宣导泻肺饮对大鼠心肌细胞L型Ca~（2＋）通道电流影响及机制研究

宣导泻肺饮对大鼠心肌细胞L型Ca~（2＋）通道电流影响及机制研究 宣导泻肺饮对大鼠心肌细胞L型Ca~(2，) 通道电流影响及机制研究 ?1O94?中国中医急症2011年7月第2O卷第7期JETCM.Ju1.2011,Vo1.20,No.7 宣导泻肺饮对大鼠心肌细胞L型Ca通道 电流影响及机制研究半 朱浩范晓波贺劲廖艳林杨祥坤 湖北省武汉市中医院(湖北武汉430014) 中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1004—745X(2011)07—1094—03 【摘要】目的用血清药理学的研究宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞L一型钙通道的影响.方法采 用全细胞膜片钳技术记录L一型钙离子通道电流(Ica—L),观察不同浓度的宣导泻肺饮对它们的影响.结果宣 导泻肺饮含药血清对心肌细胞L一型钙离子通道的开放有抑制作用,在浓度10%时Ica—L峰值降低15%,浓 度30%时Ica—L峰值降42%,均呈浓度依赖性;随着药物浓度的增加,电流一电压关系曲线逐渐上移,但出现 电流峰值的电压不变.结论宣导泻肺饮含药血清抑制心肌细胞钙离子通道的开放,具有明显的浓度依赖关 系,可能是其抗心律失常的分子基础. 【关键词】宣导泻肺饮膜片钳全细胞记录心室肌细胞L一型钙电流 StudyofEffectandMechanismofXuandaoxiefeiDecoctiononRatsofL—typeCalciumChannel ZHUHao,FANXiao—bo,HE如Ig,etal WuhanHospitalofTradhionalChineseMedicine,HubeiPro1)ince(Wuhan430014,Hubei) 【Abstract】Objective:TostudytheeffectsofXuandaoxiefeiDecoctiononL-typecalciumchannelinvent ricular myocyte.Methods:TheL—typecalciumcurrent(Ica—L)wasrecordedbythewhole— cellpatchclamptechniqueto observetheeffectofXuandaoxiefeiDecoctionwithdifferenceconcentrations.Results:Theo fL—typecalcium channelwasinhibitedbytheXuandaoxiefeiDecoction.ThepeakofIca-Lwasreduced15%b ytheXuandaoxiefei Decoctionconcentrationwith10%.Andthepeakwasreduced42%bytheconcentrationwith 30%.Abovepeak indiceswereintheconcentration— dependentmanner.Asincreaseofthedecoctionlevel,thecurrent—voltagecurve llftgradually.However,thevoltagewasinvarlantwhenthecurrentpeakexisted.Conclusion: Thattheopeningof /ca—LinventricularmyocyteisinhibitbytheXuandaoxiefeiDecoctionwj山 theobviousconcentration-dependent mannercouldbethemolecularbasisofanti—arryhthmia. 【Keywords】XuandaoxiefeiDecoction;Whole— cellpatchclamptechnique;Myocardium;L-typecalciumcurrent 心律失常是心血管病常见的致死因素,目前缺乏十分有效 的减少心律失常发生的药物.本研究采用全细胞膜片钳记录技 术来观察宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞L一型Ca2+通 道的影响,以探讨宣导泻肺饮含药血清药理作用相关机制. 