【2017年整理】病毒特异性IgM抗体定性检测试剂注册申报技术指导原则

【2017年整理】病毒特异性IgM抗体定性试剂注册申报技术指导原则 指导原则编号 病毒特异性IgM抗体定性检测试剂 注册申报资料技术审评指导原则 二O一一年十二月 目录 一、前言............................................................................................. 3 二、适用范围 ..................................................................................... 4 三、注册申报资料要求 ...................................................................... 5 ,一,综述资料 ............................................................................ 5 ,二,产品说明书 ........................................................................ 6 ,三,拟定产品及编制说明 ................................................ 12 ,四,注册检测 .......................................................................... 13 ,五,主要原材料研究资料 ....................................................... 14 ,六,主要生产工艺及反应体系的研究资料 ............................. 15 ,七,分析性能评估资料 ........................................................... 16 ,八,参考值,范围,确定资料 ................................................ 21 ,九,稳定性研究资料............................................................... 22 ,十,临床试验资料 .................................................................. 23 四、名词解释 ................................................................................... 29 五、参考文献 ................................................................................... 30 2 病毒特异性IgM抗体定性检测试剂 注册申报资料技术审评指导原则 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对病毒特异性M型免疫球蛋白,Immunoglobulin M～IgM,定性检测试剂注册申报资料的准备及撰写～同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对病毒特异性IgM抗体定性检测试剂的一般要求～申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用～若不适用～需具体阐述理由及相应的科学依据～并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件～但不包括注册审批所涉及的行政事项～亦不作为法规强制执行～如果有能够满足相关法规要求的其他～也可以采用～但需要提供详细的研究资料和验证资料～相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的～随着法规和标准的不断完善～以及科学技术的不断发展～本指导原则相关内容也将适时进行调整。 3 二、适用范围 病毒特异性IgM抗体定性检测试剂是指利用酶联免疫法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理～以病毒特异性IgM抗体为检测目标～对人血清或血浆样本中病毒特异性IgM抗体进行体外定性检测的试剂。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。 根据结构不同～人免疫球蛋白可分为IgG、lgM、lgA、IgE和lgD五种类型～ IgM占血清免疫球蛋白总量的5%-10%。分泌型IgM为五聚体～是分子量最大的免疫球蛋白分子～一般不能通过血管壁～主要存在于血液中。五聚体IgM含10个Fab段～有很强的抗原结合能力～含5个Fc段～比IgG更易激活补体～IgM抗体一般为保护性抗体～具有免疫性。IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体～在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM～且由于IgM分子量大～不能通过母血进入胎儿体内～故脐带血或新生儿血液中病毒特异性IgM升高常提示胎儿或新生儿存在宫内或围生期感染。在病毒感染的初次体液免疫应答中～特异性IgM抗体首先出现～但其反应短暂～一般几周后即不易再测到,基于IgM抗体的这种出现早、消失快的特性～病毒特异性IgM抗体阳性提示早期感染～可用于感染急性期的判断。人血液样本中病毒特异性IgM抗体的测定～对某些传染病如甲型肝炎、乙型肝炎、 4 TORCH类病原体等有较高的临床诊断价值。不具备病毒分离培养鉴定实验室的临床检测机构常将病毒特异性IgM抗体的检测作为病毒早期感染的依据～因此～病毒特异性IgM抗体检测结果的准确性显得颇为重要。