黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒使用说明书

黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒使用说明书 ????? 黄 曲 霉 毒 素 B1 酶 联 免 疫 检 测 试 剂 盒 使 用 说 明 书 ?(样品处理方法 一、 食品 1、脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)称取5.0g样品(已粉碎)于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，根据样品的国家允许量，用A试剂将滤液进行稀释(见1:样品稀释表)。将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、 酱油、醋 称取5.0g样品于25ml小烧杯中，用5ml蒸馏水将试样转移到125ml分液漏斗中， 加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛 有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水NaSO过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三24 氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量 三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65?水浴通风挥干。挥干冷却后，准确 加入25.0ml甲醇水(1+1)，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许 量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1:样品稀释表)。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 3、 食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等) 称5.0g油样于25ml小烧杯中，用20ml石油醚或正乙烷分次将试样转移至125ml 分液漏斗中，准确加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液，加塞轻轻振摇5min，静置分层， 放出下层甲醇水提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释 (见表1:样品稀释表)。将样品稀释液进行定量或限量测定。 4、葡萄酒 准备称取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的的无水NaSO24过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65?水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水(1+1)，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1:样品稀释表)。将样品稀释液进行定量或限量测定。 5、啤酒、黄酒 准确吸取5.0ml样品于25ml容量瓶，准确加入12.5ml甲醇，再用蒸馏水定容至25ml。振摇10min，此即为待测样品液。将待测样品稀释液进行定量或限量测定。 若结果为阳性，则采用葡萄酒中AFB的提取方法进行测定。 1 6、花生 样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水(1+1)和20ml正乙烷(或石油醚)，振摇10min，过滤于分液漏斗中，静置分层。放出下层提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1: 样品稀释表)。将样品稀释液进行定量过限量测定。 7、月饼、桃酥、花生酱等 称取10.0g试样于125ml具塞锥形瓶中，加入50.0ml甲醇水(1+1)提取液和20ml正乙烷(或石油醚)加塞震荡15min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一锥形瓶中。准备吸取10.0ml甲醇水提取液(相当2.0g样品)于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水 SO过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，Na24 三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65?水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水(1+1)，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1:样品稀释表)。将样品稀释液进行定量或限量测定。 8、面粉 称取10.0g面粉样于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水(1+1)溶液， 震荡15min ,过滤，收集试样滤液。准确吸取10.0ml滤液(相当于2.0g样品)125ml 分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷层，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三 氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水NaSO过滤器于100ml蒸发皿24 中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿 中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65?水浴通风挥干。 挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水(1+1)，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根 据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1:样品稀释表)。