1材料与方法 1.1材料成年SD大鼠30只,清洁级,体质量200,250g,由 华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.宣导泻肺饮浓缩 液由武汉中医院制剂室提供;小牛血清蛋白(BSA),胶原酶? 型,牛磺酸和氯化铯(CsC1)购自美国Sigma公司;天门冬氨酸 合三一谷氨酸由中国科学院上海生物化学研所提供;其他试剂均 为国产分析纯或化学纯试剂 1.2宣导泻肺饮含药血清的制备SD大鼠随机分为空白血清 组和宣导泻肺饮含药血清组.各15只.含药血清组按0.55g/kg 加蒸馏水3mL,配制成宣导泻肺饮流浸膏药液灌服,每日1次, 连续8d.空白血清组给等体积生理盐水灌胃,方法同含药血清 组.在末次灌胃2h后固定大鼠.眼眶采血.室温下静置30min后 {基金项目:湖北省武汉市卫生局资助项目(武卫200747) 取上清液.25O0r/min离心25min,分离血清,置于56?水浴 30min灭活,过0.221xm孔滤膜滤过除菌,分装.一2O?条件下保 存备用. 1.3心肌单细胞的分离大鼠经苯巴比妥钠麻醉后迅速取出 心脏,立即置冰冷饱和氧的无钙台氏液中进行修剪,然后经主动 脉将心脏悬挂于Langedorff灌流器上.以正常台氏液约8mL连 续灌流5min,然后用无钙台氏液灌流约lOmin至心脏停搏,换 胶原酶液灌流分离心脏单细胞,待心脏变软和膨松变大,心肌里 粉红色半透明时,可以开始取心脏组织.然后用KB液冲洗残酶 约3-5min,最后将心脏从Langendorff装置上取下,剪下心室置 于37?冰箱KB液中剪碎,将取下的心室肌组织放于装有KB 液的试管中,在温育下用粗头吸管轻轻吹打3—5min,使之分散 成单个细胞,经过150,200txm的微孔尼龙膜滤过后于KB液中 室温下(15,25?)静置0.5,1h后复钙,然后进行实验. 1.4玻璃微电极的制备1.20mm玻璃微电极.内径0.9, 1.1mm,壁厚0.10~0.15mm,管长l00mm,应用P一97程控水平微 电极拉制器(USA)经两步拉制,调节两步的时间和速度设置.拉 中国中医急症2011年7月第20卷第7期JETCM.Ju1.2011.Vo1.20.No.7 制出左右两根电极,充灌电极液后,排除尖端气泡备用.一般尖 端电阻为2,4Mn 1.5全细胞膜片钳记录将复钙的细胞悬液加入细胞池中.并 置于倒置显微镜工作台上,待细胞沉底贴壁(5-10min)后,室温 下用台氏液或L型钙通道的细胞外液灌流,流速2,4mL/min.将 充灌电极内液(L型钙通道的电极内液)的玻璃微电极安装在探 头的电极夹持器上.EPC一10double膜片钳放大器系统通过D,A 和A/D转换卡由计算机控制刺激发放和信号的采集.移动 Sutter三维电动显微操作器将略带正压的电极尖端轻压在横纹 清晰的杆状细胞上,轻施负压待吉欧姆封接形成后.正确补偿快 电容的前提条件下,用骤发较大负压吸破细胞膜.小心补偿慢电 容,打开串联电阻补偿,将补偿率调至50%,80%左右.全细胞膜 片记录即告形成. 1.6观察宣导泻肺饮舍药血清对大鼠心室肌细胞ICa—L的影 响心肌细胞完成封接破膜补偿快慢电容及串联电阻后, MODE置向VC后进行ICa—L记录:钳位电位一40mV,以除极化 至0mY,持续200ms的阶跃脉冲激活L一型钙通道(ICa—L):以 从一30mV至+60mV,阶跃+10mV,脉宽为200ms的命令电压钳 制记录峰值工ICa—L的电流一电压曲线;电流峰值以内向峰电流 值与lOOms后电流值之差计算.观察电极外液灌流(对照组)和 宣导泻肺饮含药血清10%.30%的稀释血清后电流幅值和门控 动力学的影响.用异搏定(维拉帕米)可阻断此电流,从而证明此 电流为ICa—L(Cs已将K通道阻断,钳位于一40mVNa通道已失 活). 1.7统计学处理计量资料以(?s)示,采用t检验.P<0.05 为差异有统计学意义. 2结果 2.1分离细胞的形态学ZEISS倒置显微镜(Germany)下可见 单个心室肌细胞星棒状或杆状,细胞膜表面光滑,横纹清楚且排 列整齐.复钙后部分心肌细胞有自发性收缩,短时间内挛缩,变 圆成死亡细胞,而大部分呈静止状态可供做实验使用.