假阳性结果可能导致病人接受不必要的抗病毒治疗而假阴性结果则有可能造成患者治疗的延误～由特异性IgM抗体检测造成的误诊或漏诊对孕妇或胎儿可能造成更大的伤害。相关的生产企业必须充分意识到该类产品的潜在风险～根据本指导原则的要求对该类试剂的安全性和有效性进行科学合理的验证。 三、注册申报资料要求 ,一,综述资料 综述资料主要包括产品临床适用症背景情况、预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容～其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及临床适用范围等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。综述资料注册申报资料的重要组分之一～其内容应符合《体外诊断试剂注册管理办法,试行,》,以下简称《办法》,和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》,国食药监械[2007]609号,的相关要求～另外～建议申请人对以下几方 5 面内容进行着重介绍: 1(特定病毒的生物学特性、结构与功能、感染过程、潜伏期、IgM抗体产生及可持续存在时间、病理背景等, 2(特定病毒感染相关的疾病情况、流行病学以及易患,高危,人群的说明。 3(对申报试剂检测结果可能带来的风险进行合理评估～即由申报试剂的假阳性/假阴性结果导致的对患者临床诊治、孕妇或胎儿的不恰当处理、疫苗接种、流行病学等方面的负面影响。 4(用于特定病毒IgM抗体检测方法的发展历程摘要及各种检测方法的优缺点评价。 ,二,产品说明书 说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息～是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据～因此～产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求～境外试剂的中文说明书除格式要求外～其内容应尽量保持与原文说明书的一致性～翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一 6 致～如某些内容引用自参考文献～则应以规范格式对此内容进行标注～并单独注明文献的相关信息。 结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求～下面对病毒特异性IgM抗体定性检测试剂说明书的重点内容进行详细说明～以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。 1.【预期用途】 应至少包括以下几部分内容: ,1,试剂盒用于体外定性检测人血清和/或血浆样本中xx的特异性IgM抗体。 ,2,简单介绍待测目标的特征～如特定病毒的生物学性状、潜伏期、易感人群、感染后的临床表现等临床背景相关的信息介绍,适用于对哪些患者人群的检测～如具有何种症状/体征的患者、相关的密切接触者、地域要求或年龄限制,如有,等。 ,3,病毒特异性IgM抗体的产生、持续时间、与特异性IgG和病毒核酸的关联, ,4,该试剂盒的应用是否需要配套使用的专用仪器～与靶抗体检测相关的其他检测技术的介绍。 2.【主要组成成份】 ,1,说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息～阴性/阳性对照品可能含有人源组分～应提供其生物学来源、灭活方法及无传染性确认的方法等。 7 ,2,对检测中使用的抗原及抗体的信息进行简单介绍。 ,3,试剂盒中不包含但对该项检测必须的组份～企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。 3.【储存条件及有效期】 对试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、运输稳定性等信息做详细介绍。 胶体金试纸条产品应对开封后未使用产品允许暴露于空气中的温度、湿度及期限等条件予以明确。 4.【样本要求】 重点明确以下内容: ,1,样本采集前对患者的要求:如采集时间、采集顺序等～是否受临床症状、用药情况等因素的影响。 ,2,样本采集:说明采集方法及样本类型～如有血浆样本～应注明对抗凝剂的要求。 ,3,样本处理及保存:样本处理方法、保存条件及期限,短期、长期,、运输条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温～冻融次数。经热处理样本是否可用、对储存样本的添加剂要求等。 ,4,如果检测系统含有某种IgG抗体的去除技术,IgG吸附剂,～如抗人IgG抗体等～则应包括IgG吸附剂使用相关的注意事项。例如:经IgG吸附剂处理的样本不能用于IgG类抗体的检测,在检测IgM类抗体的同时～检测处理过的混合物中的IgG类抗体～以证实对IgG、RF等去除的有效性, 8 只有当IgG类抗体的检测结果为阴性时～IgM类抗体的检测结果才有效等。 5.【检验方法】 详细说明试验操作的各个步骤 ,1,实验环境:温、湿度条件～检测试剂及样本的复温要求及相关注意事项。例如:冻存样本在复融后应经过充分的混匀再行检测。 ,2,试剂配制方法、注意事项～试剂开封后使用方法及注意事项等。 ,3,试验条件:操作步骤、温度、时间、仪器波长等以及试验过程中的注意事项。不同型号产品～加样方法如有差异～建议分别以图示方式描述清楚。 6.【检验结果的解释】 结果判断或计算:详细描述对检测结果的判定或计算方法、对质控品,对照品,的检测结果要求,试验有效性的判断,等。如果质控品和病人样本的使用方法不同～生产商应注明必要的指导和解释。建议在质控品,对照品,结果解释环节注明以下字样:“如果质控结果与预期不符～实验室应重复试验以保证结果的可靠性。如不能获得可靠性结果～则不应出具检测报告。”实验室应负责质量控制失败的解决。 7.