[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定
异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌
核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及
GISH鉴定
第40卷第3期
2009年5月
海洋与湖沼
0CEAN0L0GIAETLIMNOLOGIASINICA
Vo1.40.NO.3
May,2009
异源精子诱导栉
二倍体早期胚
孔扇(Chlamysfa)雌核发育
胎的细胞学研究及GISH鉴定球
王卫军杨建敏刘志鸿2周丽青2杨爱国2?
(1.1h尔省海洋水产研究所炯台264006;2.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室
中罔水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071)
提要采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6一DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体
抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体
卵子早期胚胎发育过程中的核
相变化进行观察;采用荧光原位杂交(GISH)技术对担轮幼虫期胚胎进行检测.结果显示,紫外线处
理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质
小体(DCB),DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合:GISH检
测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质.实验结果可为研究异精诱
导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据.
关键词异精雌核发育,二倍体,石蜡切片,GISH鉴定
中图分类号Q953
人工雌核发育是用理化方法遗传失活的同源或
异源精子激活卵子,但精子在卵内不形成功能性原
核,仅靠卵细胞发育成只具有母系遗传物质后代的
一
种发育方式.由于雌核发育后代染色体基因位点处
于纯合状态,因而可用于快速建立纯系,并在性别控
制(Avtalionetal,1990),基因一着丝粒重组(Araietal,
1991),自交系建立(吴清江等,1981),克隆(Naruseet
al,1985)等遗传学研究中具有重要意义.
采用组织切片法对雌核发育二倍体的受精过程
进行研究,是荧光显微观察法的有益补充.以前,组
织切片法大多数用于组织方面的研究,在受精过程
方面的应用较少,特别是贝类,卵子较小,切片技术
要求较高.但是经过摸索研究,Li等(2000b)用组织切
片法研究了人工诱导皱纹盘鲍雌核发育卵的细胞学
机理,董迎辉等(2006)运用组织切片法对栉孔扇贝雌
核发育二倍体在受精和第一,第二次卵裂过程中的核
相变化进行了详细观察.
以基因组DNA作为探针的原位杂交技术(GISH)
是研究杂交物种及异缘多倍体物种染色体构成以及
进化的有效手段,它能够有效利用杂交亲本在基因
组水平上的差异,采用荧光标记的方法将杂种细胞
中两套不同的染色体组分开,并使其成为可视.GISH
技术最早应用于动物学方面的研究,并迅速被植物
学研究所借鉴.月前该技术主要广泛运用于农牧业种
属间的杂交中外源DNA的检测和鉴定(Baileyetal,
1993;Kentonetal,1993)及杂交种传代过程中染色体
继承等方面的研究(吉万全等,1992;Kingetal,
1993).在海洋生物杂交育种中运用较少,毕克(2004)”
运用GISH对华贵栉孔扇贝和栉孔扇贝杂交种进行了
研究,吕振明(2006)2)在此基础上对GISH进行了改
同家科技攻关项目,2004BA526BO103号;同家自然科学基金项
目,30600465号;山东省科技攻关项目,
2007GG2HZ05004
号;”』东省博上基金项目,2006BS06010号.王卫军,研究实习员,硕士研究生,E—mail:wwj2530616@163.
com
?通讯作者:杨爱同,研究员,E,mail:yangag@ysfri.ac.cn
1)毕克,2004.杂交扇贝(华贵栉孔扇贝Chlamysnobilis早×栉孑L扇贝C.farreri)的分子细胞遗传学
.
中国海洋大学硕
士学位论文,1,46
2)吕振明,2006.栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗传学分析.青岛:中同海洋大学博土学位论文,90—106
收稿日期:2008—04—15,收修改稿日期:2008—07—16
326海洋与湖沼40卷
进,对栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代从单轮幼虫期
到稚贝进行跟踪检测.
本实验采用紫外线失活的太平洋牡蛎精子,经
6-DMAP诱导获得栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发
育二倍体.运用石蜡切片法对雌核发育二倍体早期胚
胎的核相进行了详细观察,采用GISH法对雌核发育
二倍体鉴定.旨在探明贝类雌核发育产生的细胞学和
遗传学机制,同时为摸索适宜的诱导条件提供实验
依据.