获得 60%以上横纹清晰的杆状耐钙活细胞,且可以成活8h以上. 2.2分离细胞的钙电流压钳模式下以l0mV的步长使心室 肌细胞由一40mV的钳位电位逐步去极化至+50mV,刺激持续 250ms,记录到一个缓慢失活的内向电流,在此条件下,钠通道 和T一型钙通道几乎被完全抑制,电极内液中又加入了Cs,可以 消除钾通道电流的影响.在灌流的外液中加入10mmol/L的维 拉帕米可以几乎完全阻断上述的电流.实为慢钙电流. 2_3不同浓度宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞钙通道 电流的影响见表l,图1.不同浓度的宣导泻肺饮含药血清灌 流心室肌细胞5rain明显抑制ICa—L.冲洗后可见ICa—L有所恢 复,其降低无显着差异.不同浓度的宣导泻肺饮含药血清对心室 肌细胞的Ica—L呈浓度依赖性抑制.图1示不同深度的宣导泻 肺饮含药血清作用下的ICa—L电流一电压曲线.可见其形状未 发生明显改变. 3讨论 心律失常的发生与心肌电生理特性异常有关,而心肌电生 理特性又与心肌细胞上的Ca"离子通道密切相关_l_3].目前临床 上使用的抗快速性心律失常西药有4类,除?类属于B受体阻 断剂以外,其余均作用于不同的离子通道,而产生抗心律失常的 作用.目前心血管人工合成药的研究较多,因此人们已将其注意 力转移到天然药物和中药的研究上,且随着分离技术的发展和 ? lO95? 表1不同浓度宣导泻肺饮含药血清对不同电压下大鼠 心室肌细胞ICa—L(pA)的影响(n=6,i) 与对照组,冲洗后比较,}P<0.05.}P<0.01. 电压fmV) 图1不同浓度宣导泻肺饮含药血清作用下Iea—L的电流一电压曲线 提高.抗心律失常中药的研究已经从复方,单味药深入到有效的 单体成分上],现己发现抗心律失常的中药单体有十几种,如: 黄连素,钩藤碱,红花黄素,关附甲素,人参三醇等],从目前对 它们抗心律失常的电生理的研究来看,大多数是属于m类抗心 律失常药. 众所周知,动作电位的去极化(0期)是与Na离子通道开 放,Na+内流有关;而复极化均与,Ca2+通道有关,现在发现与 心肌复极化有关的l(+电流有多种,主要有一过性外向钾电流, 内向整流钾电流和延迟整流钾电流.有报道认为,内向整流钾电 流主要作用维持心肌细胞的静息电位和动作电位3期快速复极 过程,延迟整流钾电流则参与整个复极过程并与ICa一起共同 维持动作电位复极化2期,而细胞内钙超载是心肌缺血,再灌注 损伤的中心环节,对细胞的损伤起关键作用. 宣导泻肺饮是笔者课题组在叶天士经验基础上,加以化裁 用以治疗心悸的经验方,方中主要药物组成为:葶苈子,桑白 皮,杏仁,厚朴,陈皮,莱菔子,猪苓,泽泻,川木通,当归.本方用 药.三焦兼顾,而以葶苈子,桑白皮开宣上焦为君,莱菔子,猪苓 分人中下二焦为臣,余药助君臣之力为佐.诸药合用,宣上和中 渗下,使上宣中和下达,三焦气机通畅,共奏宣导三焦,泻肺豁 痰.活血利水之功.药理研究发现宣导泻肺饮组方中主药葶苈子 有强心作用,使家兔心电图见有P波变低和洋地黄型的双向T 波等[. 本实验利用细胞膜钳技术,进一步在分子水平研究宣导泻 肺饮对Caz+通道的影响,结果表明,宣导泻肺饮对Ca2+通道有抑 制作用.在分离的单个心室肌细胞上所记录到的Ca"电流其特 性.具有电压依赖性,在去极化时被激活.因此推测宣导泻肺饮 可能是通过抑制慢钙通道来缩短APD,APD,从而缩短有效不 应期,发挥其抗心律失常的作用. 本研究证明宣导泻肺饮可抑制电压门控性钙通道的外钙内 流和减少肌浆网的内钙释放,从而减少大鼠心室肌细胞[Ca2+]i, 0啪瑚姗伽湖瑚 一一一一一一一 —皂一堪 中国中医急症2011年7月第2O卷第7期JETCM.Ju1.201l,Vo1.20,No.7 对心室肌细胞产生保护作用. 参考文献 [1]赵兰平,李建东,商爱民,等.腺苷对豚鼠左心室流出道自律细胞 的电生理效应[J].基础医学与临床,201l,31(2):174-178. [2]戴德哉.严重心律失常的相关离子通道病及分子机制探讨[J].生 命科学,2008,20(1):69—75. [31马丽娟,张雨薇,张文杰.大豆异黄酮对过氧化氢诱导大鼠心肌细 胞内钙超载的影响[J].中国老年学杂志,2010,30(16):2313—2315. [4]郭继鸿.抗心律失常中药的应用优势[J].中围循证心血管医学杂 志,2010,2(4):198—201. [5]王春艳,王桂茹,李晶.盐酸小檗碱抗实验性心律失常的研究[J]. 