【检验方法局限性】 综合产品的预期用途、临床背景、检测方法及适用范围 9 等信息～对可能出现的局限性进行相关说明～主要包括以下描述～请申请人选择适用的条款在产品说明书中予以阐述。 ,1,本产品检测结果仅供临床参考～不应作为临床诊治的唯一依据～对患者的临床管理应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查、治疗反应及流行病学等信息综合考虑。 ,2,感染初期～病毒特异性IgM抗体未产生或滴度很低会导致阴性结果～如怀疑有病毒感染～应提示患者在7,14天内复查～抽取第二份样本～并和第一份样本在同条件下同时检测～以确定是否有初次感染的血清转化或病毒特异IgM或IgG抗体滴度明显升高。 ,3,高滴度病毒特异性IgG抗体会与特异性IgM抗体竞争抗原结合部位～会使检测的敏感性降低～IgM结果可能会出现假性低值或阴性结果。尤其是怀疑先天性病毒感染的新生儿样本～他们的血清中可能含有母亲来源的高水平病毒特异的IgG抗体和胎儿产生的相对低水平的病毒特异IgM抗体～因此～对于该类样本的阴性结果应慎重分析。 ,4,由于脐带血中可能含有源于母体的病毒特异性IgM抗体,胎盘渗漏,～因此～最好在出生后5天内再对婴儿的后续样本进行检测～以证实脐带血样本病毒特异性IgM抗体的阳性结果。强烈推荐新生儿与母亲的血清样本平行测试～如果是胎儿的先天性感染,其IgM抗体水平(以及IgG抗体水平) 会持续存在或呈上升趋势, 反之,如果抗体来源于母 10 体～则在在平行实验中婴儿的抗体水平会逐渐下降或消失。 ,5,由于孕妇的实验室检查不能可靠地鉴定胎儿患病的风险～故不建议采用本试剂对无症状的母体感染进行筛查～不得将本试剂的检测结果单独作为终止妊娠的依据。 ,6,免疫功能受损或接受免疫抑制治疗的患者～如人类免疫缺陷病毒,HIV,感染患者或器官移植后接受免疫抑制治疗的患者～其血清学IgM抗体检测的参考价值有限～可能会导致错误的医学解释。 ,7,在近几个月内接受过输血或其他血液制品治疗的人群～对其阳性检测结果的分析应慎重。 ,8,病毒特异性IgM抗体不仅出现于初次感染～当二次感染和复发感染时也可能出现。 ,9,当疾病的流行程度降低时阳性预测值降低～对低危人群阳性结果的解释应当谨慎。建议对申报试剂临床研究中的病例人群特征进行说明～并对适用人群的性别、年龄、地域等特征进行明示。 8.【产品性能指标】 详述以下性能指标: ,1,对相应国家参考品,如有,检测的符合情况。 ,2,最低检测限,分析灵敏度,:说明试剂的最低检测浓度或滴度～简单介绍最低检测限的确定方法。 ,3, 企业内部阳性/阴性参考品符合率～简单介绍阳性参考品的来源、浓度梯度、阴性参考品组成、来源以及浓 11 度梯度设臵等信息。 ,4, 精密度:精密度参考品的组分、浓度及评价标准。 ,5, 分析特异性 ?交叉反应:对易产生交叉反应的其他病原体的高水平IgM抗体、特异性IgG抗体等的验证情况。 ?干扰物质:样本中常见干扰物质对检测结果的影响～如溶血、高脂、黄疸等干扰因子研究,结果应量化表示～禁用轻度、严重等模糊表述,～有关高浓度总IgM和IgG抗体、自身抗体、类风湿因子、嗜异型性抗体等的干扰验证。 ?药物影响:较常见的用于病毒感染治疗的外用或内服的药物对检测结果的影响。 ,7,钩状,HOOK,效应:对高浓度特异性IgM抗体的钩状效应验证情况。 ,8,对比试验研究,如有,:简要介绍参比试剂,方法,的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。 9.【注意事项】应至少包括以下内容: ,1,有关试剂盒内人源组份,如有,生物安全性的警告。 ,2,有关实验操作、样本保存及处理等其他注意事项。 ,三,拟定产品标准及编制说明 拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申 12 报资料基本要求》的相关规定。另外～对于国产试剂～应参考《中国生物制品规程》,2000年版,～将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后～并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。 病毒特异性IgM抗体检测试剂的注册检测应主要包括以下性能指标:物理性状、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、精密度、最低检测限,分析灵敏度,等。阳性参考品主要考察对不同滴度情况下的检测符合性。阴性参考品则是对分析特异性,交叉反应,的验证～应主要包括易发生交叉反应的其他病原体特异性IgM抗体的假阳性情况的考核。 如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布～则企业标准的要求不得低于上述标准要求。 ,四,注册检测 根据《办法》要求～首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家参考品的病毒特异性IgM抗体项目～在注册检测时应采用相应的国家参考品进行,对于目前尚无国家参考品的项目～生产企业应建立自己的质控体系并提供相应的内部参考品。 13 ,五,主要原材料研究资料 1(试剂盒所用病毒抗原的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料～主要包括以下两方面: ,1,企业自制抗原 如为天然抗原～则应对病毒株选择、病毒培养、抗原提取及纯化、鉴定等实验过程予以详述,如为重组抗原～则应提交有关特定基因选择、基因序列、基因克隆、抗原表达及抗原纯化鉴定等详细内容～并对基因克隆的整个过程进行详述～如特定DNA分子的体外处理、重组连接、导入宿主细胞、宿主细胞繁殖以及重组子表达等实验过程。 ,2,企业外购抗原～则应详述抗原的名称及生物学来源～外购方名称～提交外购方出具的抗原性能指标及检验证书～详述申请人对该抗原技术指标的要求以及申请人确定该抗原作为主要原材料的依据。供货商应相对固定～不得随意更换。 