克隆入.载体,并在其’端亚克隆入一段重复序列,构建 了感染性克隆。其中的重复序列有助于在细胞内通过同源重组自 身环化并从质粒中释放。以同样策略构建了基因组为骨架、含有 的杂合型感染性克隆以及 核定位信号序列被 相应序列替换的.和.两种杂合型感染性 克隆,以研究核定位信号元件对于病毒复制的影响。结果表明个感染性 克隆转染.细胞后均能产生感染性的病毒粒子。连续传代稳定后, 和病毒分别能达到‘和 /,滴度与野毒株相似。而 。 杂合病毒。和.的滴度则显著低于野毒 /。和要比.和.在.细 胞具更强的复制能力:和从感染后的/达到 时的/左右,但.和.只达到/ 左右。 将各重组病毒以相同剂量接种周龄的/小鼠,比较它们在体内的复 摘要 浙江大学博上学位论文 制能力、致病性和免疫原性差异。虽然组小鼠血清中病毒含量显著高于 接种组,但它们诱导的血清抗体效价没有显著差异,表明它们在体内具 有相似的免疫原性。而.和.组小鼠只有少数能从血清 中检低水平的病毒量和特异性抗体。致病性试验发现各病毒接种组均 未出现明显的肺部病变。野毒株和组小鼠脾脏均出现了 轻度的显微病变,与对照组相比差异显著。但三个杂合型病毒、 .和?接种组小鼠脾脏的病变程度与对照组差异不显 著。流式细胞检测结果显示和接种后,小鼠外周血和 淋巴细胞含量显著低于其余各组.。但接种组小鼠外周血淋 巴细胞亚群变化与对照组相比不明显。因此,在体内的致病性明显低于 野毒株和重组病毒,但与野毒株具有相似的免疫原性。然而, .和.在体内外都只表现较弱的复制增殖能力,表明将 核衣壳蛋白序列替换相应部位序列并没有提高病毒的复 制能力。相反地,由于包含和 蛋白核定位信号的端核衣壳 序列的互换可能使杂合型核衣壳蛋白核定位功能减弱或丧失,甚至导致蛋白 结构 和功能的改变,从而影响病毒的复制和组装。 综上所述,本论文对浙江省及其周边地区猪场中的流行进行了系统的 调查,发现感染呈广泛流行并有明显上升趋势,且其毒株与国内外其它毒 株相比在蛋白的两个主要抗原表位区具有较大差异。同时,我们发现 蛋白的核定位功能由其端氨基酸短肽和 决定,与 蛋白的有较大差异。 重组病毒体内外特性研究表明对小鼠的致病性明显低于野毒株和 病毒,但它们却具有相似的复力和免疫原性。而.和 ?病毒在体内外复制能力都较弱,表明将核衣壳蛋白序 列替换相应部位序列并没有明显提高病毒的复制能力。提示 .和.病毒核衣壳蛋白的核定位元件中可能存在关键碱 性氨基酸位点对于病毒复制具有重要影响或致死性的,从而影响了病毒的复 制和 组装。进一步研究可对和核衣壳蛋白不同的核定位元件中的碱性氨 基酸位点进行突变,从而在更大程度上保证蛋白的完整性和兼容性,以研究 核定位元件在病毒复制中的作用。而本研究中基于质粒的病毒感染性克隆构 建方摘要 浙江大学博十学位论文 法的建立及成功运用将有助于我们对病毒复制和蛋白功能的进一步研究。 而小鼠感染模型也为进一步的研究提供了便利。 关键词:猪圆环病毒,核衣壳蛋白,核定位信号 浙江人学博上.学位论文 ,, , ,?.. , .? ,.,,, . ., ,, . % . , ., . . , , , .. .%、.% .%/ .% .. . .%. %. .? ... : ,,.,. ... . .. , ?. ., . ., . 一 . , 浙江大学博上学位论文 ,?. . , ,%/ .,? 一. , ? . , . ., ’/, ., ? /?,. , 、析 . . . . . , , .. 、析 .谢 ., ..,, . ? , . , . .. ,.一 ,. : , , 第一部分文献综述 浙江大学博士学位论文 第一部分文献综述 猪圆环病毒的一般生物学特征 .猪圆环病毒的发现和分类 年,等【】在.细胞系的传代过程中发现了一 种类似小病毒的圆形颗粒,不引起细胞病变,当时被认为是一种细 胞污染物。年,等【】用超速离心法提取病毒粒子和核酸,通过电镜 观察病毒粒子形态,外切核酸酶鉴定核酸类型,首次揭示这是一种小而无囊 膜的二十面体对称的动物病毒,含有一条单链、环状的基因组,从而将其 命名为猪圆环病毒。随后的血清学调查发现猪群中广泛存在的抗体, 用重组感染猪不引起临床症状和病理变化。因此,早期的研究认为无 致病性。年,断奶猪多系统衰竭综合症首次在加拿大猪场的断 奶仔猪中发现【,】。研究人员从患病猪体内分离出了一种新的猪圆环病毒,命名 为猪圆环病毒型【。而分离自细胞的非致病性命名为猪 圆环病毒型,它与在在抗原性和核苷酸序列上均存在差异。 由于非特异性的临床表现,这些症状起初在加拿大以外的其它国家未被识别。 