端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏缺血再灌注损伤修复过程中的作用的研究(可编辑)

端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏缺血再灌注损伤修复过程中的作用的研究(可编辑) 端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏缺血再灌注损伤修复 过程中的作用的研究 复旦火学博士研究生 复旦大学博士论文 ? 端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏 缺血再灌注损伤修复过程中的作用研究博士生:宋捷 院系:复旦大学华山医院 导师:顾勇教授 导师组:陈靖教授 ?? ?端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏 缺血再灌注损伤修复过程中的作用研究 ? 全文目录 中文摘要 英文摘要 前言第一部分端粒酶在健康成年小鼠肾脏的表达及其定位 引言材料和 结果? 讨论参考文献 第二部分?阳性细胞中的及分布 引言 材料和方法 结果讨论参考文献 ? 小鼠肾脏缺血再灌注损伤后端粒酶活性与基因表达 第三部分 引言??材料和方法结果 讨论? 参考文献 第四部分 肾脏缺血再灌注损伤修复过程中端粒酶阳性细胞的作用 引言材料和方法脏缺血再灌注损伤后细胞的世系追踪实验 ? ? 在急性肾小管坏死上皮修复中的作用?”?”? 复旦大学博士研究生论文 中文摘要 端粒酶在肾脏的表达及其在肾脏 ? 缺血再灌注损伤修复过程中的作用研究 目的:端粒酶可以维持端粒体长度,防止细胞衰老,在胚胎干细胞中高度表 达,但除部分成体干细胞如造血干细胞外,成年体细胞内几乎已无端粒酶的 表达。我们利用已报道的端粒酶基因启动的转基因鼠研究端 粒酶阳性细胞在肾脏的表达和肾损伤后变化,并求证端粒酶阳性表达能否成 为肾 脏成体干细胞的,进一步明确急性肾损伤修复的机制,以寻求指导急性 肾损 伤治疗的理论基础。 方法:一利用历胁卜转基因小鼠,通过肾小管标记物、、 、及等和肾间质细胞标志物/、、及? 和 等荧光共染定位端粒酶阳性细胞;通过? 定量检测端粒酶基因和酶活性;给 新生小鼠腹腔注射标记期细胞,待 周成年后处死,仍保留标记的细胞为进入缓慢细胞周期的细胞 ? ,观察并计数;周龄雄性小鼠只, ? 夹闭双侧肾动脉,再通,制作小鼠双侧肾动脉缺血再灌注损伤/模 型,分为假手术组、术后天、天、天共组,每组只,分别取肾 标本,同样用和法检测肾损伤修复过程中端粒酶基因和酶活性的变化; 四利用历衙卜转基因小鼠,建立单侧肾脏/模型,并在术后肾损伤 再修复过程中不同时间点观察?再生情况;五利用?: 两种转基因小鼠,通过谱系追踪和细胞周期标记研究肾缺血再灌注损伤 修复过程中细胞的再生和迁移。 结果:一生理状态下,端粒酶基因主要表达在成年小鼠肾脏乳头和内髓部 位,保持较高的酶活性。成年历胁卜转基因小鼠的肾脏表达与保持 一致,端粒酶主要表达于集合管和髓袢的小管上皮细胞且、、、 阳性的小管,而在近曲小管和间质没有表达。二观察标记的肾乳头, .%的细胞长期保留标记,仅%细胞仍有标记,视为进入慢细胞 周期的,这些细胞也散在分布于集合管和髓袢。