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agesrage轴调控wntβ-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化

2017-12-08 14页 doc 39KB 21阅读

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agesrage轴调控wntβ-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化agesrage轴调控wntβ-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化 AGEs/RAGE轴调控wnt/β-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化 摘要目的:探讨RAGE 是否具有促进动脉平滑肌细胞钙化的功能,明确RAGE与wnt/β-catenin 信号通路的关系,探讨RAGE与人动脉平滑肌细胞向成骨性细胞转化的潜在关系。方法:(1)通过慢病毒颗粒载体介导的RAGE ORF感染细胞,以建立稳定高表达RAGE蛋白的细胞模型。绿荧光蛋白表达、流式细胞技术及免疫印迹法检测验证细胞稳定高表达RAGE 蛋白。(2)将正常条件下...
agesrage轴调控wntβ-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化
agesrage轴调控wntβ-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化 AGEs/RAGE轴调控wnt/β-catenin促进人主动脉平滑肌细胞钙化 摘要目的:探讨RAGE 是否具有促进动脉平滑肌细胞钙化的功能,明确RAGE与wnt/β-catenin 信号通路的关系,探讨RAGE与人动脉平滑肌细胞向成骨性细胞转化的潜在关系。方法:(1)通过慢病毒颗粒载体介导的RAGE ORF感染细胞,以建立稳定高达RAGE蛋白的细胞模型。绿荧光蛋白表达、流式细胞技术及免疫印迹法检测验证细胞稳定高表达RAGE 蛋白。(2)将正常条件下培养的人主动脉平滑肌细胞作为空白对照组,分为空白对照组、未转染慢病毒组,空载体慢病毒转染组、携带RAGE慢病毒转染组,对未转染慢病毒组,空载体慢病毒转染组、携带RAGE慢病毒转染组分别以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下对各组人主动脉平滑肌细胞进行干预培养,倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况及钙化情况,第10天时对各组细胞进行冯库萨染色和钙定量检测。(3)将正常条件下培养的人主动脉平滑肌细胞作为空白对照组,分为空白对照组、空载体慢病毒转染组、RAGE高表达细胞组,分别以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下对各组人主动脉平滑肌细胞进行干预培养,利用western blotting检测干预前和干预后各组细胞与成骨相关蛋白的表达情况。(4)利用小分子干扰RNA对细胞β-catenin的表达进行干扰,从而获得β-catenin低表达细胞模型。仍然以正常条件下培养的人主动脉平滑肌细胞为空白对照组,将实验分为空白对照组、RAGE高表达细胞干预培养组、对照siRNA组以及β-catenin siRNA抑制组,对经β-catenin si RNA处理过的细胞组 进行干预培养。利用蛋白印迹技术对各组细胞OPG、cabfa1的表达进 行检测。结果:(1)绿荧光蛋白表达、流式细胞技术及免疫印迹法检 测结果证实RAGE高表达人主动脉平滑肌细胞模型成功建立。(2)与 空白对照组、未转染慢病毒组,空载体慢病毒转染组相比,在钙化 +AGEs干预培养下,携带RAGE慢病毒转染组的钙化程度增强。(3) 空白对照组、空载体慢病毒转染组、RAGE高表达细胞组三组细胞在 进行干预培养后,RAGE、β-catenin、OPG、cabfa1蛋白表达较未干 预均增强,其中RAGE高表达组细胞中上述因子的表达远强于其他各 组。