随后,等【】学者的研究发现是引起北美尤其是欧洲国家商品猪严 重消瘦的原因。该病通常发现于商品猪群,表现为断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼 吸急迫、消瘦、贫血、出现黄疸现象,剖检后发现有淋巴结肿大、肝硬变、多灶 性粘液性气管炎、间质性肺炎和肾炎?。用重组感染猪群可复制出与自 然患病猪相一致的临床症状‘,。,因此,被认为是的主 要病原。 猪圆环病毒在分类上属于圆环病毒科,圆环病毒属。圆环病毒科 是年国际病毒分类委员会第六次病毒分类上新增的一个病毒 科。因其核酸是单股负链,封闭的环状而得名【 。包括一些动物病毒和植 ,、鸡贫血病毒 物病毒。动物病毒有猪圆环病毒 , 、鸭圆环病毒 , 、鹅圆环病毒 , ,、鹦鹉喙羽病病毒 ,或 【、鸽圆环病毒 , 第一部分文献综述 浙江大学博上学位论文 ?、金丝雀圆环病毒 ,【】以及人的输血性肝炎病毒 . ,?、病毒 和类输血性 ,引。植物病毒有三叶草侏儒病毒 肝炎小病毒 ,、椰树叶腐烂病毒 ,】和香蕉束项病毒,等。 年,第八次报告则将圆环病毒科重新分为圆环病毒属 和环状病毒属。后者只有一种病毒。而圆环病毒属包括、 、、和等。”以及植物圆环病毒被分别归入指环病毒 属和矮化病毒科】。 . 的形态和理化特性 年,等研究发现是小而无囊膜的二十面体病毒,直径为 ,是最小的动物病毒之】图。在中浮密度为./,沉降 系数为,相对分子量为. 。对外界环境的抵抗力较强,在 的酸性环境中可存活很长时间,在。或氯仿处理一段时间不被灭活, 在高温环境?也能存活一段时间。而且由于该病毒没有囊膜,它们对氯仿、 碘酒、酒精等有机溶剂不敏感。但对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化 剂等 较敏感【。不具有凝血活性,不能凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的 红细剧】,其抗血清不能抑制细小病毒的红细胞凝集,与 在抗原性上有较大的差异,基本上没有交叉反应【。 ., 图电镜下的病毒粒子和类病毒样粒子 ? . 第一部分文献综述 浙江大学博上学位论文 . 的体外培养特性 可以在体外具有旺盛增殖能力的细胞中复制传代。但由于它本身基因 组很紧凑,不表达各种复制相关的酶类,因此的复制只能依赖处于有丝分 裂期的细胞中的酶类进行复制。.细胞是体外培养的良好细胞系且 不引起细胞病变【。有学者用、等细胞分离,但是病毒对细胞的 适应性较差,且有报道认为在细胞连续传代时会导致病毒抗原性的 改变【】。而等删发现用.氨基葡萄糖处理接种的. 细胞可促 进病毒进入细胞核,提高病毒复制能力,使抗原阳性细胞数增加%。 而等 研究发现不经.氨基葡萄糖处理的细胞,延长培养后也同 样可以达到良好增殖。等【硼研究发现用干扰素处理细胞后,通过病毒的 内化作用可以提高病毒感染细胞的能力,达到良好增殖。这也侧面解释了为 什么 免疫激活后,反而加速了疾病的发生。在体外传代过程中可能会发生氨基 酸突变而使病毒对细胞的适应性增强,但病毒的致病能力却降低【】。这提示 可以 通过连续传代的方法致弱病毒,为弱毒疫苗研制提供了一条途径。 猪圆环病毒的分子生物学特征 . 分子特征和主要元件 的基因组为一个单链环状。其中基因组长度为 或 ,而基因组全长一般为或。和基因组核 苷酸和氨基酸同源性分别低于%和小于%。不同的分离株间序列非常 保守,同源性高达%以上。而国内外流行的毒株基因组同源性为%, 不同地区的分离株存在一定的氨基酸突变,特别是与病毒致病力有关的蛋 白变异率很大。等于年对中已发表的条全基 因组序列进行了遗传进化分析,发现它们可以被分为个不同的分支~ 和一。 和基因组中均存在个可能的开放阅读框。。由于 基因组很小,这些很多都相互重叠。其中,、和为三个 主要的开放阅读框【删图。由个核苷酸组成,编码病毒复制必需的 。它在两种间较为保守,核苷酸和氨基酸 相关蛋白,分子量第一部分文献综述 浙江人学博十学位论文 同源性分别可达%和%。蛋白可变剪切其内含子序列? 后形成分子量为. 的’蛋白,两者都是病毒复制所必需的【。蛋 白含有个糖基化位点,分别位于.位、.位 和?位区域内。此外,蛋白还具有个与滚环复制相关 的基序,分别是 、 , 和 这三个基序对于蛋白与非编码区的茎环结构的结合和维持蛋白的结构 与功能都至关重要,突变或缺失都会影响病毒的复。 图 和基因组结构图 ; .位于基因组负链,由个核苷酸组成,编码病毒唯一 的结构 。