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 二、 饲料 1、一般饲料及原料 称取5.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液，振荡 15min，过滤，弃去初滤液。收集滤液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将 滤液进行稀释(见表1:样品稀释表)。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、饲料浓缩料 称取10.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水(1+1)溶液，振 荡15min,过滤，收集试样过滤。 准备吸取10.0ml甲醇水提取液(相当2.0g样品)于125ml分液漏斗中，加入20ml 三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。 放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水NaSO过滤器于24 100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一 并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65?水浴 通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水(1+1)，将蒸发皿中的凝结物充 分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释(见表1:样品 稀释表)。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 二、 样品稀释表 表1 样品稀释表 样品允许量(µg/kg) 样品提取液(ml) A试剂(ml) 样品稀释倍数(D) ?5 直接量取 0 1 ?10 0.1 0.1 2 ?15 0.05 0.2 3 ?20 0.05 0.15 4 ?30 0.05 0.25 6 ?50 0.05 0.45 10 ?.黄曲霉毒素B测试盒使用说明书 1 (定量检测) 本测试盒利用固相酶联免疫吸附(ELISE)原理，通过抗黄曲霉毒素B抗体与酶标抗原、1待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测AFB，适用于食品、饲料及1相关原料中AFB的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。 1 一、测试盒组成 1、包被抗体的反应板: 48/24/12孔 2、A试剂:样品稀释液 1瓶 3、B试剂:AFB标准溶液 1套 1 4、C试剂:酶标抗原 2/1瓶 5、D试剂:酶标抗原稀释液 1瓶 6、E试剂:浓缩洗涤液 1瓶 7、F试剂:显色底物液a 1瓶 8、G试剂:显色底物液b 1瓶 9、H试剂:终止液 1瓶 10、反应板支架: 1块 二、实验准备 1、 样品处理:详见“?.样品处理方法” 2、 试剂的配制 ?每瓶C试剂中准确加入1.5ml D试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8? 保存。 ?E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。 三、实验步骤 1、 试剂平衡:将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。 2、 小孔编号:根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔， 2号孔为阴性孔，3-7号孔为AFB标准对照孔，其余孔为样品孔。 1 3、 洗涤:每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min后 甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 4、反应物组成:按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。 第一步:1号孔和2号孔分别加入50µl A试剂，3-7号控分别加入系列浓度的B试剂(0.1，0.25，0.5,1，2μg/l)50µl,其余孔分别加入相应的样品稀释液。 第二步:1号孔加入50µlD试剂，其余各孔均加入50µlC试剂。 第三步:轻轻地振摇，使各孔的反应物混匀。 表2 反应物组成表 操作次序 加入量 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 50µl A 0 0.1 0.25 0.5 1 2 样 品 稀 释 液 2 50µl D C C C C C C C C C C 3 摇匀 5、反应:将反应板放入37? 恒温培养箱中孵育30min。 6、洗涤:取出反应板，用力甩掉反应液，拍手。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。 7、显色:每孔分别加入显色低物液a(F试剂)和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将 反应板放入37? 恒温培养箱中显色15min。 8、终止与仪器测定:每孔分别加入终止液(H试剂)50µl，然后用酶测定仪(或黄曲霉毒 专用测定仪)在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。 素B1 9、定量测定: 将浓度为0，0.1，0.25，0.5，1，2ppb的AFB系列标准工作溶液，按上述实验步骤测定相1应的吸光度A值，并绘制成标准曲线(见图一)。 横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)，纵坐标为各标准液孔A值与标准液为0ng/ml的 A值的比值(A/A)。 标准液(0ng/ml) 计算样品孔A值与A(A/A)，查标准线，可得到相应样品稀释浓度(C)的常样品(0ng/ml)(0ng/ml) 用对数值lgC，对其求反对数，可求得样品稀释液的AFB浓度C。