1材料与方法
1,1材料
栉孔扇贝(Chlamysfarreri)于2005年5月取自青
岛志诚水产科技公司,壳高6—8cm,取回后洗刷干
净,仅留雌性个体,暂养于l6?海水中.太平洋牡蛎
(Crassostreagigas)取自青岛胶南琅琊镇附近海区,
壳高11m12crn,暂养于22?海水中,均投喂硅藻.
生物素切口平移(biotinnicktranslationmix)探针
标记试剂盒(Roche,CatalogNo.1745824),
VECTASHIELDMountingMediumwithPropidium
Iodide(PI)(VECTOR,CatalogNo.H—l300).PCR仪
(Eppendorf公司Mastercyclergrandient5331型).
NIKON(E一800)荧光显微镜(FITC/PI滤镜组合).
1,2方法
1.2.1亲贝暂养与精卵收集挑选性腺饱满的雌
性栉孔扇贝,采用阴干升温法催产获得卵子,解剖法获
得太平洋牡蛎精子.用生物计数皿和血球计数板在显
微镜下分别定量精,卵浓度至1.0×10个/ml和1.0X
l0个/ml.
1.2.2紫外线照射精子及染色体二倍体化取精
液2.5ml,平铺于直径为9cm的亲水塑料培养皿中.
将培养皿放于有摇床的紫外线照射装置内,摇床振
动频率为60次/min.紫外灭菌灯(18W,254nm;上海星
星电器有限公司),用UV-B型紫外辐射强度仪(JL京师
范大学生产)测得此处的紫外辐射强度为1500gW/cm2,
参照李雅娟等(2003)的方法照射60s,共照射两次.将
照射后的精子立即加入有100ml卵液的烧杯中,用玻
璃棒搅拌均匀并稀释至200ml.受精卵在水温l8?的
避光条件下培养.设精子不照射的杂交组为对照组
一
.照射组受精后在显微镜下观察到有10%一15%受
精卵排出第一极体时,向处理组施加6一DMAP,使其
终浓度达到60mg/L,持续处理25min,之后用500目
筛绢过滤,洗卯2—3次,移入盛有10L清洁过滤海水
的小桶中培养.设照射受精卵不加6-DMAP的单倍
体照射组为对照组二.
1.2.3受精卵早期发育过程的细胞学观察分别
从两对照组和加倍处理组取样固定,在受精后0—
60min,每隔5min分别取样;60min一四细胞期,每隔
30min分别取样.切片样品的固定和观察方法参考董
迎辉等(2006).
1.2.4对雌核发育二倍体的GISH鉴定染色体
标本的制备参照吕振明(2006)”.制备好的染色体片
子在室温老化2天后放入4?湿盒中保存备用.杂交
前放入37cC烘箱中烘烤2—3h.基因组DNA的提取
按《分子克隆实验指南》(Sambrooketal,2001)的方
法进行.栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组探针采用生物素
缺口平移法标记,具体方法及其纯化参Roche公司提
供的产品说明进行.分别变性加共变性的方法对染色
体标本和探针变性,具体流程为:染色体标本变性:
染色体标本人80?的70%甲酰胺和2XSSC溶液中变
性3min,于预冷的梯度乙醇(70%,90%,lOO%)逐级
脱水,操作在一20?冰箱中进行.探针变性:取lOgl
标记的探针与lOgl去离子甲酰胺一起在95?的水浴
锅中变性5min,迅速转入一20%软冰(15%乙醇溶液冰
冻而成)冷却.共变性:将探针加入到强风吹干后的
染色体标本上,盖上24mmX25mm的盖玻片,封口
膜封好,放入85?烘箱中变性.杂交:将变性后的杂
交液20L加到染色体标本上,盖上盖玻片,37?杂交
过夜.杂交后的染色体标本经50%甲酰胺/2XSSC溶
液和1XSSC溶液洗脱后,FITC染色(20gg/m1),
PI(1.5gg/m1)复染,荧光显微镜观察并拍摄
.