2(试剂盒所用抗体,如抗IgM-μ链抗体,的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料～主要包括以下两方面: ,1,企业自制抗体 如使用天然抗原作为免疫原则应明确该天然抗原的来源,如使用重组抗原或其他人工合成抗原作为免疫原～应提供相应的核酸组分及重组抗原的序列信息。申请人对所选抗体的技术指标要求,如外观、纯度、蛋白浓度、效价等,～ 14 确定该抗体作为主要原材料的依据, ,2,企业外购抗体～应详述抗体的名称及生物学来源～外购方名称～提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书～详述申请人对该抗抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。供货商应相对固定～不得随意更换。 申请人应对主要生物原料质控标准的技术要求如外观、纯度、蛋白浓度、效价等进行确认～并对制备完成的抗原成品进行质量检验以确认其符合标准要求～整个生产工艺稳定可靠。 3.其他主要原辅料的选择及验证资料～如固相载体、硝酸纤维素膜、反应缓冲液等～该类原辅料一般均为外购～应详述每一原辅料的外购方名称～提交外购方出具的每一原辅料性能指标及检验证书～详述申请人对每一原辅料技术指标的要求以及申请人确定该原辅料作为主要原辅料的依据。 4(企业内部参考品的原料选择、制备、定值、统计学分析及相关的实验验证资料。应提供对参考品性质确认的其他方法或试剂,建议采用国内已上市的、临床上普遍认为质量较好的同类试剂,的相关信息。 ,六,主要生产工艺及反应体系的研究资料 1.主要生产工艺介绍～可用流程图方式表示～并简要说 15 明主要生产工艺的确定依据。 2.产品基本反应原理介绍。 3.包被工艺研究～申请人应考虑如包被液量、浓度、时间等指标对产品性能的影响～通过试验确定上述指标的最佳组合。 4.显色,发光,系统、酶作用底物等的介绍, 5.实验体系反应条件确定:申请人应考虑反应时间、反应温度、洗涤次数等条件对产品性能的影响～通过试验确定上述条件的最佳组合。 6. 酶催化底物,发光或变色,的最适条件研究, 7.体系中样品加样方式及加样量确定:申请人应考虑样品加样方式、加样量对产品检测结果的影响～通过实验确定最佳的加样方式及加样量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测～申请人还应对可用于样本稀释的基质或处理方法进行研究～通过试验确定最终选择的用于样本稀释的基质或处理方法。 ,七,分析性能评估资料 企业应提交原厂在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料～包括具体研究方法、内控标准、试验数据、统计分析等详细资料。对于病毒特异性IgM抗体检测试剂～建议着重对以下分析性能进行研究。 16 1.最低检测限,分析灵敏度, 选取特定滴度的病毒特异性IgM抗体样本～做系列倍比稀释～将检测结果的阳性率在90%-95%,n?20,的最大稀释倍数作为试剂盒的最低检测限。 对于采用特定仪器进行检测的配套用试剂～如化学发光法、电化学发光法、磁微粒酶免技术等～亦可以采用对空白试剂的背景信号进行验证的方式确认分析灵敏度。方法为使用同批号试剂对零浓度质控品或样品稀释液进行不少于20次的重复检测～平均值加,或减,2倍SD,?95%臵信区间,即试剂的最低检测限。 2.分析特异性 ,1,交叉反应 用于病毒特异性IgM抗体检测试剂交叉反应验证主要考虑以下几方面可能性: ?对抗原结构相近或临床症状相似的其他病毒高水平IgM抗体血清进行交叉反应研究～如乙型肝炎病毒核心抗体,HBc,IgM、甲型肝炎病毒,HAV,IgM、TORCH,弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒以及巨细胞病毒,类病原体IgM抗体等。 ?高浓度的病毒特异性IgG抗体与特异性IgM抗体的交叉反应验证。 申请人应提交所有用于交叉反应验证的病原体来源、浓度 17 或滴度确认等信息。建议申请人将有关交叉反应验证的信息以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中列出。 ,2,干扰物质 ?内源性干扰 对样本中常见的内源性干扰物质进行检测～如溶血、高脂、黄疸、类风湿因子,RF,、抗核抗体,ANA,、抗线粒体抗体,AMA,、高浓度非特异性IgG和IgM抗体,血清总IgG和IgM,等。方法为对病毒特异性IgM抗体阴性、弱阳性,临界浓度,的临床或模拟添加样本分别进行验证～样本量选择应体现一定的统计学意义～说明样本的制备方法及干扰实验的评价标准～确定可接受的干扰物质极限浓度。 ?抗凝剂的干扰 如果试剂盒适用样本类型包括血浆样本～应采用各种适用抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行对比实验研究。方法为对不少于50例源自同一患者的病毒特异性IgM抗体阴性、弱阳性,略高于CO值,的血清和血浆样本,不同抗凝剂各50例,进行检测以验证申报试剂对于血清和血浆样本的检测结果的一致性。 ?目前～病毒特异性IgM抗体检测试剂通常采用捕获法,又称双夹心法,和间接法两种原理。后者是将病毒抗原包被在固相载体上～加入含待测IgM抗体的样本后～待抗原抗体结合后～再加入酶标记的抗IgM抗体进行反应～孵育后洗 18 去未结合的酶结合物再加入酶底物显色以反应“抗原-抗体-酶标二抗”复合物的存在。该方法在检测特异性IgM抗体时存在一定的缺陷～由于血清中存在的IgM类RF能与IgG抗体结合～然后结合到酶标二抗上～易造成假阳性～高效价的病毒特异性IgG抗体也可与IgM抗体竞争抗原结合位点而导致假阴性。因此～采用间接法,固相包被病毒抗原,的试剂～需要在病毒特异性IgM检测前采用一定的方法去除样本中的IgG类抗体～例如～在样本缓冲液中加入抗人IgG抗体～可以特异性地结合血清或血浆中的IgG并沉淀～如果样本中存在类风湿因子～也将被抗人IgG-IgG的复合物所吸附以去除干扰。 基于上述理论～使用间接法原理的试剂盒～在样本处理环节应该设臵一定的IgG消除体系以降低实验中假阳性或假阴性的可能性。