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[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

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[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌 核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及 GISH鉴定 第40卷第3期 2009年5月 海洋与湖沼 0CEAN0L0GIAETLIMNOLOGIASINICA Vo1.40.NO.3 May,2009 异源精子诱导栉 二倍体早期胚 孔扇(Chlamysfa)雌核发育 胎的细胞学研究及GISH鉴定球 王卫军杨建敏刘志鸿2周丽青2杨爱国2? ...
[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定
[doc格式] 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定 异源精子诱导栉孔扇(Chlamys farreri)雌 核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及 GISH鉴定 第40卷第3期 2009年5月 海洋与湖沼 0CEAN0L0GIAETLIMNOLOGIASINICA Vo1.40.NO.3 May,2009 异源精子诱导栉 二倍体早期胚 孔扇(Chlamysfa)雌核发育 胎的细胞学研究及GISH鉴定球 王卫军杨建敏刘志鸿2周丽青2杨爱国2? (1.1h尔省海洋水产研究所炯台264006;2.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室 中罔水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071) 提要采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6一DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体 抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体 卵子早期胚胎发育过程中的核 相变化进行观察;采用荧光原位杂交(GISH)技术对担轮幼虫期胚胎进行检测.结果显示,紫外线处 理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质 小体(DCB),DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合:GISH检 测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质.实验结果可为研究异精诱 导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据. 关键词异精雌核发育,二倍体,石蜡切片,GISH鉴定 中图分类号Q953 人工雌核发育是用理化方法遗传失活的同源或 异源精子激活卵子,但精子在卵内不形成功能性原 核,仅靠卵细胞发育成只具有母系遗传物质后代的 一 种发育方式.由于雌核发育后代染色体基因位点处 于纯合状态,因而可用于快速建立纯系,并在性别控 制(Avtalionetal,1990),基因一着丝粒重组(Araietal, 1991),自交系建立(吴清江等,1981),克隆(Naruseet al,1985)等遗传学研究中具有重要意义. 采用组织切片法对雌核发育二倍体的受精过程 进行研究,是荧光显微观察法的有益补充.以前,组 织切片法大多数用于组织方面的研究,在受精过程 方面的应用较少,特别是贝类,卵子较小,切片技术 要求较高.但是经过摸索研究,Li等(2000b)用组织切 片法研究了人工诱导皱纹盘鲍雌核发育卵的细胞学 机理,董迎辉等(2006)运用组织切片法对栉孔扇贝雌 核发育二倍体在受精和第一,第二次卵裂过程中的核 相变化进行了详细观察. 以基因组DNA作为探针的原位杂交技术(GISH) 是研究杂交物种及异缘多倍体物种染色体构成以及 进化的有效手段,它能够有效利用杂交亲本在基因 组水平上的差异,采用荧光标记的方法将杂种细胞 中两套不同的染色体组分开,并使其成为可视.GISH 技术最早应用于动物学方面的研究,并迅速被植物 学研究所借鉴.月前该技术主要广泛运用于农牧业种 属间的杂交中外源DNA的检测和鉴定(Baileyetal, 1993;Kentonetal,1993)及杂交种传代过程中染色体 继承等方面的研究(吉万全等,1992;Kingetal, 1993).