三堪因于肾损伤后 复旦大学博士研究生论文 在肾乳头的表达明显上调,有统计学意义.,但在髓质和皮质的表 达无显著变化。双侧肾损伤后和,肾乳头处端粒酶活性也显著升高,有统 计学意义.。四为证明急性肾损伤后端粒酶阳性细胞的作用, 刺激后、和分别给予,发现仅.%.%的细胞增殖,且损伤 ? 最严重的外髓和皮质未出现细胞显著增加。五为追踪上皮细胞在 /后的命运,术前一周给成年:鼠单剂,术后 连续天给予,发现细胞未出现明显增殖和迁移,细胞也 并未标记。 结论:本研究首次报道了端粒酶在成年小鼠肾脏中的表达主要集中于肾乳头 和内髓,定位于肾脏集合管和髓袢上皮细胞。在急性肾损伤时端粒酶活性和 基因 表达均上调,可能对肾脏有保护作用,但表达端粒酶的细胞并未明显增生,参 与 损伤后修复。 肾乳头,急性肾损伤,再生修复 ? ?复旦大学博士研究生论文 ? ?:, , , ,, . ,. ’ ‘ 蕾 :? . , ? ., . .,. , , , , . ., . ?;,. ? : , 复旦大学博士研究生论文 , . , , . ?. ,/, , 聊死附 . ?.% . . , ; , . %.: , , % , . ? :, , ? 复旦大学博士研究生论文 .‘?‘ 月? 青 急性肾小管坏死是严重创伤、地震挤压综合症、重大手术及临床上各 种疾病所导致的急危重症,其发病率数十年来居高不下,尽管血液净化技术 和危 ? 重症医学有了很大的发展,病死率仍高达%以上?。以往研究表明,时肾脏 具有强大的代偿及损伤修复能力,在一定程度的损伤后,其形态及功能可完全恢 复正常。但上皮细胞凋亡、坏死、脱落后,怎样完全再生,恢复极性,修复成完 整的肾小管,其机制尚不清楚口。为寻求对行之有效的治疗方法,研究的热 点转向肾小管上皮细胞损伤与修复的细胞与分子生物学机理。 急性肾损伤后小管上皮细胞凋亡坏死,细胞间失去连接,脱落进入小管管腔, 再生的小管上皮细胞来源,目前有三种假说口:一、裸露的基底膜上皮细胞的再 生修复可能由幸存的上皮细胞去分化后进行有丝分裂,增生修复成完整的小管。 二、这些幸存的上皮细胞可能正是一批小管内的干细胞,这些细胞能抵抗缺血缺 氧毒素等不利环境,在肾损伤的特定情况下,诱导其分化和增生,再生为新的小 管上皮细胞。三、再生的小管上皮细胞还可能来源于小管外于细胞如骨髓间充 质干细胞、肾乳头干细胞穿过基底膜迁移到小管内,或与小管内细胞融合,或 直接分化、增殖为成熟的肾小管上皮细胞。 为了求证这三个假说,近几年来,肾脏和干细胞领域的科学家对此展开了深 入而广泛的研究。等报道?骨髓细胞在肾脏缺血损伤小鼠模型 ? 中可分化为近曲小管上皮,证实了骨髓干细胞可向肾脏上皮细胞转化。等人 陆将雄鼠的造血干细胞移植到单侧缺血再灌注损伤/雌鼠体内,周后发现 供者的细胞已转化为受体肾小管的一部分。但也有很多证据不支持上述观点, 等就没能发现新生小管中有移植的骨髓间充质干细胞,反而发现这些骨 髓干细胞已转化为小管间质的血管内皮细胞?。考虑到骨髓间充质干细胞进入缺 血后肾脏的数量很少,且可能存在假阳性的观察结果,等人用一种 特殊的转基因小鼠证实了肾小管自身的细胞参与肾损伤后小管的修复。该小 鼠只有肾小管上皮细胞能被?