和 序列差异较大, 蛋白??核衣壳蛋白, 核苷酸和氨基酸同源性仅为%和%。蛋白在.位区域 有一个糖基化位点。等‘】利用单克隆抗体对 蛋白的抗原 表位进行筛选,发现该蛋白的抗原表位主要集中在.位、.位和末 端最后个氨基酸区域内。等、等【分别发现和 蛋白端包含大量碱性氨基酸的序列与该蛋白的核定位有关,其中含有多个与 典型核定位信号序列一致的元件。核衣壳蛋白的功能不仅仅限于病毒粒子 的组装,它还有可能通过与复制相关蛋白的作用而参与调节病毒基因组的复 制 。和 蛋白拥有各自不同的抗原表位【】,说明是一个主 要的型特异性抗原【。因此 蛋白已被作为诊断抗原用于感染的 第一部分文献综述 浙江大学博士学位论文 血清学调查和构建重组疫苗的研究。 为一个最近发现的与病毒致病性相关的基因,由个核苷酸组成, 编码一个分子量为 的非结构蛋白。等【经.过体内外研究发现 编码的蛋白与病毒诱导的细胞凋亡有关,但与病毒的复制无关。 如图,和基因组中还各自含有几乎一致的病毒复制起点 ,它位于和的基因间序,具有多个特征性结构,包 括圆环病毒属特有的茎环结构?及其顶部保守的核苷酸基序 等。其中和的茎环结构序列分别是 ?和,包含八个碱基的保守序列,即 标记为.,它是病毒复制所必需的。在茎环结构两侧还有四个.的重复 序或。研究表明,这两种元件都与病毒的起始复 制有关,主要通过与和’蛋白结合起到降低茎环结构的稳定性,并在八 核苷酸序列的第六与第七位碱基、【碱基间破坏核苷酸链而起始病毒的 复制【缶。 . 图 和复制子序列 .,. 第一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 由于圆环病毒的合成发生在细胞核内,因此病毒的基因组和蛋白均需 要转运至核内进行复制和增殖。而定位至细胞核内的蛋白很多都含有成串碱 性氨基酸组成的核定位信号序列 ,】。 序列可介导蛋白质向细胞核内转运,主要可分为单一型和双分型两种,其中 单一 型为个连续的碱性氨基酸组成的短肽,而双分型序列的特点则是端的个 和端的个碱性氨基酸被中间一簇.个非保守氨基酸分隔【。有研究报道, 和 蛋白的和定位功能分别有它们端的序列决定,分别为 .. .... 和 以 及和 】。圆环病毒属的另一成员??鸟喙羽病病毒 核衣壳蛋白的末端也含有多个序列可以介导该蛋白的核定位 。在某些与具有类似结构和相同复制模式的植物病毒中,核衣壳蛋白被 认为能够介导病毒的转运,而核衣壳蛋白的破坏或缺失则能直接导致 在核内积聚量的减少【击。而且感染早期,蛋白位于核仁内, 到了后期则与复制相关蛋白共同存在与核浆内【】。因此,核衣壳蛋白的功 能不仅仅限于病毒粒子的组装,它还有可能通过与复制相关蛋白的作用而参 与调 节病毒基因组的复制。 . 毒株的遗传进化分析 等【对基因组变异情况分析后发现大部分突变都集中于 基因。等【】于年对中已发表的条全基因 组序列进行了遗传进化分析,发现它们可以被分为个不同的分支~和 ,但各分支间未发现有特别的疾病和地域关联性。而且由于蛋白 编码与病毒致病力有关的唯一结构蛋白,并且该基因在遗传进化过程中不易 发生 同源重组现象,因此,基于的进化树可以直接反应各毒株全基因组 的进化情况而被广泛用于分子流行病学调查【。温立斌等【】对我国流行的 毒株进行?进行分型后发现,我国存在.九种基因亚型毒株, 其中.为优势基因型。 第一部分文献综述 浙江人学博十学位论文 图 毒株的遗传进化分析 .,.的复制与转录 主要在机体中的单核/巨噬细胞和抗原提呈细胞中复制,少数病毒可在 肾小管、支气管的上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和淋巴细胞中增殖。以滚环 复制模式? ,进行复制。蛋白与茎环结构的右臂 和两个内部的六聚体重复序列结合,而’与另外两个六聚体重复序列结合【】 并在第七个与第八个之间切开以起始正链的复制。同时君’蛋白还 参与了病毒基因组的剪切与病毒复制的终止过程。在复制过程中,单股闭合 第一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 环状基因组首先转变为双链的复制型中间体。在对和复制子 序列进行研究后,提出了的“坩埚滚环复制模型。即蛋白复合体结合 九碱基基序而破坏茎环结构的稳定性,使该茎环结构区域处于类似“熔炉” 的不 稳定状态,然后解开超螺旋,在处切开环,进行滚环复制。在此过程中四条 互为反向重复的链彼此靠近形成四链的三级结构。 壁通 肌? 图 钳锅滚环复制模型,。.