在海洋生物杂交育种中运用较少,毕克(2004)” 运用GISH对华贵栉孔扇贝和栉孔扇贝杂交种进行了 研究,吕振明(2006)2)在此基础上对GISH进行了改 同家科技攻关项目,2004BA526BO103号;同家自然科学基金项 目,30600465号;山东省科技攻关项目, 2007GG2HZ05004 号;”』东省博上基金项目,2006BS06010号.王卫军,研究实习员,硕士研究生,E—mail:wwj2530616@163. com ?通讯作者:杨爱同,研究员,E,mail:yangag@ysfri.ac.cn 1)毕克,2004.杂交扇贝(华贵栉孔扇贝Chlamysnobilis早×栉孑L扇贝C.farreri)的分子细胞遗传学. 中国海洋大学硕 士学位论文,1,46 2)吕振明,2006.栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗传学分析.青岛:中同海洋大学博土学位论文,90—106 收稿日期:2008—04—15,收修改稿日期:2008—07—16 326海洋与湖沼40卷 进,对栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代从单轮幼虫期 到稚贝进行跟踪检测. 本实验采用紫外线失活的太平洋牡蛎精子,经 6-DMAP诱导获得栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发 育二倍体.运用石蜡切片法对雌核发育二倍体早期胚 胎的核相进行了详细观察,采用GISH法对雌核发育 二倍体鉴定.旨在探明贝类雌核发育产生的细胞学和 遗传学机制,同时为摸索适宜的诱导条件提供实验 依据. 1材料与方法 1,1材料 栉孔扇贝(Chlamysfarreri)于2005年5月取自青 岛志诚水产科技公司,壳高6—8cm,取回后洗刷干 净,仅留雌性个体,暂养于l6?海水中.太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)取自青岛胶南琅琊镇附近海区, 壳高11m12crn,暂养于22?海水中,均投喂硅藻. 生物素切口平移(biotinnicktranslationmix)探针 标记试剂盒(Roche,CatalogNo.1745824), VECTASHIELDMountingMediumwithPropidium Iodide(PI)(VECTOR,CatalogNo.H—l300).PCR仪 (Eppendorf公司Mastercyclergrandient5331型). NIKON(E一800)荧光显微镜(FITC/PI滤镜组合). 1,2方法 1.2.1亲贝暂养与精卵收集挑选性腺饱满的雌 性栉孔扇贝,采用阴干升温法催产获得卵子,解剖法获 得太平洋牡蛎精子.用生物计数皿和血球计数板在显 微镜下分别定量精,卵浓度至1.0×10个/ml和1.0X l0个/ml. 1.2.2紫外线照射精子及染色体二倍体化取精 液2.5ml,平铺于直径为9cm的亲水塑料培养皿中. 将培养皿放于有摇床的紫外线照射装置内,摇床振 动频率为60次/min.紫外灭菌灯(18W,254nm;上海星 星电器有限公司),用UV-B型紫外辐射强度仪(JL京师 范大学生产)测得此处的紫外辐射强度为1500gW/cm2, 参照李雅娟等(2003)的方法照射60s,共照射两次.将 照射后的精子立即加入有100ml卵液的烧杯中,用玻 璃棒搅拌均匀并稀释至200ml.受精卵在水温l8?的 避光条件下培养.设精子不照射的杂交组为对照组 一 .照射组受精后在显微镜下观察到有10%一15%受 精卵排出第一极体时,向处理组施加6一DMAP,使其 终浓度达到60mg/L,持续处理25min,之后用500目 筛绢过滤,洗卯2—3次,移入盛有10L清洁过滤海水 的小桶中培养.设照射受精卵不加6-DMAP的单倍 体照射组为对照组二. 1.2.3受精卵早期发育过程的细胞学观察分别 从两对照组和加倍处理组取样固定,在受精后0— 60min,每隔5min分别取样;60min一四细胞期,每隔 30min分别取样.切片样品的固定和观察方法参考董 迎辉等(2006). 1.2.4对雌核发育二倍体的GISH鉴定染色体 标本的制备参照吕振明(2006)”.制备好的染色体片 子在室温老化2天后放入4?湿盒中保存备用.杂交 前放入37cC烘箱中烘烤2—3h.基因组DNA的提取 按《分子克隆实验指南》(Sambrooketal,2001)的方 法进行.栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组探针采用生物素 缺口平移法标记,具体方法及其纯化参Roche公司提 供的产品说明进行.分别变性加共变性的方法对染色 体标本和探针变性,具体流程为:染色体标本变性: 染色体标本人80?