试剂染成蓝色,所有其他细胞,如肾间质细胞 或骨髓间充质细胞都不能着色,这种转基因小鼠急性肾小管缺血再灌注损伤修复 后与正常肾脏的形态相同,所有小管细胞仍被均质地染成蓝色,证明为修复小管 而再生的小管上皮细胞都是管内残存的细胞,并没有外来的细胞进入小管,融合 增殖。 近几年发现成体肾脏乳头部位存在一群生长缓慢的细胞聚集,肾脏缺血损伤 ? 时能激活增殖,并向受损部位迁移,这些可能就是肾脏干细胞陋,从肾脏发育过 程看应该属于间充质干细胞分化为肾脏实质细胞后的储备。这些细胞用嗅脱氧尿 复旦大学博士研究生论文 苷标记为一组位于肾乳头增殖缓慢的细胞,在短暂缺血后,细胞迅速从 肾乳头消失,证明已迁移或分裂,用共染后发现它们与造血干细胞有类似 表型‘钔。 端粒是真核生物染色体末端特殊的或蛋白结构,由小段重复的序列构 ? 成。每次细胞有丝分裂后,端粒都不同程度的缩短。端粒酶通过增加染色体末端 的重复碱基序列维持端粒长度,从而保护不受损伤,延缓细胞衰老。称为小鼠端粒酶逆转录酶,是端粒 酶活性部分,通常只在胚胎和成体干细胞中表达,在癌变细胞中表达上调仉, 而在终末分化的成体细胞却无表达。端粒酶表达高低和端粒的长度在毛发干细胞 再生中起到了至关重要的作用但在肾脏中有无表达,是否标志了肾脏成体 干细胞,是否参与了损伤后肾小管的再生仍是未知领域。 医生的课组制造了一种衙卜转基因小鼠模型钔,发现该小鼠 的输精管细胞、造血干细胞、神经干细胞、小肠隐窝基底膜干细胞等都表达 历衙卜,是研究和发现各种组织祖细胞或干细胞很好的模型,也是研究端粒 酶和组织祖细胞关系的有效工具。该课题就是利用, 两种转基因小鼠研究了端粒酶在肾脏的表达和急性肾损伤时肾脏修复过程 中的 作用,探讨了表达端粒酶的细胞是否就是肾脏成体干细胞,为研究肾脏再生 医学, 急性肾损伤的修复和再生机制开拓了新的方向。 ? ? 复旦大学博士研究生论文 参考文献: . , : 。 , .::. . ? 谢院生,陈香美。中华肾脏病杂志。;:。 , . .&,,:?. , . , ,. ,::?. , , , . ‘。 . ,::?.. . ?。巍. ,,:?. . , , , 。 ,,:?. ., , , ?. ,,:?., , , .. ,::?., , .. ,,:卜. , .. ,,:. ., ,.,,:?。 ., , , , . ? ,:?.. ? , , , 复旦大学博士研究生论文 .,, :?. ?复旦大学博士研究生论文 第一部分端粒酶在健康成年小鼠肾脏的表达及其定位 引 言 ? 端粒酶通过增加染色体末端的重复碱基序列维持端粒长度,从而保护不 受损伤,延缓细胞衰老。端粒酶结构包括模板和逆转录酶两部分,其中逆转 录酶是端粒酶的活性部分,通常只在胚胎和成体干细胞中表达,而在终末分 化的成体细胞却无表达。端粒酶表达高低和端粒的长度在细胞衰老、细胞恶 变及 干细胞中起到重要的作用, 因此检测端粒酶在正常成体肾脏中有无表达,分 布 的位置及表达的细胞,为进一步研究肾脏成体干细胞提供线索。 材料和方法 .实验动物: 健康成年小鼠:周龄雄性小鼠,体重约?。购于 实验室,饲养及处置于哈佛医学研究所动物实验中心。 转基因小鼠:周龄,雄性,来源于哈佛大学医学院儿童医 院,转基因示意图图.。同种系野生型小鼠为阴性对照。 ? 图. 转基因小鼠基因示意图 .