【word】 西罗莫司高产突变株FC904—33

【word】 西罗莫司高产突变株FC904—33 西罗莫司高产突变株FC904—33 ?462?中国抗生素杂志2007年8月第32卷第8期 西罗莫司高产突变株FC904—33 黄捷金东伟余辉程元荣 (福建省微生物研究所,福州350007) 文章编号:1001—8689(2007)08—0462—04 摘要:西罗莫司是吸水链霉菌FC904产生的新型强效免疫抑制剂.为了获得高产西罗莫司突变株,采用UV,硝苯胍和甲基 磺酸乙酯诱变剂诱变处理吸水链霉菌FC904的孢子悬液和发芽孢子.随后用西罗莫司对存活菌株进行自身代谢产物的耐受性试 验,获得西罗莫司高产突变株FC904—33,其生物合成能力是原出发菌株的4.6倍.本文报道该突变株的培养特征,对抗生素的敏感 性,西罗莫司生产能力和副产物等. 关键词:西罗莫司;诱变育种;生物合成 中图分类号:R979.5文献标识码:A Screeningofhigher—yieldsirolimusproducer,mutantFC904—33 HuangJie,JinDong—wei,YuHuiandChengYuan—rong (FujianInstituteofMicrobiology.Fuzhou350007) ABSTRACTSirolimus,apowerfulimmunosuppressant,isproducedbyStre ptomyceshygroscopicus FC904.Inanattempttoimproveitsproduction,mutationandscreeningwerecarriedout.Sporesuspensions andtheformingbudsweretreatedwithUV,nitrosoguanidine(NTG)andethylmethanesulfonate(EMS), someofsurvivorswereselectedanddetectedtheirresistancetosirolimus.AmutantFC904—33withhigher productivityofsirolimuswasobtainedandthefeaturesofthemutantsuchasfewerby-productsandthesuscep— tibilitiestoantibioticsaswellasitsculturalcharacteristicswerepresented. KEYWoRDSSiroliums;Mutagenesis;Biosynthesis 西罗莫司(sirolimus)原名雷帕霉素(rapamycin), 是吸水链霉菌产生的具独特作用机制的含氮三烯大环 内酯化合物,具有抗真菌,抗增殖和抗肿瘤活性的新型 强效免疫抑制剂.由于其特异地结合并抑制哺乳动物 类雷帕霉素靶蛋白(manmaliantargetofrapamycin, mT0R)的作用,已被用作器官移植抗排斥药物,自身 免疫性疾病治疗药l1],临床心血管支架涂料;西罗莫司 及其的衍生物CCI一779,AP23573和RAD001正开发 为靶向,低毒的抗肿瘤药物L2].在生产过程中,西罗莫 司菌种的生产能力是关键.本文报道应用物理,化学诱 变因子联合诱变西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC904[3] 孢子悬液和发芽孢子,存活株再行对其自身代谢产物 西罗莫司耐药性选择和营养代谢研究,获得突变株 33以及突变株33的培养特征,抗生素敏感性及发酵 调控. 收稿日期:2006—08—25修回日期:2007—04 作者简介:黄捷,女,生于1964年,副研究员. 1与 1.1菌种 西罗莫司产生菌吸水链霉菌(Streptomyceshygro— s~opc1.tS)FC904,福建省微生物研究所保存,作为诱变 育种的出发菌株. 1.2培养基及培养条件 (1)琼脂斜面培养物琼脂斜面培养基为燕麦片 琼脂(ISP3);自吸水链霉菌FC904沙土保存管中取出 少许保存物或自生长好的琼脂斜面取出一环培养物接 种于ISP3琼脂斜面上,28C培养15,20d,斜面表面 培养物出现吸水黑斑,4C保藏备用. (2)种子培养吸水链霉菌FC904孢子接种于种 子培养基(主要成分有葡萄糖,酵母浸膏,蛋白胨等, pH7.0,500ml三角瓶装80ml培养基),28C,220 r/min振荡培养36,48h.种子瓶外观浓稠,显微镜观 06 从事抗生素菌种选育和发酵条件研究. 西罗莫司高产突变株FC904—33黄捷等?463? 察菌丝呈网状,可作为移种的种子. (3)发酵3,6ml的种子培养物移人60ml发酵 培养基中(3z成分为:葡萄糖,淀粉,黄豆饼粉,蛋白胨 等,pH6.0,三角瓶500m1),28?,220r/min振荡培养 84,96h,进行效价测定. 