如果反应体系中使用了相关的IgG吸附技术,IgG吸附剂,来去除RF、ANA或病毒特异性IgG抗体的干扰～应以mg/dL为单位注明IgG吸附剂对样本中人IgG抗体的吸附能力～并进行以下的实验研究:对至少10份临界值附近的病毒特异性IgM抗体弱阳性并含有多水平病毒特异性IgG抗体的样本进行检测～比较去除总IgG前后的结果～验证IgG吸附剂消除干扰的效果～以上实验可以采用人工制备的样本进行。 ?对至少10份含有病毒特异性IgM抗体的样本进行IgM 19 破坏实验研究～方法为采用特定的化学制剂,如2,巯基乙醇或二硫苏糖醇,处理样本后～重新进行检测～IgM检测结果应为阴性。 5.精密度 企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求～如标准差或变异系数的范围等～针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。 ,1,对可能影响检测精密度的主要变量进行验证～除申报试剂本身外～还应对操作者、实验地点等要素进行相关的验证。 ,2,设定合理的精密度评价周期～如有条件～建议申请人选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。 ,3,用于精密度评价的质控品应至少包括三个水平: ?阴性质控品:待测物浓度低于试剂盒的CO值或背景值较高的零浓度质控品～阴性检出率应为100%,n?20,。 ?弱阳性质控品:待测物浓度略高于试剂盒的CO值～阳性检出率应在90%-95%范围,n?20,。 ?阳性质控品:待测物浓度呈中度到强阳性～阳性检出率为100%～且CV?10%,n?20,。 另外～建议选择适量临床采集的新鲜病人样本,包括所有样本类型,作为无靶值质控品进行精密度评价～以更好地 20 模仿临床检测环境。 6.阳性/阴性参考品 如申报产品有相应的国家参考品～则企业内部阳性/阴性参考品应参考国家参考品的项目设臵。在不低于国家参考品要求的前提下～申请人可以结合实际情况设臵合理的内部阳性/阴性参考品。对于没有国家参考品的产品～申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品～阳性参考品应着重考虑抗体滴度要求～阴性参考品则主要涉及对分析特异性,交叉反应,的验证情况。 申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、抗体滴度等信息进行精确的实验验证～并提交详细的验证资料。 7.钩状,HOOK,效应 目前～病毒特异性IgM抗体检测试剂大多采用捕获法,固相载体包被抗IgM-μ链,或间接法,固相载体包被病毒抗原,的原理检测样本～考虑到方法学的缺陷～有必要对钩状,HOOK,效应进行考虑。建议采用高滴度的病毒特异性IgM抗体的血清进行梯度稀释后由低浓度至高浓度开始检测～每个梯度的稀释液重复3-5份～建议在产品说明书上明示对钩状效应的研究结果。 ,八,参考值,范围,确定资料 重点提交对申报试剂阴性/灰区/阳性等结果判断的CO 21 ,cut-off value,值确定的实验研究资料～应包括具体的试验方案、评价标准、统计学分析、研究数据等研究资料。建议采用受试者工作特征曲线,ROC,的分析方式来选择确定合理的CO值～如实验结果分析存在灰区,equivocal zone,～则应明确灰区建立的基础。CO值建立的样本来源选择应考虑到地域性、年龄、不同生理状态等因素的影响～并明确CO值在不同的样本类型是否有差异。对CO值建立后所产生的临床灵敏度和特异性进行充分判断～使产生假阴性或假阳性结果的可能性均降至最低。 ,九,稳定性研究资料 稳定性研究资料主要涉及两部分内容～申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性、高温加速破坏稳定性、运输稳定性及开瓶稳定性,如涉及,等研究～申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究～应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。 考虑到低温条件下长时间保存可能造成病毒特异性IgM抗体的活性减弱～申请人应对样本稳定性进行合理的验证～主要是对冷藏和冷冻两种条件下的有效期进行验证～以确认 22 不同类型样本的短期、长期保存条件及效期。需要冷冻保存的样本应对冻融次数,重要指标,进行合理的验证。某些用于防腐、冷冻用途或起稳定保护作用的添加剂,如叠氮化物,可能会对IgM抗体的检测造成影响～如涉及～请对该添加剂的影响进行合理验证。 另外～如果要用于加热样本,如热灭活,的检测～则应对加热前后的病毒特异性IgM抗体阳性及阴性样本进行加热因素的干扰验证。方法为对临界值附近的至少10份弱阳性加热和未加热样本进行对比检测～比较检测结果的差异,对至少10份阴性加热和未加热的样本进行对比检测～比较检测结果的差异。 试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。 ,十,临床试验资料 1. 研究方法 ,1,对于已有同类产品上市的试剂临床研究～选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂～采用拟申报产品,以下称考核试剂,与之进行对比试验研究～证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。在同类产品的对比研究中～冻存标本的选择不得多于样本总数 23 的50%～且冻存标本中的阳性例数亦不得多于总阳性例数的50%。 另外～申请人还应选择不少于50例、处于感染急性期患者的新鲜采集样本进行考核试剂与病毒分离培养鉴定方法的比较研究～以确定申报试剂检测结果与金标准方法比较的符合率并以此判断其临床灵敏度和特异性。如果病毒分离培养鉴定的方法不可行也可以采用其他用于感染急性期判断的方法进行比对研究～例如:病毒IgG抗体的血清学转换,动态监测2份或以上的血清IgG～恢复期与急性期比较IgG呈4倍以上升高,、病毒核酸检测或新鲜采集样本的抗原检测等方法～对于病毒感染急性期的判断应密切结合患者的临床诊断综合进行。 ,2,对于无同类产品上市的申报试剂的临床研究～则必须选择病毒感染检测的其他方法并结合临床诊断进行相应的对比试验研究～如病毒分离培养鉴定、病毒IgG抗体的血清学转换、病毒核酸检测或新鲜采集样本的抗原检测等方法。 2.临床研究单位的选择 申请人在国内不同区域选择临床单位～尽量使各单位的临床样本有一定的区域代表性,临床研究单位应具有特定病毒感染疾患诊疗、病毒分离培养鉴定方法或分子生物学方法检测的优势～实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的 24 各环节,仪器、试剂、质控及操作程序等,～熟悉评价方案。在整个实验中～考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下～最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。 3.临床试验方案 临床试验实施前～研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑～科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设臵应基本一致～且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施～不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成～申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外～不得随意干涉实验进程～尤其是数据收集过程。 试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准～任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂应保持一致～以便进行合理的统计学分析。另外～考核试剂的样本类型不应超越参比试剂对样本类型的检测要求～如果选择了参比试剂适用样本类型以外的样本～则应采用病毒分离培养鉴定或其他合理方法对额外的样本类型进行验证。 4.病例选择及样本类型 临床试验应选择具有特定病毒感染症状/体征、相似症状或有密切接触史等人群作为研究对象。企业在建立病例纳 25 入标准时～应考虑到不同人群的差异～尽量覆盖各类适用人群。在进行结果统计分析时～除总体病例数的要求外～建议对各类人群分层进行数据统计分析。考虑到大样本统计学的要求～临床研究中病毒特异性IgM抗体的阳性样本例数以不少于120例为宜。对于阴性病例的选择～也应考虑到交叉反应的需要～对靶病毒之外的其他病毒感染急性期的患者样本进行检测～以从临床角度考察其分析特异性。 5.统计学分析 对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法～如检测结果一致性分析、受试者工作特征,ROC,曲线分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比实验的等效性研究～常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果～对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性～统计学分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设～即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。 6.结果差异样本的验证 在数据收集过程中～对两种试剂检测结果不一致的样本～应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂,国内已上市,进行复核～同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。注意～在选择第三方试剂复核时～应先采用第三方试剂对一定数量的申报试剂 26 和参比试剂检测结果一致的样本,包括阳性和阴性结果,进行检测～以对第三方试剂选择的合理性进行评估。 7. 临床试验总结报告撰写 根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求～临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述～应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述～并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。 ,1,临床试验总体设计及方案描述 ? 临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。 ? 病例纳入/排除标准、不同人群的预期选择例数及标准。 ? 样本类型～样本的收集、处理及保存等。 ? 统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。 ,2, 具体的临床试验情况 ? 申报试剂和参比试剂的名称、批号、有效期等信息。 ? 对各研究单位的病例数、人群分布情况进行总合～建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。 ? 质量控制～试验人员培训、质控品检测情况～对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。 ? 具体试验过程～样本检测、数据收集、样本长期保 27 存、结果不一致样本的校验等。 ,3, 统计学分析 ? 数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。 ? 定性结果的一致性分析 阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%,或99%,的臵信区间。