免疫荧光: 组织处理:小鼠麻醉后处死,用冷生理盐水全身灌注后摘取双侧肾脏。肾 脏纵剖后用%中性甲醛固定小时,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片 ,?烤箱烘烤后用于染色。 主要试剂和抗体: ?试剂: 二甲苯 %乙醇 ? 柠檬酸浓缩液公司 山羊血清公司复旦大学博士研究生论文 公司 ?一抗: 抗体 来源 应用浓度 公 司 :? :: :: .:: :: /:: 二抗: : 与一抗相对应的或应用浓度 。 染色步骤: ?常规脱蜡至水: 石蜡切片置二甲苯、%乙醇、%乙醇、%乙醇、 ? %乙醇各,:冲洗 ?抗原修复:.柠檬酸浓缩液加: 配成柠檬酸修复液,将第 ?步的组织切片置于新配好的修复液中,高压蒸汽修复,自然冷却, 约小时。 ?封闭:%山羊血清常温封闭抗原分钟。 ?一抗:组织切片上滴加封闭液稀释的第一抗体,孵育过夜。 ?二抗:洗涤分钟×次,滴加稀释后的二抗避光室温孵育。 ?封片:洗涤分钟×次,封片。 图像采集: 荧光显微镜 共聚焦显微镜或 获取图像。 细胞计数:在肾脏皮质、外髓、内髓、乳头尖和乳头根部各取倍视野 个,分别计数细胞和总数,求比值,并统计比较。 ? . 试剂制备:复旦大学博士研究生论文 ?蛋白裂解液:. . %蔗糖 .. ? 蛋白酶抑制剂 片 加水定容至 ?法蛋白定量染液: 考马斯亮蓝一 %乙醇 浓磷酸 加水至 ?分离胶和浓缩胶配方: %分离胶 浓缩胶 . 去离子水 . . %丙烯酰胺 ./ .. .. . . % ? . %过硫酸铵. ?样品缓冲液配方: %甘油 . , . , % % .%溴酚蓝 ?电泳液配方: . . . .% . ? 加水配成电泳液 ?电转液配方: 复旦大学博士研究生论文 . . . 甲醇 ? 加水配成 . ?漂洗液配方:? . . . 加水至,调值.。 ?封闭液配方:脱脂牛奶? 蛋白提取: ?取小鼠肾组织约置于管中,加入蛋白裂解液。 ?用匀浆器将组织打碎呈均一组织匀浆。 ?震荡,冰上摇小时,间隔震荡。 。 ??低温离心 ?转移上清液至新的管。 蛋白定量:法 ?曲线蛋白样本制备:用/ 等倍稀释为/, ? /,./, ./作为标准曲线。 ?待测蛋白样品按:稀释。 ?染液用水按:稀释后取与稀释的待测样品混合加入 孔板。 ?加样后内用酶标仪在波长下测吸光度。 ?根据标准曲线计算蛋白浓度。 制胶: ?分离胶:将约 %分离胶迅速加入玻板之间的缝隙,再迅速加 入%乙醇压平分离胶,室温放置待分离胶凝固。 ?浓缩胶:倒掉分离胶上的乙醇,用滤纸吸干多余的液体,加入配好的 浓缩胶,插入孔梳子。待凝固后将梳子小心取下。 加样:将聚丙酰胺凝胶连两块玻璃板一起置于电泳槽,加入电泳液使整块 胶完全浸在电泳液。每孔加入蛋白样品蛋白,一孔仅加入 ? 。 电泳:将电泳仪盖子盖好,对应电极接好,电泳至样品染色剂到复旦大学博士 研究生论文 凝胶底部,关闭电泳仪。 转膜:小心取出玻璃板,将凝胶边缘切割整齐。置于电泳液制作三明治: 顺序依次为海绵一滤纸一硝酸纤维素膜一凝胶一滤纸一海绵 去除夹层气泡,置于电转槽,加入电转液,转膜.。 ? 封闭:用镊子取出硝酸纤维素膜,放在含封闭液的瓶皿中,摇床摇。 : 一抗孵育:将膜浸入一抗 封闭液,,,:作为参照,摇床过夜。 