按下列公式计算出样品1中AFB的含量: 1 AFB含量(ng/g)=C×(V/M)×D 1 式中:C:稀释后样品提取液中AFB含量(ng/ml) 1 V:样品提取液体积(ml) M:样品质量(g) D:样品稀释倍数 也可以采用酶标数据处理软件进行计算，这样更方便～ 四、测试盒贮存 1、2-8?贮存，忌0?以下冻存。 2、有效期6个月。 五、样品允许量标准请参阅(GB2671-81，GB8381-87) 六、批号:见测试盒 ?. 黄曲霉毒素B测试盒使用说明书 1 (限量检测) 一、测试盒组成 1、 包被抗体的反应板: 48/24/12孔 2、 A试剂:样品稀释液 1瓶 3、 B试剂:AFB标准溶液 1瓶 1 4、 C试剂:酶标抗原 2/1瓶 5、 D试剂:酶标抗原稀释液 1瓶 6、 E试剂:浓缩洗涤液 1瓶 7、 F试剂:显色底物液a 1瓶 8、 G试剂:显色底物液b 1瓶 9、 H试剂:终止液 1瓶 10、反应板支架: 1块 二、实验准备 1、 样品处理:祥见“?.样品处理方法” 2、 试剂的配制 (1) 每瓶C试剂中准确加入1.5ml试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8?保存。 (2) E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。 三、 实验步骤 1、 试剂平衡:将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。 2、 小孔编号:根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔， 2号孔为阴性对照孔，3号孔为阳性对照孔，其余孔为样品孔。 3、 洗涤:每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min 后，甩掉洗液，在 吸水纸上拍干，重复洗板一次。 4、反应物组成:按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及 待测样品稀释液。 第1步:1号孔和2号孔分别加入50µl A试剂，3号孔加入50µl B 试剂，其余孔加入相应的样品稀释液。 第2步:1号孔加入50µl D试剂，其余各孔均加入50µl C试剂。 第3步:轻轻地振摇，使各孔中的反应物混匀。 表3 反应物组成表 操作次序 加入量 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 50µl A A B….………样品稀释液…………………….. 2 50µl l D C C C C C C C C C C C 3 摇匀 5、反应:将反应板放入37? 恒温培养箱中孵育30min。 6、洗涤:取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。 7、显色:每孔分别加入显色低物液a(F试剂)和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37? 恒温培养箱中显色15min，目视法测定。(注:可适当延长显色时间，使颜 色加深，以利目视。) 8、限量判断 1) 目视法测定:先比较1-3号孔颜色。若2号孔(阴性孔)颜色最深，3号孔(阳性孔) 次之，1号孔(空白孔)接近无色， 说明试剂有效及操作无误。比较样品孔与3号孔(阳性孔)颜色，若浅者，则为阳性， 若深者，则为阴性，若颜色接近，则用仪器法或国标法验证。 专2) 仪器法测定:每孔分别加入终止液(H试剂)50µl,然后用酶测定仪(或黄曲霉素B1 用测定仪)在450nm波长处测定各孔的吸光度A值，若A〈A为阳性，若A样品孔阳性孔样品孔 ?A为阴性. 阳性孔 若样品显阳性,则其AFB含量可判断为: 1 AFB含量(ng/g),l.0 ng/ml×(V/M×D) 1 V:样品提取液体积(ml) M:样品质量(g) D:样品稀释倍数 四、测试盒贮存 1、2-8?贮存，忌0?以下冻存。 2、有效期6个月。 五、样品允许量标准请参阅(GB2671-81，GB8381-87) 六、批号:见测试盒 ?.实验操作流程图及注意事项 ? 实验操作流程图 适当稀释 加样 37?，30min 样品提取———?试剂准备———?免疫反应————? 37?，15min 目测、仪器测量 显色反应————?结果判定—————?计算含量 ? 注意事项 1、 洗涤时要迅速，洗涤液不可溢出，以防交叉污染; 2、 加样时要准确，直接加到小孔底部，不可有气泡，不要加到孔壁上; 3、 试剂使用前摇匀; 4、 整个加样过程要快，保证前后反应时间一致; 5、 加样后要轻请震摇整板，使反应液混匀; 6、 每次洗涤要先用力甩干后再拍干，最后要擦干板底，以利于仪器检测; 7、 不同批次测试盒的试剂不能混用; 8、 每次测试时应尽量使用新配制的洗涤液; 9、 虽AFB标准浓度很低，但是严格的实验操作不可忽视，凡接触到标样的器皿都要1 用5%NaCIO浸泡半天后再清洗备用。 ?. 主要技术指标及参数 测试盒分三种规格:12孔、24孔、48孔。反应孔可拆卸，可测单份样品，亦可测多份样 品，定量测定每次需要6个标准孔，若半定量测定只需3个标准孔。 测试盒的主要技术指标及参数: 1、 最低检出浓度:0.1ng/ml; 2、 回收率:87%-95%; 3、 交叉反应系数:0-0.21; 4、 检测范围:0.1-10ng/ml; 5、 重复性:条内,10%，条间,15%。 ?.实验室基本配置 1、 酶标仪(内置450nm滤光片)或黄曲霉素B专用测定仪 1 2、 50ul微量移液器及配套吸头 3、 恒温培养箱(0?-50?) 4、 冰箱(4?-8?) 5、 感量0.01g的天平 6、 玻璃器皿:锥形瓶，烧杯，分液漏斗，蒸发皿。量筒，具塞试管，滴管，移液管等 7、 小型粉碎机或碾钵 8、 其他:滤纸，吸水纸等 ?.相关文献 (1) 饲料中黄曲霉毒素B的测定方法(GB/T17480-1998) 1 (2) 食品中黄曲霉毒素B的测定方法(GB/T5009.22-1996)，食品卫生标准使用手1 册理化检验方法[M]，1998(第一辑);137-161。 (3) 国家质量监督检验检疫总局。关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则 的。国质检监[2002]192号.2002.7.21 (4) 晓黎等.黄曲霉毒素分析方法研究进展[J].粮食与饲料工业，1994，10:41-43. 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