以交叉表的形式总结两种试剂的定性检测结果～对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。对定量结果进行相关及线性回归分析～重点观察相关系数,r值,或判定系数,R2,、回归拟合方程,斜率和y轴截距,等指标。 另外考虑到对不同样本类型以及不同人群的检测结果可能存在一定差异～故建议对不同样本类型及不同人群分别进行统计分析～ 以对考核试剂的临床性能进行综合分析。 ,4, 讨论和结论 对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果～对本次临床研究有无特别说明～最后得出临床试验结论。 28 四、名词解释 1.分析特异性,analytical Specificity,:测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述～并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。 注:潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物。 2.精密度,precision,:在规定条件下～相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示～如标准差,SD,和变异系数,CV,。 29 五、参考文献 1. 《体外诊断试剂注册管理办法,试行,》～,国食药监械 [2007]229号,～2007年4月19日 2. 《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》～,国食药监械 [2007]240号,～2007年4月28日 3. 《体外诊断试剂说明书编写指导原则》～,国食药监械 [2007]240号,～2007年4月28日 4. Review Criteria for In Vitro Diagnostic Devices for Detection of IgM Antibodies to Viral Agents, CDRH FDA, USA February 27, 1997. 5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Specifications for immunological testing for infectious diseases, proposed guideline. 2001. Order code I/LA18-A2. 6. 彭文伟～《传染病学》～第五版～人民卫生出版社～2001。 7. 刘艳芳、张勇建、苏明～临床病毒学检验～军事医学科学 出版社～2009。 8. 陈敬贤～《诊断病毒学》～第一版～人民卫生出版社～2008 年4月。 9. 冯仁丰～《临床检验质量管理技术基础》～第二版～上海科 学技术文献出版社～2007年4月。 30 10.《中国生物制品规程》,2000年版,～化学工业出版社 11(李洪源～王志玉～《病毒学检验》～第一版～人民卫生出版社～2006年7月。 12(Nathanson.N～《病毒致病与免疫》～第2版～科学出版社～2008年1月。 13(曹雪涛～《免疫学技术及其应用》～第一版～科学出版社～2010年5月。 六、起草单位 国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心 31 1.1.2 排除角膜接触镜的禁忌证 学习目标 掌握裂隙灯显微镜眼部常规检测程序和内容，能够使用裂隙灯显微镜进行常规眼部检查，排除角膜接触 镜的常见禁忌证。 第 2 楼 知识要求 一、裂隙灯显微镜眼部常规检测程序和内容 裂隙灯显微镜检查应该使用不同的照明强度和放大倍率从外向内进行，观察眼睛各部分组织，排除角膜 接触镜禁忌证。 1.裂隙灯检查从外向内基本检查流程 眼睑?睑缘?睫毛?泪器?泪膜?结膜?结膜囊?角膜?角巩膜缘?前房?前房角?虹膜?瞳孔?后房 ?晶状体。 2.裂隙灯检查顺序 先检查右眼，后检查左眼，并记录检查结果。要求如下: (1)眼外观 32 1)面对被检查者，观察是否双眼突出，是否有一眼突出，如诊为突眼性甲状腺肿或眼眶肿瘤，则需慎戴角膜接触镜。 2)观察眼位，评估被检查者向前平视时，视线指向是否一致，如诊为斜视或眼球震颤，则需考虑其对戴 角膜接触镜的影响。 3)观察眼睑形态和瞬目情况，评估双睑在静态和动态时是否对称，瞬目时眼睑是否关闭完全，严重的眼 睑关闭不全极易导致软镜脱水，不宜戴角膜接触镜。如瞬目迟缓(少于12次/min)也易发生眼干和软镜脱水。 此外还应注意睑裂大小，睑裂过小可使戴镜发生困难。 (2)眼睑 观察眼睑、睑缘及睫毛有无异常。如果检查时发现异常，不宜戴角膜接触镜，因一方面会引起不适，另 一方面也有可能加重原有疾病，所以均应嘱戴镜者治愈后再配戴角膜接触镜。 (3)泪器泪液 观察泪点、泪液、泪阜有无异常。如有异常，不宜戴角膜接触镜。 (4)球结膜 正常球结膜应为无色透明，其下的腺样层呈淡灰色。通过裂隙灯显微镜观察球结膜有无发红、有无炎 症。 (5)睑结膜 翻转上下眼睑，观察睑结膜的色泽、透明度，注意其下的血管和睑板腺。 (6)角膜 观察角膜直径、弯曲度、表面光滑度，注意有无角膜水肿、混浊、新生血管、瘢痕等。 (7)前房和房水 33 观察前房有无异常，观察前房深浅、房角宽窄，注意有无房角粘连，房水有无混浊。 (8)虹膜和瞳孔 观察虹膜的色泽、纹理，注意是否有虹膜色素异常现象。 (9)晶状体 观察晶状体的位置、形态、各部分透明度，注意晶状体前囊有无色素等沉着物。 第 3 楼 二、角膜接触镜的主要禁异证 1.眼部禁忌证 (1)各种原因引起的泪液质量不良，干眼症(或泪液分泌不足)，急、慢性泪囊炎，睑缘炎和重度沙眼， 麦粒肿，炎性霰粒肿，上睑下垂、睑内翻、倒睫等。 (2)角膜、结膜的急、慢性炎症，结膜结石，急、慢性色素膜炎，角膜溃疡，重度角膜血管翳。 (3)巩膜炎，浅层巩膜炎，严重的晶状体及玻璃体混浊，急、慢性青光眼。 (4)弱视，视神经及视路疾病导致的矫正视力不良。 (5)眼外伤史等。 