(4)与RAGE高表达细胞组和对照siRNA细胞组相比,β-catenin siRNA抑制组细胞经β-catenin siRNA处理后再进行干预培养,发现 其下游基因cabfa1和OPG的表达明显受到了抑制。结论:1.RAGE高 表达促进VSMCs钙化,同时促进了β-catenin、OPG、cabfa1等下游 基因的表达;2.RAGE可能是通过Wntβ-catenin途径,启动其下游 因子,而促进血管平滑肌细胞成骨转化,从而进一步导致钙化增加; 3.RAGE引起的OPG、cabfa1表达增强,钙化增加,可被β-catenin siRNA所抑制。关键词:AGE(糖基化终末产物);β-catenin(β- 连环蛋白);动脉中膜钙化;血管平滑肌细胞AGEs/RAGE mediate wnt/beta-catenin signaling to promote human aortic smooth muscle cells calcification in diabetes mellitus Abstract : Objective : 1.To investigate whether the RAGE has the function to promote arterial smooth muscle cells calcification;2.To find out the relationship between RAGE and wnt/β-catenin signaling pathway ; 3.To study whether the RAGE contribute to the course of smooth muscle cell phenotypic transform into osteoblast.Methods:(1)We took the lentiviral transfection technique to establish human VSMC model which can over express RAGE steadily.And the results were test by green fluorescent protein,flow cytometry,and western blotting.(2)We divided this group into blank control group,non-transfection group,empty vector transfection group and RAGE-lentiviral transfection group.Cells of blank control group were cultivated in a normol condition.Cells of non-transfection group,empty vector transfection group and RAGE-lentiviral transfection group were cultivated in a condition of 20mmg/L AGEs ,10mmol/L sodium β-glycerophosphate and pyruvic acid .The calcification of human aortic smooth muscle cells was observed under inverted phase contrast microscope .10 days later,we dealt the cells with von kossa staining and quantitative analysis of calcium.(3)We divided this group into blank control group,empty vector transfection group and RAGE overexpression group .Cells of blank control group were cultivated in a normol condition .Cells of non-transfection group,empty vector transfection group and RAGE-lentiviral transfection group were cultivated in a condition of 20mmg/L AGEs ,10mmol/L sodium β-glycerophosphate and pyruvic acid .After that we detected the factors associated with VSMC calcification by western blotting.