的70%甲酰胺和2XSSC溶液中变 性3min,于预冷的梯度乙醇(70%,90%,lOO%)逐级 脱水,操作在一20?冰箱中进行.探针变性:取lOgl 标记的探针与lOgl去离子甲酰胺一起在95?的水浴 锅中变性5min,迅速转入一20%软冰(15%乙醇溶液冰 冻而成)冷却.共变性:将探针加入到强风吹干后的 染色体标本上,盖上24mmX25mm的盖玻片,封口 膜封好,放入85?烘箱中变性.杂交:将变性后的杂 交液20L加到染色体标本上,盖上盖玻片,37?杂交 过夜.杂交后的染色体标本经50%甲酰胺/2XSSC溶 液和1XSSC溶液洗脱后,FITC染色(20gg/m1), PI(1.5gg/m1)复染,荧光显微镜观察并拍摄. 2结果 2.1雌核发育受精卵的核行为 紫外线照射的太平洋牡蛎精子进入栉孔扇贝卵 子内有两种情况:一是精核不发生膨胀,保持凝缩状 态(图1b,c);二是精核膨胀为雄性原核,但是不与雌 原核融合(图ld,e).在用6-DMAP处理后,可以看 到分离的两倍性的雌性原核(图ld,e);到第一次卵裂 早期,两倍性的雌性原核分离,并可以看到一个凝缩 的致密小体(densechromatinbody,DCB)(图10;到 两细胞期和四细胞期时,在卵裂沟处可见凝缩的 1)吕振明,2006.栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗传学分析.青岛:中国海洋大学博上学位论文,90,1O6 3期王卫军等:异源精子诱导栉孔扇贝(Chlamysfarreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定327 DCB(图lg,h). 2.2GISH检测的结果 采用栉孔扇贝基因组DNA作探针,太平洋牡蛎 DNA作封阻,对诱导的栉孔扇贝雌核发育后代的染 色体分裂相进行荧光原位杂交,结果明,雌核后代 能被栉孔扇贝基因组探针所标记(图2a);而用太平洋 牡蛎基因组标记的探针不能与雌核二倍体后代基因 组杂交,因而显现为红色(图2b),所有这些表明紫外 图1石蜡切片观察异精子栉孔扇贝雌核发育二倍体早期胚胎的核行为 Fig.1Nuclearbehaviorofgynogeneticdiploidinducedbyheterologoussper mofcfarreribyinhibitingthe secondpolarbodyusingparaffinsectionmethod a.精子进入卵子形成精核;b.排出第一极体;C.卵子染色体组形成雌 原核;d—e.精核和二倍性雌原核: f第一次卯裂早期;g.两细胞期;h.四细胞期 线遗传失活精子成功,没有太平洋牡蛎 染色体进入:该结果表明GISH技术可有 效地用于雌核后代的鉴定.运用栉孔扇贝 基因组标记的探针在统计染色体时,也 同样发现存在非整倍体(图2c,d). 3讨论 3,1DCB的跟踪监测 结合荧光观察结果(王卫军等,2007), 紫外线照射的精子人卵以后,有很少一 部分精子膨胀形成雄原核,大多数一直 保持凝缩状态,并形成一个致密小体 (DcB);董迎辉等(2006)认为有的精子能 膨胀为没有功能的雄性原核,到第一次 卵裂早期形成DCB.作者认为是在紫外 线失活过程中,不同层面的精子失活的 情况不同.如果失活强度较大,但仍可以 进入并激活卵子,这些精子将一直保持 凝缩状态;如果失活强度不大,精子就 可以膨胀,为雄性原核.在实验过程中, 图2GISH检测雌核发育二倍体倍性 Fig.2DetectingploidityofgynogeneticdiploidwithGISH a.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二倍体染色体=38);b.太平洋牡蛎探 针标记的雌核发育二倍体染色体=38);C.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二 倍体的非整倍染色体(>38);d.栉孔扇贝探针标记的雌核发育二倍体的非整倍 染色体(n<38) 328海洋与湖沼 发现DCB在第一次卵裂早期,位于雌原核分成的两 组染色体之问,这与太平洋牡蛎(Lietal,2000a),皱 纹盘鲍(Lietal,2000b)雌核发育中的精核行为相似, 与Pan等(2004),董迎辉等(2004)同源诱导栉孑L扇贝 二倍体的观察结果也基本一致.跟踪检测DCB在雌 核发育受精卵中的作用和去向,一直是研究的重点, 作者运用荧光显微观察法和本文中的组织切片法跟 踪检测了第二次卵裂之前的精核去向.结果,两种方 法检测的结果一致,DCB或者位于卵裂沟上或者位于 其中一个卵裂球内,都保持凝缩状态,没有与精核或 雄原核融合.董迎辉等(2004)在观察同源诱导的栉孔 扇贝二倍体时,观察到了四细胞期,与本实验结果相 同.由于组织切片法切片的不确定性,随机性以及观 察时的平面性,使得切片法存在一定的局限性,但结 合荧光显微观察法,可以很好地证明核相的变化.