1.3西罗莫司的检测 (1)品西罗莫司标准品由福建省微生物研 究所制备,经中国药品生物制品检定所标定,纯度 99.8. (2)发酵液提取发酵液经甲醇提取后L2进行生 物效价测定和/或HPLC检测. (3)生物效价检测生物效价检测采用纸片半固 体琼脂扩散法[3]. (4)HPLC检测HPLC检测采用外标法.HPLC 检测仪:BeckmanSystemGold,色谱柱:ODSCl8’流 动相:甲醇:水(75:25),检测波长277nm,柱温 40?. 西罗莫司效价一标准品浓度×翟器等等簧 1.4物理,化学诱变因子联合处理吸水链霉菌FC904 (1)UV和NTG联合处理吸水链霉菌FC904孢 子10ml孢子悬液置于9cm直径的培养皿中,在暗 环境下经30W(2537A)紫外灯,20cm距离照射10s 后,再用NTG3mg/ml(0.1mol/LTris?C1pH8.0缓 冲液配制)28?避光处理2,3h.终止反应后,孢子悬 液重新悬浮于生理盐水中,稀释并涂布在ISP3琼脂平 板上,28?培养l0,l5d. (2)EMS处理突变株27发芽孢子和西罗莫司 抗性菌株的筛选将处理获得的突变株27孢子接 种于发芽培养基(葡萄糖l%,酵母浸膏0.69,5,蛋 白胨0.69,5,K2HPO4?3H2O0.1,MgSO4?7H2O 0.059,5,pH7.0,250mi三角瓶装30ml培养基),28C, 220r/min振荡培养l8,20h,显微镜观察有逗号状芽 头,10000r/min离心10min,弃上清液,收集发芽孢 子,用0.1mol/I,pH7.0的磷酸缓冲液洗涤,最后悬浮 在含EMS0.5mol/I的0.1mol/I,pH7.0的磷酸缓 冲液中,28C作用4h.5000r/min离心5min,去除含 EMS的清液.采用稀释法终止反应后,发芽孢子移人 与收集发芽孢子时等体积的上述发芽培养基中,继续 在28C振荡培养24h.离心收集菌丝体,悬浮于生理盐 水中.超声波(型号:Siniprep150)破碎(置冰中,每次 lmin,间隔30s,共l5min)至菌丝出现较均匀断枝,不 同稀释度的这样处理液分别涂布于ISP3琼脂平板和 含西罗莫司350,450ug/ml的ISP3琼脂平板上, 28?培养l0,l5d. 1.5抗生素的敏感性 采用固体琼脂二倍稀释法,培养基为ISP3琼脂, 28?培养10d观察结果. 1.63L自动发酵罐发酵验证 采用美国NBSBIOFLU3000发酵罐进行.斜面孢 子接人种子培养基,于28?,220r/min振荡培养36, 48h后以l09,5接种量接人发酵培养基,28?,l:l的 通气量发酵84,96h进行西罗莫司效价检测 (HPLC).发酵过程溶氧设置在40%,以搅拌转速来维 持设定的溶氧值,搅拌转速控制在l00,400r/min之 间. 2结果 2.1诱变处理 (1)UV和NTG对吸水链霉菌FC904的诱变处 理UV照射10s后用3mg/mlNTG处理吸水链霉菌 FC904孢子悬液3h,致死率达99.29,5.在挑取的2050 株存活株中获得70株发酵水平较出发菌株提高209,5 以上的菌株(生物检定),经过进一步筛选,获得5株发 酵水平较出发株高50%以上的菌株(HPLC检测),其 中突变株27的发酵水平约是出发菌株的2倍. (2)EMS对突变株27的诱变处理0.5mol/L EMS处理突变株27的发芽孢子,在ISP3琼脂分离 平板和含西罗莫司ISP3的琼脂平板上分别挑取528 株和242株存活株进行筛选,结果显示比出发菌株效 价高20%以上(生物检测)的菌株分别有2l株和23 株;经过进一步的筛选并采用HPLC进行检测,在 ISP3琼脂平板上挑取的菌株发酵效价均不高于出发 株,而在含西罗莫司的ISP3琼脂平板上挑取的菌株中 有4株的效价较出发菌株提高509,5.经传代培养,发 现突变株33发酵效价高(HPIC检测,表1),组分较 单一,性状稳定,生长快,孢子丰满. 2.2高产突变株33的性状研究 (1)菌落形态在ISP3琼脂平板上,与出发菌株 相比,突变株的菌落形态发生明显的变化.原出发菌株 吸水链霉菌FC904菌落平坦,粉白色,平均直径5, 6mm,背面无色素;突变株27菌落高起,呈圆形多皱 褶,平均直径3,4mm,背面无色素,表面常出现白色 表I突变株与出发株的发酵水平比较 ? 464?中国抗生素杂志2007年8月第32卷第8期 的气生菌丝蒙面;突变株33菌落平坦,平均直径5, 6ram,同心圆形,背面可见浅粉红色色素. (2)出发菌株吸水链霉菌FC904与突变株的发酵 产物和生产能力比较吸水链霉菌FC904在沉没培 养中,西罗莫司发酵效价低,还产生西罗莫司发酵过程 常见的副产物洋橄榄素[5].HPIC检测表明,突变株 33不但西罗莫司合成能力明显提高[分别是突变株 27的2.4倍和出发菌株吸水链霉菌FC904的4.6倍 (表1)],而且发酵液中洋橄榄素含量极微,组分比较 单一(图1). (3)突变株33的稳定性考察表2结果显示,菌 株孢子琼脂斜面保存3个月,发酵效价无明显变化. (4)抗生素敏感性试验将链霉素,庆大霉素等抗 洋橄榄索SRL(trans) \\L…童.RL(A\L….