(4)In order to inhibit the expression of β-catenin, β-catenin siRNA was used.This part of our experiment was divided into blank control group,RAGE overexpression group ,siRNA control group and β-catenin siRNA inhibiting group.Cells of blank control group were cultivated in a normol condition .Cells dealt with β-catenin siRNA were cultivated in a condition of 20mmg/L AGEs , 10mmol/L sodium β-glycerophosphate and pyruvic acid.The expression of OPG and cabfa1 was test by western blotting.Results:The test results of green fluorescent protein,flow cytometry,and western blotting prove that the human VSMC model which can over express RAGE was established successfully.(2)Compared with blank control group ,non-transfection group and empty vector transfection control group,the calcification of cells in RAGE-lentiviral transfection group was enhanced when training with AGEs ,sodium β-glycerophosphate and pyruvic acid.(3)When training with AGEs ,sodium β-glycerophosphate and pyruvic acid,the expression of RAGE 、β-catenin、cabfa1 、OPG in blank control group,empty vector transfection control group and RAGE overexpression group was enhanced.In addition,the expression of those factors in RAGE overexpression group was much stronger than that in other groups.(4)Compared with RAGE overexpression group and siRNA control group, the expression of downstream gene cabfa1 and OPG inβ-catenin siRNA inhibiting group was obvious suppressed.Conclusion:1.The overexpression of RAGE can promote VSMC calcification ,when enhance the expression ofβ-catenin、OPG、 cabfa1.2.RAGE may active the downstream signal factors through wnt/β-catenin signal path,then accelerate the transformation of smooth muscle