二抗孵育:?洗膜×次后,浸入 二抗 :,常温孵育。 显影:?洗膜×次后,滴加按:配置的显影液,暗 房内加胶片显影分半钟。洗片。 扫描并定量分析。 . : 提取和定量: ?小鼠麻醉后,?全身灌注至去除血细胞,用无酶的器械将肾脏取 下,分割为肾乳头、髓质和皮质,分别置于无酶管后放于液氮迅速冷冻。 ?用试剂盒公司按说明书提取,步骤见图. ? 公司测定浓度,并用无酶水将 ? 所有标本稀释为同一浓度。 合成:应用 合成试剂盒 反应体系如下:反应混合试剂反转录酶 无酶水 模板总 总体积将以上反应体系充分混合,置于 进行 反应。反应程序如下: ? 分钟 ? 分钟 ? ? 分钟 ? 维持 复旦大学博士研究生论文 反应结束加水稀释一倍。 ? 口区圃 一鬯型复旦大学博士研究生论文 . : 峭,检测端粒酶活性, 应用罗氏公司 所有试剂均来自试剂盒,原理如图.: ? 图. 法测端粒酶活性原理示意图 组织提取和样品准备: ? ?小鼠麻醉后处死,全身无菌灌注,去除肾脏中的血细胞,然后 各取等量的肾乳头和皮质于无菌管,液氮速冻保存。 ?每管组织中加入裂解液,用匀浆器将其制成组织匀浆。 ?冰上孵育。 。 ?离心 ?小心吸取上清液转移至另一管。 反应: ?阴性对照:每个肾乳头和皮质提取的蛋白样本各取至于新的 管,?加热,灭活蛋白活性,作为阴性对照。 ?加样品和反应试剂,如图.: ? 图.:反应管加样示意图 复旦大学博士研究生论文 ?反应程式:将上述管置于 ,反应程序如 下: ??杂交与检测: .取.上述反应产物,各置新的管,每管加入变性试剂, 混匀后室温孵育。 .分别加入杂交缓冲液或内标杂交缓冲液,加样示意如下: 裂解液 阳性对照 内标 肾乳头阴性对照 肾乳头样本 肾乳头样本 肾皮质阴性对照 肾皮质样本 肾皮质样本 ? 一,。,,杂交缓冲液;。一厶。囊内标杂交缓冲液 .从.中每个样本混合物中取转移到试剂盒提供的含预涂层 微孔板的对应位置。将微孔板放于?摇床,孵育。 .倒掉杂交缓冲液,用洗涤液仔细洗涤每孔,至少×× 次,每次洗涤后将洗涤液清除干净。 .每孔加入 ??,避光置于摇床,室温孵育 。 .彻底清除微孑中液体,用洗涤液仔细洗涤每孔,至少× ×次,每次洗涤后将洗涤液清除干净。 .使底物溶液温暖到室温,每孑入,避光于摇床, 室温显色。 .直接每孔加入停止试剂,终止显色。 ? .内用酶标仪在光波读数,以时的读数为 参考背景值。复旦大学博士研究生论文 .统计软件分析, .统计分析:各组数据表示为均数标准误,应用 组间比较用配对检验,尸值.视为有统计学差异。 ? ? ? 复旦大学博士研究生论文 结 果 .转基因小鼠的肾脏免疫荧光染色: ?转基因小鼠肾脏纵剖面自发荧光,可见绿色荧光蛋白自发荧光 ? 主要集中在肾乳头和内髓部位,外髓见散在自发荧光,皮质几乎无绿色荧光。 见图.: 免疫荧光染色示?细胞主要集中分布于肾乳头和内髓,而肾 皮质几乎没有表达,见图.。 计数肾脏各部位和细胞数并求其比值,约?%的肾乳头细 胞为阳性,显著高于髓质和皮质,有统计学意义。这一比值在髓质减 为%,占肾脏%的肾皮质则仅有不到%的表达,而且从形态上看, 皮质部分的阳性细胞位于髓放线绵延到皮质的部分,并非近曲小管或 小球部分的细胞。见图.。 : .