\/,\.. O 生素应用于大环内酯化合物产生菌(特别是西罗莫司 产生菌吸水链霉菌FC904)的选育已得到肯定的结 果[6].我们考察了突变株27和33对不同化学类群 的五种抗生素的敏感性,结果表明,效价高,副产物少 的突变株33对两种氨糖抗生素的敏感度高于出发菌 株吸水链霉菌FC904和突变株27;对西罗莫司耐受 性,突变株33高于其他两个出发菌株;对丝裂霉素和 利福平,与吸水链霉菌FC904和突变株27有近似的 结果(表3). 2.33l自动发酵罐的发酵 图2显示突变株33在3l自动发酵罐的发酵参 数.突变株33糖,氮代谢正常;西罗莫司合成始于 40h,发酵至88h西罗莫司合成达到最高值.在发酵过 洋橄 sRL() 驾盆 I一一 ‘ l0l52OO ,(rain) OlOl5 f(rain) lOl52O f(min) A:吸水链霉菌FC904;B:突变株27;C:突变株33.SRL:西罗莫司;cis:顺 式异构体;trans:反式异构体 图1突变株与出发菌株发酵液HPLC图谱比较 表2突变株33斜面保存时间的稳定性考察 表3西罗莫司出发菌株和突变株对抗生素的敏感度 程中,随菌丝生长,pH大幅度下降,在西罗莫司合成 期维持在一个较低值,发酵后期略有回升;菌丝生长期 对氧的需求较高,搅拌转速维持在最高设定值的 400r/min,而西罗莫司合成期对氧的需求相对较低,到 后期维持在较低水平(200r/min左右). 3讨论 关于西罗莫司菌种的选育,我们曾报道氨基糖苷 类抗生素用于西罗莫司菌种选育中取得的结果,应用 NTG处理吸水链霉菌FC904原生质体后在含庆大霉 素1/~g/ml的溶液中再处理得到西罗莫司合成能力比 吸水链霉菌FC33;该菌株生物 合成西罗莫司的能力是原始出发菌株吸水链霉菌 FC904的4.6倍,突变株27的2.4倍.该菌株在菌落 形态等方面的性状与前两代菌株不同;在发酵代谢产 物上,新菌株极少合成西罗莫司发酵时常见的副产物 洋橄榄素,使下游的提取,纯化步骤更快捷,方便;此 外,新菌株的斜面孢子稳定性好,Fl代斜面在4?保 存3个月效价基本稳定,适合工业化生产的需要.以上 结果在3L自动发酵罐上得到了验证.产生菌的选育 是繁重而细心的劳动,选择理性和有效的育种手段需 要进行反复的试验.本报道尤其是西罗莫司产生菌对 某些抗生素的敏感性,对自身代谢产物的耐受性与西 罗莫司合成能力的关系值得进一步探讨. 致谢:林宏同志参加实验室工作,特此表示感谢. 参考文献 [1]程元荣.新型强效免疫抑制剂——雷帕霉素[A].王浴生. 化疗药理学与临床研究新进展[M].成都:四JII大学出版 社,2002:220 [23程元荣,郑卫.新分子靶的mTOR和新抗种瘤靶向药物雷 帕霉素及其衍生物EJ].中国处方药,2006,(12):16 [31程元荣,林文良,黄捷,等.新型大环内酯免疫抑制剂西罗 莫司F904的研究[J3.中国抗生素杂志,2002,27(12):709 [41黄捷,金东伟,郑专,等.雷帕霉素的生物效价测定[J1.海 峡药学,1999,11(1):22 [53FangA,WongGK,DemainAL.Enhancementofthe antifungalactivityofrapamycinbythecoproducedelaio— phylinandnigericin[J3.JAnbiot,2000,53(2):158 [63ChengYR,HuangJ,QiangH,eta1.Mutagenesisofthe rapamycinproducerStreptomyceshygroscopicusFC904 [J].JAnbiot,2001,54(11):967 [7]FordLM,EatonTE,GodfreyOW.SelectionofStrep— tomycesambofaciensmutantsthatproducelargequantities ofspiramycinanddeterminationofoptimalconditionsfor spiramycinproduction[J].ApplEnviroMicrobiol,1990, 56(11):3511 (上接第453页) [111ItoT,KatayamaY,HiramatsuK.Cloningandnucleo— tidesequencedeterminationoftheentiremecDNAof pre—methicillin—resistantStaphylococcusaureusN315[J1. 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