cell phenotypic into osteoblast,and finally enhance the calcification .3.The course of RAGE enhancing the expression of OPG and cabfa1,can be restrained by β-catenin siRNA. Keywords :AGE;β-catenin;arterial medial calcification;VSMC前言糖尿病现今已位于危害公众健康的非感染性疾病的第三位,据目前统计,当今已有3.71亿糖尿病患者,预计到2030年时糖尿病患者总数将突破4.35亿。心血管疾病在糖尿病血管钙化患者中发生的危险性较不伴有血管钙化的糖尿病患者增加了2 - 4倍, 是糖尿病患者死亡的首要原因。糖尿病致残、致死率高,不论是对个人、家庭还是社会都是沉重的负担,因此对糖尿病的防治已经成为当今医学的一个重大研究课。不论是2 型糖尿病或是l 型糖尿病,均可导致动脉中膜钙化(MAC),由于MAC 与内膜钙化不同,它并不造成动脉腔闭塞, [1]因此过去一直被认为缺乏临床意义。Lehto 等对1059 例糖尿病患者(其中合并MAC 者439 例)进行的7 年随访结果却表明,MAC 是预测糖尿病患者未来发生心血管事件的强有力的标志,该研究发现:糖尿病并MAC 患者,血糖和糖化血红蛋白明显高于无MAC 者,其总死亡率也明显高于无MAC 者(38.0% vs 22.3%; P<.001),其中心血管疾病死亡率(26.9% vs 14.5%; P<.001),冠心病死亡率(20.3% vs11.1%;P<.001),中风死亡率(4.6% vs 2.3%; P<.05)均高于无MAC 者。同时此类患者心血管病事件发生率(30.1% vs 20.0%; P<.001) ,中风发生率(14.6% vs 9.8%; P<.05),下肢截肢率(9.2% vs 3.1%; P<.001)相对于无MAC患者都明显增高。不仅如此,MAC 与糖尿病的许多其他并发症也是密切相关的,比如MAC 常常关系到糖尿病远端 对称性神经病变的程度,MAC 的发病率与血肌酐水平的上升有着显著的关系,因此糖尿病肾病患者中动脉钙化的发生明显增多,此外,MAC 与糖尿病视网膜病变也明显相关。动脉钙化是指钙盐沉积在动脉壁组织的一种病理改变,是动脉粥样硬化、高血压、肾病性病变、糖尿病及血管损伤等疾病的共同病理过程。当动脉钙化发生时,钙会以磷酸钙的形式沉积在脉管系统而降低主动脉和支动脉的弹回率,从而改变心血管系统的血流动力学,导致高血压、主动脉瓣狭窄、心脏肥厚、 [2-4]心肌和下肢缺血、充血性心力衰竭,最终死亡率上升。当今研究 [5]表明,动脉钙化是一个主动的细胞调控过程,激素、酶、细胞因子及蛋白质等许多因素都参与了这一过程的调节,但其发生、发展的确切机制仍不清楚。按照钙化发生部位的不同,动脉钙化分为内膜钙化和中膜钙化。内膜钙化与动脉粥样硬化密切相关,冠状动脉钙化多属此型。其形态学主要表现为钙化分布不均匀,呈散在分布。血管平滑肌细胞(VSMC)、肥大细胞及巨噬细胞等炎症细胞,为参与内膜钙化的主要细胞,并且与脂质相关。动脉中膜钙化(MAC)又称Mönckeberg 中膜硬化,是指原因不明的变质性疾病,多发生于糖尿病和尿毒症等疾病,其特点是动脉中膜发生营养不良性钙化。钙化开始于内弹性膜间隙区,然后扩展至中膜,钙化沉积呈连续性分布,该过程的主要参与细胞为VSMC,而弹力纤维等组织可能也参与了钙化。动脉中膜钙化是糖尿病、慢性肾功能衰竭及动脉粥样硬化症等疾病的共同病理过程,现在认为动脉中膜钙化形成的早期过程是一个与骨发育相似的可预防、可逆转、高度可调控的主动生物学过程。动脉中膜钙化发生的中心环节是血管平滑肌细胞(VSMC)向成骨样细胞的转分化,VSMC 在 诱导条件下可转变为成骨样细胞,并合成和分泌多种骨形成蛋白。因此,成骨细胞的诱导、抑制钙化的相关因子缺失都可导致动脉中膜钙化。目前研究表明,AGEs/RAGE轴以及wnt/β-catenin信号通路都与VSMC 的表型转化、动脉中膜钙化过程有着密切的联系,但其具体分子途径尚待我们继续探究。由于动脉中膜钙化的发病原因及其发病机制仍不甚清楚,与糖尿病之间的相互关系,在糖尿病患者肢体血管病变中的重要位置,还不为人们所熟知,因此如今在临床上对于治疗因血管钙化而引起的视网膜、肾脏病变及下肢缺血坏死、动脉硬化等并发症时,无论是药物还是手术治疗都有一定局限性,缺乏有效的治疗方法。