野生型小鼠肾脏各部分端粒酶 取只不同的小鼠,分别检测肾乳头、肾髓质和肾皮质的端粒酶表达, 用睾丸作为阳性对照,作为内参。端粒酶在肾乳头的表达最多,接近 阳性对照水平,在肾髓质隐约可见条带,肾皮质的蛋白没有显示端粒酶条带。 用灰度分析法分析各组条带,半定量估测端粒酶蛋白的表达,见图.。 ? . 法检测端粒酶活性: 经试剂盒检测,野生型小鼠的肾乳头端粒酶活性远远大于肾皮质端粒酶 活性,如图.。 . 定量检测基因表达水平: 在野生型小鼠表达水平于肾乳头最高,肾皮质最少。作为参 照在皮质表达最多,乳头表达最少。?转基因小鼠肾脏的表 达与野生型呈现同样趋势,的表达也与表达一致,见图.。 .与肾小管和肾间质细胞标记的免疫荧光共染: 可以与集合管标记,髓袢降支细段标记,髓袢升支粗段标记、 共染,图.。但不与近曲小管标记共染,不与肾小管间质细胞 ? 、 的标志物如血管内皮标记、巨噬细胞标记/、壁细胞标记 间充质细胞标记及肾脏祖细胞标记免疫荧光共染。见图.。复旦大学博士研 究生论文 ? 成年小鼠肾脏纵剖面自发荧光×。 图. ? ? 。 ?成年小鼠肾脏切片免疫荧光染色 图. 复旦大学博士研究生论文/%. . ?.. ..... ..... . .... ?. .. , .。 ? 图. 小鼠肾脏阳性细胞占所有细胞比值复旦大学博士研究生论文 ? ?一?一??一 ‘ ? ??一 .梦 爹’ 穸 。 图.野生型小鼠肾脏皮质、髓质、乳头端粒酶 木与、比较,. 图.野生型小鼠肾乳头和肾皮质端粒酶活性。 ?复旦大学博士研究生论文 啊翊蜘谢 ? /乏缪 自? 己 彪缮 蛳 ? 厂 芑 钐纱 芒蜘 厉 .彭 墨伽 矿 嚣 参 / 击? 夕 ,爿秒 芷 .‘/ ,??劳?. .复旦大学博士研究生论文嘲 ? 一厶?毫圆,?一匕 碱 ?、,厶,.《 豳 嬲 一??鬯‰,厶《 嗍 ? 一厶、、‰,厶卜 一厶《?甚十厶,~?爻 图. 与肾小管各节段免疫 共染。.阳性细胞与 、、和阳性的小 管均有不同比例的共染,其中大部 ? 虎 分在阳性小管上。.肾脏各 部分细胞占小管细胞的比 .内二 函 ?舢 枷???? 例。 ???哪复旦大学博士研究生论文 ? ? 图. 与近曲小管标记和肾小管间质细胞的标志物的免疫荧 ? 光共染。不与血管内皮标记、巨噬细胞标记/、壁细胞标 记 、间充质细胞标记及肾脏祖细胞标记免疫荧光共 染。复旦大学博士研究生论文 讨 论 端粒是染色体末端的重复片段,随体细胞每次分裂而缩短,在衰老、慢 性疾病及急性损伤后参与组织再生,有研究证明端粒缩短导致肾脏细胞衰老、凋 ? 亡加重,损伤后再生能力下降?。因为端粒的长短取决于端粒酶的活性,所以端 粒酶活性强的细胞能够维持端粒的长度,抵抗细胞衰老和凋亡,促进细胞增殖。 有研究表明大鼠骨髓内皮祖细胞增殖活性下降可能与端粒酶活性下降有关瞳,有 学者用端粒酶反转录基因转染近曲肾小管上皮细胞后,可使细胞具有永生化特性, 且没有改变细胞自身特性。但以上仅限于体外研究的结果,关于端粒酶在肾脏 的体内研究及与肾损伤和再生的关系尚缺乏研究。 我用转基因小鼠作为研究工具,该小鼠肾脏纵剖面自发荧光, 组织大体可见绿色荧光蛋白自发荧光主要集中在肾乳头和内髓部位,外髓见 散在自发荧光,皮质几乎无绿色荧光。免疫荧光染色可进一步证实大体观察 的结果,再进行细胞计数,约%的肾乳头细胞为阳性,显著高于髓质 和皮质,有统计学意义。