署】对病毒复制过程中产生的转录本进行杂交分析, 从 、 感染细胞中发现有 和 长度的三种存在。其中,矛 的都是 在病毒复制过程中丰度最高, 同一方向。除此 可变剪切产物,具有相同的’端,并且与 之外讧还可通过可变剪切的方式形成、和四种复制相关蛋白 和、和三种非结构蛋白矾。序列分析比较表明,、 ’和的序列相同。、和是从内部的启动子下游 的个不同的启动子开始转录的。而从感染细胞中检个病毒转录 体,它们分别是个病毒衣壳蛋刍、。相关,’,, ,.?,.,和.和个非结构蛋白相关, 和。相关具有相同的’和’核苷酸序列,其’序列 又与非结构蛋白相关相同。编码全长的病毒复制相关蛋白,可能是 相关的初始转录体,经过剪切后形成另外个。、 和 则由位于的与启动子无关的个不同的启动子转录而来。序列分析表明, 第一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 , 和均利用相似的遗传单元印,’,,,, 和调控病毒基因的表达,病毒的、’、、和基 本相同,而和相关矾则在拼接和量上存在差异。该研究工作为研究 和的生物学特性和差异提供了良好的遗传基础和框架。 感染性克隆技术的研究进展及其在疫苗开发中的应用 通过反向遗传学技术构建病毒的感染性克隆,即从病毒的遗传材料入手,通 过必要的方法在培养细胞或易感宿主中获得子代病毒,在此基础上可以于分 子水 平修饰病毒的基因组序列来研究病毒的基因结构和功能。圆环病毒基因组为 环 状,结构紧凑,包含了复杂的遗传信息。通过感染性克隆技术,国内外众多学 者 对复制元件、致病性等方面进行了研究,有助于在分子水平研究病毒 的复制机制及致病作用等。 年,等【首先将两个拷贝的基因组以首尾相连的方式克 隆入 质粒,构建来.感染性克隆。该克隆在 细胞内能产生具有感染性的病毒粒子。进一步将此重组质粒直接接种 猪的肝脏和淋巴结,发现其与接种野毒组的猪具有类似的症状,包括 全身淋巴结棕褐色、肿大,肺脏肿胀等,且伴有不同程度的组织病理学变化, 病 变组织中还能检测到特异性抗原的存在。上述结果证明能够引起类 似的病理损伤,但又不是导致的唯一病原,它需要其它病理因子 的共同作用才能引起典型的的临床症状和病理变化。感染性克隆 容易保存、稳定性高,大批量生产费用较低,从而为基因工程疫苗的开发 和应用奠定了基础。 等【】于进一步构建了具有免疫原性的减毒.嵌合 病毒。即在基因组的基础上,以的基因取代 的。同时,也构建了.的杂交基因组作为对照,即以 取代基因组中的。将这两种克隆转染.细胞,结果发现 均具有感染性。在体内的免疫原性和致病性试验中,接种感染性克隆的试 验猪无论是大体组织损伤还是显微病变都比其他几组接种猪严重得多。这 些结果表明.病毒能诱导抗核衣壳蛋白的特异性抗体反应,但它的 毒力明显下降。保护力试验证明,对.病毒或其克隆免疫的攻 第一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 毒后,免疫猪血清和淋巴结中的基因组拷贝数明显减少,而且 .相关的疫苗对感染引起的淋巴系统损伤具有良好的保护作用。 因此,.嵌合病毒和.感染性克隆可以作为有效防止感染和 流行的疫苗。等】利用这一思路构建多种 /.的突变体:即将不同大小的 片断连入基因 组,以取代相应的 序列。将这些/杂交基因组转染. 细胞,并用种核衣壳蛋白的特异性单抗检测它们的抗原性。结果发现 蛋白至少含有个部分重叠的构象性抗原表位,分别存在于 位、~位氨基酸及.末端最后位氨基酸中。这些抗原位点为进一步研 究核衣壳蛋白的结构提供了重要信息。而且这些不同的/ 突变体在一定程度上保留了各自杂交型核衣壳蛋白的结构和抗原表位构剩。 因 此,/嵌合系统有助于研究阐明复制和致病性的分子机制。 等【】还在的体外传代过程中发现其核衣壳蛋白中与病毒体外 复制和体内毒性作用有关的两个氨基酸突变。即传代代后,位于 蛋白的第位的脯氨酸突变成了丙氨酸;而传至代时,第 位的精氨酸发生突变形成了丝氨酸。这两个氨基酸位点的突变提高了 的体外增殖能力但却降低了其在体内的毒性作用,也为疫苗的研制 提供了思路。 等【】于年构建了一个欧洲株的感染性克隆,并在全 基因组后引入了一段重复序列。它们认为相比于只含有单基因组的重组质 粒,这样有助于在细胞内通过同源重组自身环化并从质粒中释放出来。国 细胞盲传后能 内,陈溥言等【】首先成功构建感染性克隆,体外转染 够检测到病毒的复制。随后也有其它学者进行了感染性克隆的体内外试验研 究 【,】。 感染及其相关疾病的研究进展 . 