因此,探讨RAGE 是否具有促进动脉平滑肌细胞钙化的功能,RAGE与wnt/β-catenin 信号通路的相互作用,以及RAGE是否促进了平滑肌细胞向成骨性细胞的转化,将有利于进一步明确动脉中膜钙化的分子机制,为糖尿病动脉中膜钙化早期预防及治疗提供新的思路。 本研究利用慢病毒转染技术建立RAGE过表达VSMCs模型,与空白对照组、空载体病毒转染组在钙化+AGE干预下进行培养,利用蛋白印迹、流式细胞、冯库萨染色等技术,检测与wnt/β-catenin 信号通路及成骨相关因子的表达及细胞钙化水平,初步探讨RAGE 是否具有促进动脉平滑肌细胞钙化的作用,以及与平滑肌细胞向成骨表型转化的潜在关系。接着用si RNA 对β-catenin 的表达进行沉默,从而进一步明确RAGE与wnt/β-catenin 信号通路的相互作用。材料与方法1 实验材料与仪器1.1 实验动物由中山大学附属医院血管外科王冕博士提供的健康人主动脉,取动脉中膜平滑肌细胞进行传代培 养。取其3-8代细胞进行实验。1.2 主要实验试剂DMEM高糖培养基 Hyclone胎牛血清 HycloneDMSO 武汉碧云天双抗 武汉碧云天0.25%胰蛋白酶 武汉碧云天 β-磷酸甘油钠 Sigma公司美国丙酮酸 Sigma公司美国嘌呤霉素Sigma公司美国聚凝胺 Sigma公司美国AGE-BSA日本Biovision公司细胞钙离子测定试剂盒 上海杰美蛋白提取试剂盒 武汉碧云天慢病毒颗粒 广州复能基因公司SDS-PAGE蛋白上样缓冲液武汉碧云天Marker Bio-Rad美国一抗RAGE、β-catenin、OPG、Cbfa1 CST 美国二抗 武汉碧云天β-catenin的siRNA 广州复能基因上样缓冲液武汉碧云天一抗二抗稀释液 武汉碧云天超敏ECL化学发光试剂盒武汉碧云天Von Kossa染色试剂盒 1.3 主要实验仪器C02细胞培养敷箱 Thermo美国倒置相差显微镜 Leica,Germany生物安全柜 新加坡艺思高-80?超低温冰箱 Thermo美国低温高速离心机 Bio-Rad公司,美国超声细胞破碎仪 美国BRANSON流式细胞仪 Epics XL BECKMAN Coulter电热水浴恒温箱 哈尔滨东明医疗仪器厂低温冷冻离心机Sigma 美国台式高速离心机 Eppendorf公司 德国液氮细胞冻存罐Thermo Electron可调式微量移液加样枪 Eppendorf公司 德国电子天平 CP323S型 德国摇床 Biometra 德国磁力搅拌器江苏太仓华美生化仪器厂37?恒温水浴箱 哈尔滨东明医疗仪器厂-20?低温冰箱日本三菱分光光度计 Leica,GermanyPVDF膜 Millipore 美国 EP管 Axygen 美国无酶Tip头 Axygen 美国冻存管Corning 美国蛋白电泳及转膜仪Bio-Pad,美国蛋白成像仪 Bio-Rad,美国超净工作台苏州净化设备集团公司倒置荧 光显微镜 Leica,Germany1.4 实验所需试剂的制备方法1.4.1 正常人主动脉平滑肌细胞培养液 取胎牛血清和DMEM高糖培养基按1:9的比例混合至100ml,最后加入1ml的双抗液,密封,置于4?冰箱保存。1.4.2 细胞冻存液取胎牛血清和二甲基亚砜按9:1的比例混合,需即时配置。1.4.3 PBS缓冲液 电子天平精确称取磷酸二氢钾(KHPO)0.27g,磷酸氢二钠(NaHPO)1.42g,氯化钠(NaCl)8g,2424 氯化钾(KCl)0.2g,加入双蒸水800mL,待其充分溶解后,缓慢加入浓盐酸调整pH至7.4,定容到1L。高温高压消毒灭菌后分装、密封,置于4?冰箱保存。 1.4.4 Western-blot所需试剂 (1)1 mol/L Tris (PH6.8)100ml:取Tris 24.2g,ddHO 50ml,以浓盐酸调节2 PH值至6.8,去离子水定容至100ml,置于室温保存。 (2)1.5mol/L Tris (PH8.8)100ml:取Tris 36.3g,ddHO 50ml,以浓盐酸调节2 PH值至8.8,去离子水定容至100ml,置于室温保存。(3)30,SDS:取SDS 10g,800ml去离子水于68?下溶解,以浓盐酸调节pH值至7.2,去离子水定容至100ml,置于室温下保存。 (4)30,丙稀酰胺100ml:取丙烯酰胺29g,双丙烯酰胺1g,加入60ml去离子水,定容至100ml,置于4?下保存。(5)封闭液50ml:取1XTBST 50ml,加入5%脱脂奶粉2.5g。(6)10%过硫酸铵:取过硫酸铵1g,10ml去离子水溶解,置于4?下保存。 (7)1X电泳缓冲液:取甘氨酸30g,Tris-base 6.06g,SDS 1.0g,以去离子水定容至2L,置于室温保存。 (8)1X转膜液:取甘氨酸30g,Tris-base 6.06g,CHOH 400ml,3以去离子水定容至2L,置于室温下保存。2 实验方法2.1人主动脉 平滑肌细胞的培养 2.1.1细胞复苏:将水浴箱温度升至37"C,然后从-80?冰箱中拿出冻存管,快速放入37?水浴中轻缓晃动,使其在1分钟内快速融化,用75,酒精消毒冻存管,放入事先已紫外线消毒1小时的超净台内,打开管盖,用吸管将细胞悬液移入离心管中,再补加8ml培养液,轻柔吹打细胞使之分散悬浮。800转,分低速离心5分钟后弃上清。加入培养液进行适当稀释,吹打均匀后,移入培养瓶中,置孵化箱培养,次日更换培养液后继续培养。 2.1.2人主动脉平滑肌细胞的传代培养 :待细胞长满瓶壁后,吸尽培养液,PBS洗涤细胞,然后向培养瓶中加入胰酶约2 m1。在室温下将培养瓶置于倒置相差显徽镜下观察(应注意避免污染细胞)。当细胞回缩、细胞间隙增大时,迅速用胎牛血清终止消化,轻轻转动培养瓶,吸去残余消化液 。加入适量培养液 ,用吸管轻轻反复吹打培养瓶贴壁面,使细胞脱落瓶壁分散,形成细胞悬液,再根据实际需要分装接种入培养瓶,加入适量培养液。细胞密度应保持在( 1,5 )×10个,ml。3天更换一次培养液。 2.1.3 VSMCs冻存:冻存前1天应更换一次培养液。冻存前先进行细胞计数。按照前面细胞传代培养的方法,收 ×6集第4代刚融合的细胞(4,5)×l0个,l000 r,min离心5分钟,弃上清液,加入1.8 mL事先用胎牛血清配制好的浓度为10,的二甲基亚砜,迅速吹打均匀,然后用吸管将细胞悬液移至冻存管,封口胶仔细密封,依次置于4?、-20?、-80?放置20分钟、2小时,过夜,最后浸入液氮罐冻存并长期保存。 2.1.4 细胞计数、成活率检测及细胞鉴定: 细胞计数: (1)将专用细胞计数板及盖玻片擦拭干 净,并将盖玻片盖上计数板。 (2)吸出吹打均匀的细胞悬液少许,滴加于盖玻片边缘,使悬液充满计数板和盖玻片之间,静置3分钟,注意不能让悬液流入旁边槽中,也不能让盖玻片下有气泡。 (3)显微镜下统计计数板四大格细胞总数,压线细胞则只计左侧和上方的。 4然后根据公式:细胞数/mL=四大格细胞总数/4×10,计算细胞数量。(4)注意:因为计数了4个大格的细胞数,因此公式中需除以4。而计数板中每一个大格的体积为:1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm 3 34(高)=0.1mm而 1ml=1000mm,故公式中需乘以10。显微镜下偶尔见到有两个以上细胞组成的细胞团,则应计为单个细胞,若细胞团高达10%以上,说明细胞分散不均匀,需重新制备细胞悬液后再计数。 细胞成活率检测:取消化传代的细胞悬液9ml,加人1m1 0.4%台盼蓝液,混匀后吸取一滴于细胞计数器上,倒置相差显微镜下观察,若有着色细胞则为不正常细胞或死亡细胞,根据细胞计数结果计算成活率。形态学观察:常规倒置相差显微镜下观察培养细胞呈梭形或多角形,细胞生长融合后,细胞间平行排列呈放射状或成束状,具备平滑肌细胞生长的“波峰一波谷”状排列特征。2.2 稳定的RAGE高表达细胞模型的建立及检测:利用慢病毒颗粒载体介导的RAGE ORF感染细胞,建立稳定高表达RAGE的细胞模型。绿荧光蛋白及免疫印迹法检测验证细胞稳定高表达RAGE 蛋白。 RAGE由广州复能基因公司提供。NCBI上查找基因序列GenBank: AY755619.1, ORF1215bp,CDS编码区如下 :慢病毒颗粒转染人主动脉平滑肌细胞。实验前查阅相关,找到人平滑肌细胞MOI值为100,并根据MOI值和细胞数量 计算出所需要的病毒量,以及病毒和培养基的稀释比例,确保所配制的含慢病毒颗粒的培养基的总体积为最小体积,以期获得最佳的感染效率。(1)准备细胞:在24孔培养板接种血管平滑肌细胞,每个孔 4内接种3X10个,铺板时细胞的融合度约为50%,每孔培养基体积为100μl;进行病毒感染时细胞的融合率应达到70%左右。 (2)将慢病毒颗粒从-80?超低温冰箱中取出,并置于冰上融化,l000 r,min离心机离心20秒,使病毒完全沉于管底,将病毒液全部移至离心管,按照使其按计算好的值稀释病毒液。病毒准备好之后,从培养箱中拿出培养的动脉平滑肌细胞,先观察其生长情况,若细胞生长状态较好则开始转染。(3)吸去培养板中的培养基;(4)在目的细胞孔中加入计算好的含病毒的培养基,同时加入8µg/mL 的polybrene;(5)轻 2轻震荡培养板使其均匀混合,放入CO培养箱(37?、5%CO2)孵育。(6)8-12 小时以后观察细胞情况,弃去培养液,更换新鲜培养基。慢病毒载体上带有GFP 绿色荧光蛋白,当病毒成功转染宿主细胞后就会表达绿荧光蛋白,病毒感染96小时后利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,以明确病毒对目的细胞的感染情况;转染成功的人主动脉平滑肌细胞能够表达抗嘌呤霉素基因,利用4μg/ml筛选浓度的嘌呤霉素进行筛选培养,倒置荧光显微镜下观察GFP 表达,当GFP表达率大于90%时,采用免疫印迹法检测RAGE蛋白的表达。2.3 嘌呤霉素的浓度梯度筛选 (1)将人主动脉平滑肌细胞接种于24孔板内, 4 密度为5 x 10cells/孔;(2)准备含不同筛选浓度嘌呤霉素的新鲜培养基,浓度依次为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、 10μg/ml;(3)向分好组的24孔板中依次加入各组浓度的培养基; (4)2天更换一次新鲜的筛选培养基;(5)每天在显微镜下观察各组血管平滑肌细胞的生长及凋亡情况;(6)选择能在3-5天内使所有细胞凋亡的最小浓度为最优筛选浓度,其一半浓度为维持浓度。2.4 糖尿病钙化模型的建立 前期实验结果显示血管平滑肌细胞在AGEs+钙化培养条件下其钙化明显高于单纯钙化培养,因此选择在10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE作用下对各组人主动脉平滑肌细胞进行干预培养8-10天,以期获得糖尿病钙化模型。2.5 RAGE、β-catenin、cbfa1、OPG、ALP因子的蛋白印迹技术检测 2.5.1 人主动脉平滑肌细胞蛋白提取 (1)准备细胞,弃培养液,预冷PBS浸泡、清洗三次 (2)将细胞置于冰上操作,倒掉PBS,加蛋白裂解液和抗胰蛋白酶,于4?冰箱15分钟,研磨细胞使之充分脱落裂解,收集细胞裂解液于Eppendorf管,封口后置于4?冰箱过夜。 (3)次日超声裂解,于离心机14000转/分,5分钟,取上清液,按上清液:缓冲液=4:1比例向上清液加入上样缓冲液,吹打均匀、封口,于100?沸水浴8分钟后置于-20?保存。2.5.2 western blotting (1)制备电泳凝胶;(2)上样及电泳:将电泳槽内注满1×电泳缓冲液,彻底除去点样孔中和胶底的气泡。两边空白的泳道点上等量的 Sample Buffer ,向电泳外槽内注入1×电泳缓冲液,关上盖子,电泳开始时电压为80V,染料进入分离胶后,将电压维持到120V,稳压,当染料达到分离胶底部约80分钟时,将电源断开; (3)转膜:剪大小与胶体相同的六块滤纸和一块PVDF膜,预先将滤纸在转移缓冲 液中浸泡5分钟,除去气泡。凝胶电泳完成后将其取出,按照海绵?3块滤纸?凝胶?PVDF膜?另外3块滤纸?海绵的顺序依次放,注意不要有气泡。用塑料支架夹紧上述各层,放入转移内槽及外槽,加入用冰预冷的转移缓冲液。注意PVDF膜一侧靠近正极,胶一侧靠近负极。4?,200mA稳流下转移1.5小时;(4)转移完成后,取出膜放在滤纸上,标好正面,室温干燥数分钟。用脱脂奶粉封闭PVDF膜,室温下振荡1小时后4?过夜(PVDF膜正面向上);一抗用封闭液配制,室温下振摇2小时(PVDF膜正面向上),以TBS-T洗膜3次,每次5-10分钟;二抗以TBS-T稀释(按1:600配制),于室温下振摇孵育1.5小时(PVDF膜正面向上),用TBS-T洗膜3次,每次5-10分钟;显色:辣根过氧化物酶显色,在试管中先加入1ml×HRP反应缓冲液,然后依次加入试剂A500µl、试剂B500µl、C500µl混匀即可。 避光存放配制好的溶液,并且应在半小时内使用,染色为褐色。室温下染色时间为5,30min,染色时间由颜色变化而定。