2.全身禁忌证 (1)急、慢性副鼻窦炎。 (2)过敏性鼻炎发病期。 (3)、严重的糖尿病。 34 (4)正在使用皮质类固醇、阿托品类等对角膜接触镜有影响的药物。 (5)类风湿性关节炎等胶原性疾病。 (6)精神病。 (7)高血压、肾病等全身病症。 (8)过敏体质，震颤麻痹。 (9)妊娠时出现内分泌紊乱。 (10)其他全身系统性严重疾病。 3.个体条件禁忌证 1)老年、年幼或因残疾不能操作镜片。 2)个人卫生不良，及不依从配戴规则等。 3)职业禁忌，如潜水等。 4)心理上对接触镜不接受。 4.环境条件禁忌证 生活环境有灰尘及烟雾等严重污染，工作环境有酸碱及挥发性化学物质等。 第 4 技能要求 一、操作准备 1.检查者洗净双手。 35 2.将室内光线调暗。 3.使被检查者取舒适坐姿(可适当升降操作台)。 4.被检查者先把下颌放在下颌托上，调整眼睛的高度，使其外眦部与额托架纵杆黑色刻度线平齐。 5.被检查者前额顶住托架的前额横挡，睁眼向前注视目标或注视检查者的前额。 6.分别调节双眼目镜的焦距，可将光线投照于调焦棒或被检查者额部进行调节。 7.调整目镜间距，使检查者可以用双眼同时观察。 第 5 楼 二、操作步骤 步骤1 调整焦面 调节移动手柄控制观察系统与被检眼间的距离，调整焦面以求得清晰的观察效果。可令被检查者闭眼， 在其眼睑皮肤上调整显微镜焦距，然后调暗投照光线，再嘱其睁开双眼进行观察，这样可以避免大量强光直 接照射被检眼。 步骤2 设置放大倍率 调节放大倍率调节钮控制观察图像的放大倍率(通常为6~40倍)。 步骤3 选择滤光镜 毛面滤光镜可提供弥散投照光线，扩大观察视野;黄色滤光镜则可用来观察荧光素染色结果。 步骤4 选择光 36 (1)调节投照光束的宽窄。 (2)选择投照角度。 (3)控制投照亮度。 (4)无赤光用于观察微小新生血管，钴蓝光用于观察荧光素染色的结果和硬质镜片的配适。 第 6 楼 步骤5 全面检查眼部 在检查过程中，通常用左手调节仪器手柄，右手撑开或翻开被检眼的眼睑。按照从外向内的基本检查流 程进行眼部全面检查。 步骤6 眼睑的检查法 (1)在裂隙灯下用弥散投照法观察眼睑、睑缘、睫毛和睑板是否正常。让被检查者向下看时，检查者用 拇指轻轻向上牵引上睑可显示出上睑缘;让被检查者向上看时，检查者用拇指轻轻向下牵引下睑就可显示出 下睑缘。 (2)观察睑裂大小，皮肤松紧度，有无上睑下垂，有无水肿、潮红、溃疡、肿物、增生、变色、色素 痣、干燥等。 (3)观察有无睑缘充血、水肿、肥厚、缺损、畸形、内翻、外翻、皮肤松弛，睑缘处有无分泌物，睑缘 处有无裂伤、肿物等。 (4)观察是否秃睫和倒睫。 步骤7 观察眼位 37 观察眼位有无偏斜，嘱被检查者水平方向左右转动眼位，然后向右上、右下、左上、左下转动眼位，观 察在运动过程中眼位有无明显偏斜。 步骤8 泪器的检查 (1)泪膜的检查 用直接投照法观察泪膜是否完整，泪膜中有无杂质，泪膜的厚度及半月形泪线的高度，观察瞬目后泪膜 破裂时间。 (2)泪道的检查 在检查睑缘时可看到内眦部有一个小眼儿，这个小眼儿叫做泪小点，注意此处有无外翻、内转、闭塞、 分泌物等;压迫泪囊部的皮肤，看有无脓汁溢出，如有则是配戴角膜接触镜的绝对禁忌证。 第 7 步骤9 结膜的检查(见图1-17，彩图1) 38 (1)主要通过直接投照法进行检查。结膜的检查顺序为下睑结膜和下穹窿部结膜、上睑结膜、上穹窿部结膜、球结膜和半月皱壁。 (2)检查下睑及下穹窿结膜时，用手指将下睑向下牵引，同时嘱被检查者尽量向上看，即可暴露下睑结 膜。如同时手指向眼球稍加压力即可暴露下穹窿部结膜。翻转上睑结膜时嘱被检查者向下看，检查者用一手 的食指放在上睑眉下凹处，拇指放在上睑缘中央，两个手指夹住此处的眼睑皮肤，将眼睑向前向下牵引，同 时食指轻轻下压，拇指将眼睑皮肤向上捻转，上睑即被翻开。如此时进一步向上牵引上睑并用拇指将翻转的 上睑缘固定在眼眶上缘，让被检查者尽量向下看，同时用另一手的拇指由下睑外面中央部睑缘下面轻轻向上 后推眼球，上穹窿部的结膜即可完全暴露。 (3)检查球结膜比较容易，用一手的拇指和食指在上下睑缘处稍向上及下方分开睑裂，让被检查者向各 方向转动眼球即可暴露各部分球结膜。如让其充分向颞侧看时，内部的半月皱壁和泪阜即可全部看到。 (4)检查睑结膜时，要注意结膜有无光泽，血管是否清晰、是否充血，有无结石、滤泡、乳头增生、瘢 痕、梗塞，注意异物常停留于上睑板下沟处。 (5)检查球结膜主要应注意查看结膜有无充血出血、贫血、色素增生，表面有 39 无异物、干燥、睑裂斑、 翼状胬肉、淋巴液蓄积。球结膜的充血常有两种，深层者为睫状充血或称角膜周边充血，浅层者为结膜充血 或称结膜周边充血。病变较重时常为混合充血(即结膜充血与睫状充血同时存在，见彩图2)。 第 8 楼 步骤10 角膜的检查 (1)角膜的一般检查 首先观察角膜的直径，垂直径约为10 mm，水平径约为11 mm。其次观察角膜弯曲度，如果发现角膜弯曲 度较大时，可嘱被检查者向下看，若角膜顶点将下睑中央部稍微顶起，并发现角膜变薄，即怀疑其有圆锥角 膜时，应嘱戴镜者做进一步检查(如角膜地形图等)以确诊。同时也应注意角膜是否呈球形、扁平形，角膜有 无薄翳、云翳、斑翳、白斑等。 (2)角膜染色法 最简单的方法是用润眼液或抗生素滴眼液将消毒的荧光素染色试纸尖端湿润，然后将试纸触及结膜囊， 40 令被检查者闭眼转动眼球后再睁眼，在裂隙灯显微镜下观察角膜是否被荧光素所染色，记录其染色的部位、 形态、深浅、面积等(见彩图3)。 第 9 楼 步骤11 记录观察结果 要将观察结果详细、规范地记录在被检查者的病历中，例如“裂隙灯眼前节检查正常”。有异常时需详 细记录异常情况，如“裂隙灯检查双眼上睑结膜轻度充血(，)、乳头增生(，)、滤泡(，)，余未见异常”。 三、注意事项 1.应本着从外向内、从右向左的原则全面检查眼睛各处，根据观察部位和观察目的，调整光线宽窄、光 线强度及放大倍率，必要时加覆滤光片进行观察。 2.应对戴镜者眼部进行全面检查，尽量不要遗漏。 3.角膜接触镜验配前检查、验配后复查时均需通过裂隙灯显微镜对眼睛进行全面检查。注意检查时一定 41 要拉开上睑观察上方球结膜，并翻转上下睑观察睑结膜。 42