中国老年学杂志,2009,29(6):651-653. [6]王盟,刘卫.钩藤总生物碱的研究进展[J].实用医药杂志,2008,25 (3):360—362. [7]杨红,魏宗德.红花黄色素与心血管疾病的研究进展[J].西南军 医,2009,l1(1):83—85. [8]蒋晓林,孙晓晖,顾宇重.参松养心胶囊治疗老年糖尿病心律失常 的临床观察[J].河北中医,2010,32(7):1046,1048. [9]林启寿.中草药成分化学[M].北京:科学出版社,1977:138. (收稿日期2011一O3—19) (上接第1090页) 表1各组大鼠小肠黏液SIgA,血浆内毒素水平比较(i?s) 与正常组比较,P<0.05,}P<0O1;与对照组同期比较,AP<0.05,?AP< 0.o1.下同. 正常组相比较,对照组大鼠伤后1d,3d黏膜菌群中大肠埃希菌 量均明显增加;治疗组大鼠伤后3d,7d均明显减少,与对照组相 比较.治疗组大鼠伤后1d,3d,7d均显着降低.与正常组相比较, 对照组大鼠伤后黏膜菌群中真菌量均明显增加,以伤后1d,3d 最多:治疗组未见真菌量增加,且明显低于对照组. 表2各组大鼠回盲部黏膜茵群的变化(1gCFU/g.X-~-$) 3讨论 烫伤后,由于创伤而处于应激状态,往往破坏肠上皮细胞间 的紧密连接,导致肠黏膜屏障功能受到损害.其通透性升高.从 而使肠道蓄积的内毒素得以侵人体内,形成内毒素血症.动物 实验结果表明:大鼠伤后1,3d对照组血浆内毒素明显高于正常 组,润通舒灌胃后,大鼠伤后1d血浆内毒素含量即明显降低,3, 7d接近于正常组,提示本方可明显降低内毒素的入侵. 肠道局部免疫功能在烫伤时肠源性感染的发生中起重要的 保护作用,肠黏膜表面黏液层具有重要的生理屏障功能.黏液中 的糖蛋白和SIgA相互配合,将SIgA包绕的细菌牢固地限于黏 液层中,并随黏液层的更新和流动将包绕的有害菌排除体外 本实验结果显示,严重烫伤后,肠黏液SIgA分泌明显受抑,而伤 后大鼠予润通舒灌胃后3,7dSIgA质量浓度接近于正常水平, 提示该方可增加肠道SIgA的合成与分泌,从而改善肠道局部免 疫功能. 正常情况下,肠道菌群通过与肠黏膜附着结合形成生物屏 障,一方面与宿主保持共生关系.提供营养成分或参与免疫系统 的构建;另一方面,使机体免受潜在致病菌的侵袭.在某些情况 下,如严重烧创伤,大手术等,肠道生物屏障遭到破坏,肠内菌群 紊乱,导致细菌或内毒素移位,进一步加重病情{51.肠道生物屏 障99%由厌氧菌组成,而双歧杆菌所占比例最大,在维护肠道 生物屏障方面居主导地位.它既可有效抑制肠杆菌等优势移 位菌的过度增殖,又能够刺激肠道局部免疫功能,使SI合成 和分泌增加,从而发挥其保护生物屏障的作用.本实验中,笔者 观察到烫伤后回盲部黏膜菌群改变显着,表现为双歧杆菌量明 显减少,大肠埃希菌和真菌量成倍增加.但伤后予润通舒灌胃, 在短时间内双歧杆菌量即明显增加,大肠埃希菌和真菌量显着 减少,表明该方可改善肠道菌群的平衡失调. 机体在遭受严重创伤,烫伤时损血失津,致阴亏津少,则血 行涩滞,血脉瘀阻,反过来又影响津血之化生,如此则肠失濡润, 从而导致肠道传输失司,大便燥结,糟粕内停,粪毒滞留,热随毒 生,反过来进一步损血耗津,内伤脏腑,甚至导致脏腑功能衰竭. 润通舒依据中医"六腑以通为用"的理论,提出了滋阴活血润肠 治则,滋阴以助津液,津液输布,肠道得以濡润.传导功能才得以 恢复;活血以改善肠道微循环,降低血管阻力,缓解肠黏膜缺血, 缺氧程度;润肠以防治肠麻痹,保证肠道能及时有效地排除浊质 或浊气,做到治本清源的目的. 参考文献 [1]郑爱华,蔡光先,王银山,等.滋阴活血润肠法对烫伤大鼠肠黏膜 屏障的影响[J].实用中西医结合临床,2008,8(1):2. [2]王忠堂,姚咏明,肖光夏,等.双歧杆菌对烫伤大鼠肠道黏膜机械及 生物屏障的改善作用[J].中国危重病急救医学,2003,15(3):155. [3]张雅萍,王忠堂.B.B.R对严重烧伤大鼠肠道屏障功能的保护作用【J1. 中同微生态学杂志,2002.14(5):250. [4]张雅萍,史政荣.益生菌对烧伤大鼠肠道膜菌群和SIgA的影响『J1 中国微生态学杂志,2004,16(5):259. [5]王忠堂,肖光夏,肖杰,等.双歧杆菌悬液对严重烧伤患者美罗培南 用后肠菌群紊乱的扶正作用[J].中华烧伤杂志,2002,18(3): 111—112. (收稿日期2011-02-23