待目的条带显色以后,用少量PBS进行清洗,再将胶片进行扫描、拍照,最后用凝胶图象处理系统(Quantity One)分析目标带的分子量和净光密度值。2.6 流式细胞技术测定转染慢病毒颗粒后的人主动脉平滑肌细胞表达绿荧光蛋白的情况 (1)将培养的携带RAGE慢病毒转染组、空载体慢病毒转染组以及空白对照组人主动脉平滑肌细胞吸去培养液,以PBS洗涤2次。(2)胰酶消化后,加入适量培养液 ,以无菌吸管轻柔反复吹打瓶壁细胞 ,使其脱落、分散形成细胞悬液,加入2ml圆底离心管中,于离心机上,1500rpm,离心5min,弃上清液。 (3) 向细胞中加入预冷PBS 500ul,吹打混匀,置于流式管中,通过流式细胞仪进行检测。2.7 利用siRNA干扰β-catenin的表达从而获得β-catenin低表达细胞模型。包括:确认靶基因?设计β-catenin siRNA ?制备siRNA ?siRNA 的转染?结果检测。β-catenin的siRNA购于广州复能基因公司。NCBI上查找beta-catenin 基因序列,其基因名为CTNNB1,mRNA 序列号位:NM_001904,基因ID:1499(1)转染前一天,将培养的人主动脉平滑肌细胞接种在24孔板上,24小时内细胞融合度需达到70-90%。 (2)在 50μl的DMEM不含血清培养基加入 20pmol siRNA,轻柔混匀; 混匀 lipofectamin 试剂,用50μl无血清的DMEM稀释1μl lipofectamin 试剂轻轻混匀,室温下放置 5 分钟;将稀释好的 siRNA 和 RNAi-Mate 试剂混合;柔和混匀,于室温下放置20分钟 ,以便形成 siRNA/lipofectamin 复合物。将 100μl siRNA/lipofectamin复合物加入含有细胞和培养基的培养板孔中,轻轻的来回晃动细胞培养板。 (3)将细胞置于CO2培养箱中37?温育4-6 小时后更换培养基。(4)实验所使用的siRNA带有绿荧光标记,转染后24小时在电子荧光显微镜下观察转染情况。2.8 细胞内钙离子浓度的测定准备样品:清理液清洗培养的细胞,胰酶消化后,轻轻刮下细胞,再加入3ml清理液并混匀,移入已预冷的15ml离心管,4?,300g,离心5min,弃上清液,加入200ul裂解液,于预冷的1.5ml离心管内震荡15s,再于冰上孵育30min,4?,13000RPM,离心10min,最后把上清液移入到新的1.5ml离心管。设定好分光光度计,波长为570,置零。准备1至5号5个1.5ml离心 管,2至5号管内分别加入100ul缓冲液,移取200ul液至1号管,接着移取100ul1号管的标准液到2号管,再移取100ul2号管稀释的标准液到3号管,移取100ul3号管稀释的标准液到4号管,将1至5号管均放入冰槽内备用。移取800ul缓冲液至新的1ml比色皿,加入100ul反应液,再加入100ul上一步配制的标准液或待测样品,混匀后孵育5min,放入分光光度计,读取吸光读数。构建标准曲线:纵坐标(y轴)为吸光单位(OD);横坐标(x轴)为标准钙浓度(mmol/L),根据标准曲线获得样品对应钙浓度,根据公式:标准曲线获得样品对应钙浓度(mmol,L)X样品稀释倍数=毫摩尔,升,进行计算。结果1 人主动脉平滑肌细胞的培养 图1为正常条件(90%DMEM高糖+10%胎牛血清)下培养的人主动脉平滑肌细胞,常规倒置相差显微镜下观察培养细胞呈梭形或多角形,细胞生长融合后,细胞间平行排列成束或呈放射状,具备平滑肌细胞生长的“波峰一波谷”样生长特点,符合VSMC形态学特征。取8-10代细胞进行实验。 图1:倒置相差显微镜下人主动脉平滑肌细胞呈梭形或多角形,细胞生长融合后呈现“波峰-波谷”样生长特点。2 嘌呤霉素的浓度梯度筛选 正常人主动脉平滑肌细胞在含不同筛选浓度嘌呤霉素的新鲜培养基条件下进行培养(筛选浓度依次为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml),2-3天更换一次含嘌呤霉素的培养基,连续6天在镜下观察各组细胞的生长凋亡情况,发现浓度为0μg/ml组细胞到第6天时几乎没有凋亡细胞,浓度 μg/ml组细胞到第6天时仍有少量正常生长形态细胞,浓度为4为2 μg/ml组细胞在第3-4天内细胞
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