相关疾病的研究 目前,被普遍认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要致病因子 。但越来越多的研究表明,在表现为其它临床症状的病猪体内也能 第一部分文献综述 浙江大学博士学位论文 分离得到,但它对这些疾病的影响和作用还不是很明确【】。这些与相关的 疾病主要包括猪肾炎皮炎综合征、猪呼吸系统综合征、繁殖障碍、增生性坏 死性 肺炎和先天性震颤等。 增生性坏死性肺炎主要危害一周龄的猪,发病率在%一%, 死亡率在%一%。目前,许多学者用重组感染复制出症状,这说 明对的产生起了一定作用。其眼观病变为弥散性间质性肺炎和增生 坏死性肺炎,呈灰红色。电镜观察可见肺部存在病毒粒子,存在于肺细胞 增生区和细支气管上皮坏死细胞碎片区域内,肺泡腔内有时可见透明蛋白 【】。 由于能通过公猪的精液或在母猪体内垂直传播给仔猪,因此可引起母 猪的繁殖障碍。该病主要发生在初产母猪或导入的新猪群中,其临床症状包 括母 猪发情延迟、流产、死产、木乃伊胎增多、断奶前死亡率上升。在死产和新 生仔 猪中最常见的病理损害为非化脓性到坏死性或纤维性心肌炎,并含有抗原 【,】 猪呼吸系统综合症也是一种圆环病毒性疾病,它在美国 的发病率高于。该病会由于多种病因引起的肺炎而阻碍?周龄猪的生 ,病例中 长。而从增生性坏死肺炎 。的临 分离出病毒,暗示可能是一个重要的致病因子【 床症状与相似,但它主要表现为肺炎,并出现在较大周龄的猪群中,死亡 率也比低,并且它对防治猪肺炎支原体、猪流感病毒或猪蓝耳病病毒的疫 苗和药物敏感。患猪的肺炎通常是由于病毒和细菌共同感染造成的,如 、、猪流感?、猪肺炎支原体、出血性巴斯德氏杆菌和猪传染 性胸膜肺炎放线杆菌。研究发现,所用的病例中,有%存在和 感染【。实验证明和确实有协同作用,可以促进的复 制能力。和试验共感染猪确实导致了呼吸症状加剧和肺脏病理损伤严 重【】。有和共感染造成的支气管间质性肺炎与临床观察到 造成的病变一致【】。 多发生于仔猪出生后一周内,震颤症状由轻到重,卧下或睡觉时症状消 失,受外界刺激时可以引发或是加重震颤,严重的可影响吃奶,以至死亡。每 窝 仔猪受病毒感染的发病数目不等,大多是新引入的头胎母猪所产的仔猪。但 目前 是否是引起的主要病原微生物还存在争议。 等【】于年从患 第一部分文献综述 浙江大学博上学位论文 病例的猪只中分离出病毒,并认为与猪的发生有密切关系。 等睇】在随后的研究中发现在猪病例中缺乏感染的证据。 但是 该学者利用免疫组化和原位杂交技术检测来自西班牙、爱尔兰和瑞士的共例 患的仔猪中是否存在或,并用技术对西班牙的患猪进 行检测,结果均未检测到的核酸或抗原。因此与之间的确切关系 还有待于进一步证实。猪肾炎皮炎综合症 ,是 一种相对来说较新的是致死率较高的疾病,通常感染年龄在..个月的断奶和 育 肥猪,育成猪和后备母猪也可发生。于年首次在英国爆发,随后美国、 欧洲和南非均有报道。主要发生在断奶后育肥阶段,大约.周龄的猪只。发 病率为.%一%,有的可达到%,通常病猪在天内死亡,有的在出现临床症状 后.周后才死亡。也可感染保育期和生长育肥期的猪,常呈零星发生。据 欧洲报道,由引起的死亡率一般为%.%,但北美的发病率相对 较低,不超过.%。被认为是一种免疫介导的水疱性病,以皮肤和肾脏 的病变为主。最典型的临床症状与猪瘟类似,主要为皮肤发生圆形或不规则形的 隆起,呈现红色或紫色中央为黑色的病灶。病灶常融合成条带和斑块。病灶通常 在后躯、后肢和腹部最早发现,有时亦可扩展到胸肋或耳。发病温和的猪体温正 常,行为无异,常自动康复。发病严重者可能显示跛行、发热、厌食或体重减轻。 其主要病理变化为肾肿大、苍白,常被出血小点覆盖。特征性的显微损害为全身 性坏死性脉管炎和纤维蛋白坏死性肾小球性肾炎。这种病损是型过敏反应的特 征,属免疫介导性障碍,由免疫复合物在脉管和肾小球微血管的管壁上沉淀引起 。显微镜检主要是以严重的血管出血和肾小管纤维素性脓肿。胃部、肝脏、脾 脏、淋巴结、肾脏、真皮和皮下等位置血管发生明显的纤维素性坏死。其他肾脏 病变包括溢出性肾小球性肾炎和间质坏死;淋巴结内发生淋巴滤泡减少和皮质和 副皮质区淋巴细胞坏死,大量的多核巨细胞聚集于皮质区和副皮质区内。 核酸可在肾小管上皮细胞、梭形间质细胞和巨噬类细胞中检测到,这些细胞通常 聚集在。肾盂血管周围,大量非阳性的单核巨噬细胞则通常聚集在肾脏皮质 和髓质之间区域,大量阳性细胞聚集于淋巴结的皮质和副皮质斟聊】。浙江大学博七学位论文 第一部分文献综述 .断奶仔猪多系统衰竭综合征 断奶仔猪多系统衰竭综合症是猪的一种传染性疾病,世界各国都 有发生,主要感染?