2结果
2.1雌核发育受精卵的核行为
紫外线照射的太平洋牡蛎精子进入栉孔扇贝卵
子内有两种情况:一是精核不发生膨胀,保持凝缩状
态(图1b,c);二是精核膨胀为雄性原核,但是不与雌
原核融合(图ld,e).在用6-DMAP处理后,可以看
到分离的两倍性的雌性原核(图ld,e);到第一次卵裂
早期,两倍性的雌性原核分离,并可以看到一个凝缩
的致密小体(densechromatinbody,DCB)(图10;到
两细胞期和四细胞期时,在卵裂沟处可见凝缩的
1)吕振明,2006.栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗传学分析.青岛:中国海洋大学博上学位论文,90,1O6
3期王卫军等:异源精子诱导栉孔扇贝(Chlamysfarreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定327
DCB(图lg,h).
2.2GISH检测的结果
采用栉孔扇贝基因组DNA作探针,太平洋牡蛎
DNA作封阻,对诱导的栉孔扇贝雌核发育后代的染
色体分裂相进行荧光原位杂交,结果
明,雌核后代
能被栉孔扇贝基因组探针所标记(图2a);而用太平洋
牡蛎基因组标记的探针不能与雌核二倍体后代基因
组杂交,因而显现为红色(图2b),所有这些表明紫外
图1石蜡切片观察异精子栉孔扇贝雌核发育二倍体早期胚胎的核行为
Fig.1Nuclearbehaviorofgynogeneticdiploidinducedbyheterologoussper
mofcfarreribyinhibitingthe
secondpolarbodyusingparaffinsectionmethod
a.精子进入卵子形成精核;b.排出第一极体;C.卵子染色体组形成雌
原核;d—e.精核和二倍性雌原核:
f第一次卯裂早期;g.两细胞期;h.四细胞期
线遗传失活精子成功,没有太平洋牡蛎
染色体进入:该结果表明GISH技术可有
效地用于雌核后代的鉴定.运用栉孔扇贝
基因组标记的探针在统计染色体时,也
同样发现存在非整倍体(图2c,d).
3讨论
3,1DCB的跟踪监测
结合荧光观察结果(王卫军等,2007),
紫外线照射的精子人卵以后,有很少一
部分精子膨胀形成雄原核,大多数一直
保持凝缩状态,并形成一个致密小体
(DcB);董迎辉等(2006)认为有的精子能
膨胀为没有功能的雄性原核,到第一次
卵裂早期形成DCB.作者认为是在紫外
线失活过程中,不同层面的精子失活的
情况不同.如果失活强度较大,但仍可以
进入并激活卵子,这些精子将一直保持
凝缩状态;如果失活强度不大,精子就
可以膨胀,为雄性原核.在实验过程中,
图2GISH检测雌核发育二倍体倍性
Fig.2DetectingploidityofgynogeneticdiploidwithGISH
a.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二倍体染色体=38);b.太平洋牡蛎探
针标记的雌核发育二倍体染色体=38);C.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二
倍体的非整倍染色体(>38);d.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二倍体的非整倍
染色体(n<38)
328海洋与湖沼
发现DCB在第一次卵裂早期,位于雌原核分成的两
组染色体之问,这与太平洋牡蛎(Lietal,2000a),皱
纹盘鲍(Lietal,2000b)雌核发育中的精核行为相似,
与Pan等(2004),董迎辉等(2004)同源诱导栉孑L扇贝
二倍体的观察结果也基本一致.跟踪检测DCB在雌
核发育受精卵中的作用和去向,一直是研究的重点,
作者运用荧光显微观察法和本文中的组织切片法跟
踪检测了第二次卵裂之前的精核去向.结果,两种方
法检测的结果一致,DCB或者位于卵裂沟上或者位于
其中一个卵裂球内,都保持凝缩状态,没有与精核或
雄原核融合.董迎辉等(2004)在观察同源诱导的栉孔
扇贝二倍体时,观察到了四细胞期,与本实验结果相
同.由于组织切片法切片的不确定性,随机性以及观
察时的平面性,使得切片法存在一定的局限性,但结
合荧光显微观察法,可以很好地证明核相的变化.雌
核发育中一系列复杂的问题如DCB对雌核发育卵究
竟有何影响,部分遗传失活的精核是否会与雌原核
发生交换,以及精核与雌原核之间的相互关系,还需
进一步深入研究.