皮质部分仅髓放线有极少数?阳性的细胞,见 图..。用野生型小鼠进行端粒酶蛋白、酶活性和基因的检测,同样呈现肾 乳头端粒酶表达最多,酶活性最强,基因水平也最高的现象,而肾皮质的端粒酶 表达远远低于肾乳头。我们同时检贝和基因在同一?、鼠中的 ? 表达情况,两种基因的表达呈现一致的趋势见图.,说明?转基 因小鼠与野生型小鼠的肾脏端粒酶表达状况一致,与基因的关联性也很 好,由于端粒酶抗体在检测组织中端粒酶的特异性和效果并不理想,? 小鼠’可以作为研究端粒酶表达和活性的有力工具。 本研究首次报道端粒酶在肾脏的表达。在健康成年小鼠的肾脏,有端粒酶的 表达,不管是端粒酶的活性还是基因的表达,肾乳头部远远高于肾皮质, 一方面推测端粒酶的存在代表了肾脏成体干细胞的存在,因为人们认识到端粒酶 往往表达于有再生能力的细胞,在终末分化的成体细胞多不表达,而且多年来肾 乳头被学者们认为可能是肾脏成体干细胞生存的地方啼;另一方面因为肾乳头和 内髓的高渗环境使这里的细胞处于高度的氧化应激环境下,端粒酶的存在可能为 了及时修复端粒,保护,从而避免细胞过早凋亡?。 ? 在其他器官和组织,已证实端粒酶能作为生精细胞、造血干细胞、小肠隐窝 干细胞等成体干细胞的标志。为进一步定位这些端粒酶阳性的细胞,明确他们 在肾脏中的分布和特定体系,我们应用了肾脏中各类固有细胞的标记物与共复旦大学博士研究生论文 染。 和被认为是壁细胞和间充质干细胞的标记口,被认为是肾脏 祖细胞的标志呻’钔,通过免疫荧光共染,并未发现这些标记与端粒酶共表达。同 时将血管内皮标记、巨噬细胞标记/和成纤维细胞标记共染也没有发 现有端粒酶的共表达,见图.。如果不是肾间质细胞,很大的可能就是肾小管 ? 上皮细胞。经过与各段肾小管上皮细胞标记物共染后发现,绝大多数的 阳性细胞位于集合管,约占%一%,但不是全部,还有一部分散在分布在髓袢 粗段和细段,见图.,而在肾脏的近曲小管没有表达。从肾单位示意图. 来看,这些阳性细胞散在分布在相当长的一段肾小管上,且各节段小 管的上皮细胞形态和生理功能都不相同州羽,那么这些共有的?细胞会 因为分布在不同的小管节段具有不同的特性,还是在不同位置行使统~的职责 科学家们推测的肾脏固有干细胞究竟存在不存在端粒酶是否表达于假想的肾 脏干细胞在肾脏损伤后是否参与修复过程由于端粒酶往往只表达于干细胞 和恶性增生的细胞,在成熟的终末分化的细胞中检测不到,因此,当健康成体 肾 脏中表达端粒酶被证实,一系列问题随之出现,驱使我们进一步探讨端粒酶 阳性 细胞的特性和在肾脏中发挥的作用。 ? ?复旦大学博士研究生论文 ? 升支粗段 罐 ? 图. 肾小管分段示意图及相应检测标记物 ? 复旦大学博士研究生论文 参考文献: , . , , . ? ,,:?. 何小解,许自川,易著文,等。端粒酶反转录酶在体外培养的内皮祖细胞中的 表达。 中华肾脏病杂志,,:。 . , ,, .,,: 一. . ?, , , .,, :?. . , , , . ,,:?. . , , , ., . :?. ? , , , . 一一 . ,:?. ,? , , . . ,,:. :, , . . :. , , .. ,,: ?. . ,? , ,一一一 . ?. . ? . , , , ? .