周龄的小猪,临床症状包括消瘦、可视黏膜苍白、呼吸 困难、间歇性腹泻及淋巴结肿胀,死亡率较高。自年【”】加拿大首次报道该 病至今,已经在欧洲、美洲及亚洲等养猪业发达的国家广泛流行引。已经 对养猪业造成严重的经济损失,也影响着公共卫生。据欧盟估计,该病 在荷兰的流行,肉猪的出栏率降低%左右,共造成.?亿欧元的经济损失 陋,删。引起的经济损失主要是由于生猪出栏率减少、饲料转化率降低、 饲养管理和防治费用增加、由于免疫抑制引起的继发感染等。比如沙门氏菌、小 肠结肠耶尔森菌等的感染率增加,并污染屠宰猪阴】。此外,为控制而大量 使用抗生素,使得许多病原菌对药物产生耐药性。并且使得猪肉中的药物残留量 超标。 主要发生在.周龄的小猪中,表现为消瘦、苍白、间歇性腹泻、呼 吸困难、腹股沟淋巴结肿大,少数伴有黄疸【】。人工接种试验表明三周龄以内的 仔猪可出现症状,但在自然条件下,这些仔猪几乎很少受到感染。 感染猪在?周内病情会急剧恶化,并且由于该病引起的免疫抑制,导致其它细 菌、病毒或真菌的继发感染,如蓝耳病病毒、肠炎大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜 血杆菌及卡氏肺囊虫等阮。由于不同地区、不同农场猪群的健康状况不一, 的发病率在%之间变化,但受感染猪的死亡率却可高达.%】。 猪场中流行还可能导致病例的增加,其发病率一般低于%,主要表 现为高烧、广泛性皮疹以及肌肉坚硬等,病理剖解可见皮下水肿、淋巴结出血、 肾脏淤血水肿等【。的典型病理特征是非萎缩性、棕褐色肺脏以及淋巴 结肿大,并且淋巴结切面质地均一而非正常的泡状结构;肾脏可见散在性白斑和 胃溃疡、肝萎缩或肿大及黄疸【。猪还会出现由于感染心肌细胞引 起的典型充血性心力衰竭而导致的腹水、胸膜黏连、肺水肿和心肌无力等症状 【 ,。对病猪淋巴器官的组织病理学观察发现其内的淋巴细胞减少,取而代之 的是组织细胞包括多核巨细胞的大量增生,从而使其小叶结构基本消失。另 一个 典型特征是组织细胞或巨细胞胞浆内有大量葡萄状、嗜碱性包涵体的存在【。 第一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 图 感染仔猪表现消瘦,肺脏萎缩并有间质性肺炎 .,. 虽然普遍认为为的主要致病因子,但人工接种只能引起淋 巴系统病变而不能完全复制出的症状。因此很多学者认为还有其它可能与 共同作用引起的因子,包括常见病原菌或病毒、饲养管理因素、疫 苗策略等【。病毒性因子如猪细小病毒和猪蓝耳病病毒 在人工试验中能加重的病情,而且在自然条件下,也能加剧感染 。还有报道称,一些免疫调节物质或常见的商业化细菌苗刺激人工感染 猪后能够加剧其病情【】。立大学的研究证实了在人工感染试验中,疫 苗免疫的时间及所采用的佐剂对的病理学变化有显著影响:在攻毒 前.周接种疫苗对无病理学影响【,而水包油型佐剂刺激引起的淋巴器 官损伤要比亲水性或氢氧化铝佐剂刺激引起的损伤严重的多】。此外饲养管 理因素如生理应激和卫生条件等对发病的具体影响还有待进一步的流行 病学调查研究。 的诊断首先需要区分农场中是处于流行和散发性发病。因为据 等【】‘报道,少数个体的发病不会影响整个农场的生产状况和病猪死 亡率。而且消瘦、死亡率增加等症状也可能由其它病原引起。等; 通过调查提出个体水平的诊断依据包括个条件,并且缺一不可:即表现 有消瘦等临床症状:病理变化可见间质性肺炎、淋巴结病变;或能从病 变组织中检测到的存在。等【?于年进一步提出了基于整个农场 的诊断方法,即首先有明显的临床发病过程,主要观察猪群有无过度消瘦。 而如果死亡率比预期的高出%就可推测可能有的流行。其次要有个体 病例的确诊。第一部分文献综述 浙江大学博士学位论文 由于的发病是多因子作用的结果,人们对其病原学和流行病学还不是 很了解,疾病的诊断也较困难,并且直到最近才有一些疫苗的应用,因此制定 完 整可行的疾病防制策略较为困难。,等【剐概括出预防措施 包括个方面:即饲养管理、营养条件、遗传因素、治疗方法、免疫情况和生 物 安全性。年等【将良好的饲养管理方法归纳为点,并认为它们能 显著降低猪群感染后的死亡率。但由于这些方法很难应用于大型商业化猪 场,年】重新制定条规则,即实行全进全出原则,以减少猪群 间的接触;减少应激:保证良好的卫生条件及提供全面的营养。其它控制 的有效管理方法还有实行批次产仔及部分减群等。此外,选择合适、有效的 消毒 剂进行环境消毒对控制的感染也非常重要,特别是批次饲养的猪场。 . 的感染和致病机理 .. 