3.2GISH检测雌核发育的可行性
由于GISH技术能够有效地利用远缘杂交亲本在
基因组水平上的差异,采用荧光标记方法将杂种细
胞中两套不同的染色体组分开,目前广泛应用于农
牧业杂交育种的研究中(Baileyetal,1993;Schwar.
zacheretal,1989;吉万全等,1992).毕克(2004)~J:将该
技术引入海洋生物杂交育种,对华贵栉孔扇贝早和
栉孔扇贝进行杂交,运用该技术分析了其子代的
染色体构成,发现存在约有2%的只能被华贵栉孔扇
贝母本基因组探针标记的染色体分裂相.吕振明
(2006)又在该基础上对其实验条件进行研究优化,
并对信号强弱和信号特异性进行了分析,建立了针
对于栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交种分析的最佳GISH流
程,并取得了较好的效果.与毕克(2004)的发现相似,
吕振明(2006).’也在栉孔扇贝和虾夷扇贝正反杂交子
代早期胚胎中也发现了一定比例的母本类型的个体,
并认为可能是雌核发育的结果.本实验中分别运用栉
孑L扇贝基因组探针和太平洋牡蛎基因组探针对栉孔
扇贝雌核发育二倍体进行检测,没有发现太平洋牡
蛎基因组信号,说明在染色体水平上太平洋牡蛎基
因组没有进入栉孔扇贝卵子,也说明紫外线遗传失
活成功.
作者在运用荧光显微观察(乇卫军等,2007)时发
现了一定比例的”异源三倍体”,但GISH检测结果
却没有监测到异源精子信号.推测在四细胞期之前,
有一部分异源精子参与胚胎发育,但随着胚胎发育
的继续进行,到担轮幼虫期或者D形幼虫期之前,这
种”异源三倍体”胚胎逐渐被淘汰而死亡.
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CYToLoGYoFGYNoGENTICDIPLoIDSINDUCEDBYHETERoLoGoUSSPERMIN
SCALLoPC妇
MlRR,ANDGYNoGENETICIDENTIFICATIoNWITHGISH
WANGWei—Jun,,YANGJian—Min’
,LIUZhi—Hong,ZHOULi—Qing,YANGAi—Guo
(1.MarineFisheriesResearchInstituteofShandongProvince,Yantai,26400
6;2.KeyLaboratoryforSustainableUtilizationofMarineFisher—
iesResources,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitu
te,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,266071)
AbstractArtificialdiploidallo—gynogenesisofChlamysfar,rwasinducedusingultravioletfuv)一irradiatedhetero—
genousspermofclosely—relatedevolutionspecies(Crassostreagigas)toact
ivatemeioticdivisionoftheeggsbyblocking
extrusionofthesecondpolarbodyfromfertilizedeggswith6-dimethylaminopurine(6-DMAP);thechromosomewas
doubledbyphysicalorchemicalmethods,andthenall—femaleinheritancew
asobtained.Nuclearbehaviorofitsgynoge—
neticembryoswasobservedonparaffinsection.MaternalhereditarymaterialanditsploiditywerecheckedwithGISH
technique.TheresultsshowedthattheUV-irradiatedspermcouldexpandslightlyafterenteringtheegganddevelopedinto
amalepronucleus,butcouldnotformchromosomesandbecameadensechromatinbody(DCB).Nopaternalsignalswere
detectedbybothC.far,randC.gigasprobes.indicatingthattherewasnopaternalchromosomesparticipateinembryo.
TheresultsshowedthattheUV-irradiatedspermsofC.gigascouldentertheeggsofC.far,randactivatetheeggs.but
failedtodevelopintozygocyte.6-DMAPcouldprohibittheexcursionofthesecondpolarbodytoproducediploids.Cyto—
logicalevidenceofgynogenesisinC.farreriinducedbyheterologousspermwasthereforedemonstrated.
KeywordsAllo—gynogenesis,Diploid,Paraffinsection,GISHidentification