复旦大学博士研究生论文 ,,:一. ? ? ? 复旦大学博士研究生论文 第二部分阳性细胞中的及分布 引 言 ? 由于干细胞自身具有两大特性:一是缓慢地增殖和自我更新;二是在特定条 件下可以被诱导分化为组织成熟的细胞,所以一群成体干细胞都会有慢细胞 周期, 而且聚集在特定的微环境中。多年来肾乳头被学者们认为可能是肾脏固 有成体干细胞生存的地方?,且已被证实表达于其他组织器官的成体干细 胞位,在第一部分我们证实了恰好主要表达于肾乳头这一特殊的位置,我 们假设阳性的细胞就是肾脏固有干细胞,为了证明这一假设我们进行了一 系列实验检验阳性的细胞是否具有干细胞的两大特性。这部分实验通 过给新生小鼠标记,在肾脏发育成熟后,观察细胞是否保留 。 标记,以明确这群细胞是否处于慢细胞周期,也就是 ? ?复旦大学博士研究生论文 材料和方法 . 实验动物: ?转基因小鼠:新生第天,雄性,共只,来源于哈佛大学医学 ? 院儿童医院,转基因示意图图.。同种系野生型小鼠为阴性对照。 .负荷注射:每只小鼠给予/? 公司腹腔注射, 连续两天。之后饲养周处死留取标本。 .组织处理:小鼠麻醉后处死,用冷生理盐水全身灌注后摘取双侧肾脏。肾 脏纵剖后用%中性甲醛固定小时,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片 ,烤箱烘干后用于染色。 .免疫荧光: 主要试剂和抗体: ?试剂: 二甲苯 %乙醇 ? 柠檬酸浓缩液公司 山羊血清公司 公司 ?一抗: 抗体 来源 应用浓度 公 司 ? : :: : : . ??: 二抗: ? : 与一抗相对应的或应用浓度 。 染色步骤:详见第一部分。复旦大学博士研究生论文 .图像采集: 共聚焦显微镜获取图像。 .细胞计数:每只小鼠肾脏乳头部取倍视野个,共个视野,分别计数 细胞、阳性细胞,/双阳性细胞和总数。 ?复旦大学博士研究生论文 结 果 .和免疫荧光共染: 和免疫荧光共染图.绿色为单阳性细胞,口的细 ? 胞;红色为单阳性细胞,即慢细胞周期的;两者共染重叠为橙色 或粉色,表示/双阳性细胞。从肾乳头到肾皮质阳性的细胞 明显增多,趋势与细胞相反,只有很少的细胞为双阳性,集中在。子乳 头。 ‘ .细胞计数: 共取只不同小鼠肾脏切片,个高倍镜视野,计数肾乳头范围的各类细 胞占所有细胞比例,并取平均值个细胞。?细胞占.%, 与第一部分计数类似。占.%,?/仅占所有细胞的 .%,占?细胞的%。图. .在肾脏的分布: 和肾小管各节段标记物免疫荧光共染,发现也分布在、 和性的小管上,即散在分布在集合管和髓袢各段。图. ? .中在肾脏的分布: 、和肾小管各节段标记物三色免疫荧光共染,标示?细胞 中的在肾小管的分布,同样分布在在、、和性的 小管上,即散在分布在集合管和髓袢各段。图.复旦大学博士研究生论文? 和肾小管各节段标记物免疫荧光共染×。分布在 图. 、和阳性的小管上。如白色箭头所示 。。。。。。。。。。‘。。 ????,,。。’。。。。。。’。?。‘。。。。 // // /// ? ??.?????????一????????????‘‘。。。。。。。。。一 图. 、和肾小管各节段标记物三色免疫荧光共染。 ?和双阳性的细胞同样散在分布在、、和 阳性的小管上。如白色箭头所示 ?