的感染 众多研究表明虽能单独感染猪,但只产生非典型的、轻微的临床症状 和病理损伤,很难复制出具典型临床症状的。、和等 病毒单独感染也不能引发,但这些病毒与联合感染能够加重感染 猪的临床症状和病理损伤‘。现已证实感染猪体后,在 体内增殖,导致感染猪发生一系列临床和组织病理学变化,主要特征是在淋 巴组 织和其它部位的滤泡性树突状细胞、组织细胞和大量吞噬细胞内出现病毒的 进行 性积累【】。临床上表现为一系列相关疾病。等【于年对 在体外细胞中的吸附和侵入进行了研究。他们发现在感染单核细胞系 /后 ,病毒样粒子 ,吸附细胞数达到最高峰, 大约有%的细胞能够内吞吸附表面的,感染后 ,大约%的被 内吞进入细胞。且这种内吞作用与笼形蛋白介导的细胞内吞作用相关,但需 要一 ,、 个酸性环境。而在病毒感染细胞前用肝素、硫酸乙酰肝素 硫酸软骨素 ,.和硫酸乙酰角质素等氨基葡聚糖 ,处理病毒或者将细胞上的和用酶进行处 理后,显著的降低了感染细胞的数量,表明细胞表面的是病 毒吸附和侵入的受体【。第一部分文献综述 浙江人学博士学位论文 不能编码自身所需的酶类,其复制需要宿主细胞期核内各种酶的帮 助【】。因此,对复制相关蛋白的核定位研究可以筛选出的嗜性细胞【。 研究表明,对于上皮细胞的感染性很强,其中就能为提供良 好的生长条件【。而且感染的不同阶段,其靶细胞会发生相应变化,子 宫内感染试验则证明对胎儿的心肌细胞具有偏嗜性【引,而对于出生后的 仔猪则主要感染其巨噬细胞系统【。有人认为淋巴组织中存在的抗原都 是吞噬作用的结果,但有研究指出能在肺泡巨嗜细胞中繁殖和积聚,这表 明免疫系统中也可能存在感染的靶细胞,从而导致免疫功能的失调【。 此外,的感染和的发生可能与猪机体自身的遗传因素有关。 等在人工感染后发现,长白猪较杜洛克和大白猪对更敏感【】, 而皮特兰猪对具有很高的抵抗力【踟。 .. 的致病机理 机体免疫功能的紊乱和抑制对的感染和等发病具有主要作用。 首先,对受感染淋巴组织中的免疫细胞研究后发现淋巴细胞及树突状细胞减 少, 而相应的有大量组织细胞增生抗原阳性 】。引起淋巴细胞减少的 原因目前还不是很清楚。但可能与感染组织内皮微静脉的萎缩导致淋巴细胞 循环 游走减弱以及抗原递逞细胞递逞能力下降和细胞、细胞功能减弱有关 】,但与细胞凋亡无关【。其次,血液循环中也出现淋巴细胞减少症,引起机 体免疫功能紊乱【】。主要为细胞和细胞特别是细胞的减少。 而循环中嗜中性白细胞和单核细胞的增多能进一步加重淋巴细胞减少症,使 淋巴 】的人工感染试验表明,细胞在 细胞与嗜中性白细胞的比例倒置。等【 感染后减少明显,并且在第天加剧,而细胞这时才刚开始递减。 到了天,细胞和细胞出现最大程度的消亡,最为显著的是细胞的消失, 而粒细胞和单核细胞受到的影响较小。免疫功能的紊乱最后还能导致猪群的 免疫 抑制现象,使感染的猪群对其它条件致病菌或者未知病原体的感染更为敏 感,比如卡氏肺囊虫和白色念珠菌等,容易引发继发感染而加剧病‘青】。但 上述变化的机理还不是很清楚,因为目前的研究表明一般不能在单核细胞、 巨嗜细胞、树突状细胞和淋巴细胞中复制【】。 感染还能引发机体各种细胞因子分泌的变化。等【发现第一部分文献综述 浙江人学博二学位论文 病猪淋巴细胞的众多细胞因子表达水平发生了改变,表现为胸腺. 、扁桃体吖过量表达;而脾.和.、扁桃体.、腹 股沟淋巴结中的、.、.和一的表达量降低,其中. 的过表达与患猪胸腺萎缩的组织病变相关;血液循环系统的吖, .,.,.和.表达下降图。周双海等【用竞争的方法 对感染猪的肺泡巨噬细胞中.和. 表达水平研究发 现,感染初期可导致趋化性细胞因子.和.基因的转录明显下 调。以上研究结果表明,发病猪中细胞因子丰度严重失衡,细胞 高度抑制,感染猪的免疫系统严重受损。 . 的流行病学研究 自从年首次在加拿大分离到以来【】,已经发现该病毒广泛存在于 北美、欧洲、拉丁美洲、亚洲和大洋洲的许多地区。研究证明,病毒至少 自年以来就存在于欧洲,自年以来就存在于加拿大,但当时相关疾病 的发病率低。而现在发生率升高可能是由于单独感染猪后的非典 型性症状和世纪年代后、和等病毒混合感染的情况增 多造成的。虽然许多国家和地区的猪群中存在和由它引发的疾病,但是各 国的流行状况之间存在有很大的差异。等【】于年证实,在美国佐治 亚州、北卡罗来纳州和衣阿华州猪群中均存在抗体,抗体阳性率为%。 在英国,的流行相当严重,阳性率高达%,爆发曾一度对其养 猪业造成了巨大的损失【。在荷兰,等‘于年的调查发现 在具有症状的猪场中检出率为/,在没有的猪场中为 %,并且至少%的具症状的病猪存在与共感染的情 况。’.等【发现西班牙猪群中的感染率为.%。其它 欧洲地区如法国、北爱尔兰、希腊、捷克、丹麦、瑞典、匈牙利等国家中, 及其引起的相关疾病的流行也相当广泛‘图。在亚洲地区,年, 等在韩国的猪场中首次检测到感染。日本于年首次检测到 猪群中有感染并证明感染早在年即在日本存在,目前已在包 括北海道在内的多个地区流行,并呈逐年上升趋势【。 我国对的研究始于年底,流行病学调查表明,我国大多数地区的第一部分文 献综述 浙江大学博十学位论文 各类猪群中,的感染比较普遍。郎洪武等删年采用方法对 北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等省市个猪群的份血清进行 了检测,样品总阳性率为.%,其中日龄未断奶仔猪阳性率为/, 月龄断奶仔猪阳性率为.%/,育肥猪的阳性率为.%/,后 备母猪的阳性率为.%/,经产母猪阳性率为.%/。由此 可见,抗体阳性率与猪的年龄有一定的相关性,猪群中感染比例随着 年龄的增长而升高,这一结果与国外的报道相似。等【对.年采集 自浙江省及周边地区猪场的份血清进行了检测,发现抗体阳性率为 .%。且断奶后仔猪.%,/和肥育猪血清.%,/ 抗体阳性率要显著高于哺乳仔猪的阳性率.%/。随后的多项研究证 实在广东、湖南、湖北、福建等地个别猪群中均存在感染,其形势不容乐 观。 目前尚不清楚的宿主范围。猪是的天然宿主,不同年龄、品种和性 别的猪都可感染该病毒,但以哺乳期和育成期的猪最易感。在野猪体内, 感染也十分普遍】。而有关感染异种动物的报道也存在争议。 等于年报道可以感染牛,并且从患呼吸道疾病的牛和流产的胎牛体 内分离出病毒。但此后等【和等【的研究结果正好与其相反。 .等【研究发现可以特异感染人的外周血白细胞,并且引起 细胞形态学和超微结构改变。还可以感染/小鼠,并且产生与感染猪 相类似的病理特征,后者已被较多的作为矛感染的动物模型【】。 关于自然传播模式的研究也较多,但至今为止的研究结果表明病猪和 带毒猪是主要的传染源。已有研究报道易感猪与人工感染的发病猪直接接 触后发生,这就证实可在猪群中水平传播【。 等【 于年从鼻拭子、粪便等样品中检测到核酸,推测病毒可能随粪便、 鼻腔分泌物等排出体外污染饲料、水和周围环境。经口腔和鼻内实验感染新 生仔 猪能复制出典型的症状,这说明病毒可经呼吸道和消化道感染易感猪。 等和’等【分别从流产和新生弱仔猪体内检查出抗原和 核酸,说明可通过胎盘垂直传播。等删和等【已经从公 猪的精液中检测到核酸,但目前尚无确凿的证据证明可以通过公猪 的精液传播。 三燮一气一蛳?州咄。第一部分文献综述 浙江大学博上学位论文 图 。 在世界范围内的流行情况 . 的检测 .酶联免疫吸附试验 方法是一种灵敏、快速,适合于大规模检测的诊断方法。目前已被广 泛用于血清抗体的检测和监控。与间接免疫荧光试验相比,简捷、 快速,而且一次可以检测大量样品,非常适合用于血清学调查,但其敏感性略 低 于免疫荧光技术。目前用的较多的是间接和竞争法。 等【于年分别采用.细胞增殖的病毒粒子和昆虫细胞表达的 特异性衣壳蛋白作为抗原建立了间接 。用该法对 人工感染的猪进行血清学抗体检测,发现以病毒粒子和作为 抗原的的敏感性、特异性和准确性相似,接种后.即可检测出 抗体,抗体含量逐步增加。国内崔尚金等采用抗原和正常细胞对照抗原, 建立了间接,并被农业部推荐进行流行病学调查。等于 年首次利用和特异性单克隆抗体建立了竞争方 法来检测的抗体。对来自英国、加拿大和法国的份感染的猪血 清的检测结果表明,竞争方法的检出率为.%,而同时利用间接免疫 荧光检测的阳性率仅为.%,这说明该方法比免疫荧光方法更灵敏,可用于第 一部分文献综述 浙江大学博十学位论文 抗体的大规模检测。 在方法中包被抗原多为全病毒粒子或 蛋白。但 病毒培养物病毒含量较低,纯化繁琐,成本高。目前,商品化的主要是 公司的全病毒试剂盒。而采用重组蛋白,表达产量高,易纯化,降 低成本,因此被普遍用作方法中的包被抗原。目前蛋白主要 采用重组杆状病毒和大肠杆菌进行表达。等【建立了抗原捕获 检测技术,但是该方法还有待于进一步研究。 .免疫组化试验 免疫组化技术适合于病毒抗原在组织培养和机体细胞内生长定位的观察。 等【将纯化的与佐剂混合免疫大白兔,获得了高免血 清。利用该高免血清与包埋组织中的抗原结合,然后用生物素标记的抗抗 体与血清结合,最后用过氧化物酶标记的链霉素染色。这种借助生物素一链霉 素?酶复合物的生物放大系统,可以将抗原抗体结合位点的信号进行多级放大, 进一