雌 核发育中一系列复杂的问题如DCB对雌核发育卵究 竟有何影响,部分遗传失活的精核是否会与雌原核 发生交换,以及精核与雌原核之间的相互关系,还需 进一步深入研究. 3.2GISH检测雌核发育的可行性 由于GISH技术能够有效地利用远缘杂交亲本在 基因组水平上的差异,采用荧光标记方法将杂种细 胞中两套不同的染色体组分开,目前广泛应用于农 牧业杂交育种的研究中(Baileyetal,1993;Schwar. zacheretal,1989;吉万全等,1992).毕克(2004)~J:将该 技术引入海洋生物杂交育种,对华贵栉孔扇贝早和 栉孔扇贝进行杂交,运用该技术分析了其子代的 染色体构成,发现存在约有2%的只能被华贵栉孔扇 贝母本基因组探针标记的染色体分裂相.吕振明 (2006)又在该基础上对其实验条件进行研究优化, 并对信号强弱和信号特异性进行了分析,建立了针 对于栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交种分析的最佳GISH流 程,并取得了较好的效果.与毕克(2004)的发现相似, 吕振明(2006).’也在栉孔扇贝和虾夷扇贝正反杂交子 代早期胚胎中也发现了一定比例的母本类型的个体, 并认为可能是雌核发育的结果.本实验中分别运用栉 孑L扇贝基因组探针和太平洋牡蛎基因组探针对栉孔 扇贝雌核发育二倍体进行检测,没有发现太平洋牡 蛎基因组信号,说明在染色体水平上太平洋牡蛎基 因组没有进入栉孔扇贝卵子,也说明紫外线遗传失 活成功. 作者在运用荧光显微观察(乇卫军等,2007)时发 现了一定比例的”异源三倍体”,但GISH检测结果 却没有监测到异源精子信号.推测在四细胞期之前, 有一部分异源精子参与胚胎发育,但随着胚胎发育 的继续进行,到担轮幼虫期或者D形幼虫期之前,这 种”异源三倍体”胚胎逐渐被淘汰而死亡. 参考文献 王卫军,杨爱国,刘志鸿等,2007.异源精子诱导栉孔扇贝雌 核发育早期胚胎发育及其倍性分析.上海水产大学, 16(5):414—420 吉万全,张学勇,wangR等,1992.小偃麦部分双二倍体及其异 附加系异源染色体的GISH分析.遗传,26(2):163—167 李雅娟,毛连菊,李霞等,2003.太平洋牡蛎人T诱导雌核 发育精子遗传失活的初步研究.大连水产学院,18(2) 1O9一ll3 吴清江,陈荣德,叶玉珍等,1981.鲤鱼人丁雌核发育及其作 为建立近交系新途径的研究.遗传,8(1):50—55 董迎辉,杨爱国,刘志鸿等,2004.6-DMAP诱导栉孑L扇贝雌核 发育二倍体的细胞学观察.高技术通讯,14(增fib:343— 348 董迎辉,杨爱国,刘志鸿等,2006.栉孑L扇贝正常发育和人T 雌核发育二倍体早期胚胎核行为的细胞学观察.水产学 报,30(1):29—35 AraiK,FujinoK,SeiNetal,1991.Estimatingrateof gene-.centromererecombinationatelevenisozymelociin Salvelinusspecies.BullJpnSocSciFish,57:1043--1055 AvtalionRR,DonJ,1990.Sex?-determininggenesintilapia:A modelofgeneticrecombinationemergingfromsexratioie— sultsofthreegenerationsofdiploidgynogeneticOreo- chrom~aureus.JFishBio1.37:167—173 BaileyJP’BennettMD,1993.Genomicin’situhybridization identifiesparentalchromosomesinthewidegrasshybrifl× Festylphubbardii.Heredity,71:420--423 KentonA,ParokonnyAS,GlebaYYetal,1993.Characteriza.- tionoftheNicotianatabacumL.genomebymolecularcy— togenetics.MolGenGenet.240:159一l69 KingIPurdieKA,RezanoorHNaL,1993.Character— izingofThinopyrumbessarab&umchromosomesegmentsin wheatusingrandomamplifiedpolymorphicDNAs(RAPDs) andgenomicinsituhybridization.TheorAFplGenet,86: 895—900 LiQ,OsadaM,KashiharaMetaL,2000a.Cytologicalobserva— 1)毕克,2004.杂交扇贝(华贵栉孑L扇贝Chlamysnobil&早×栉孑 L扇贝C.farreri)的分子细胞遗传学分析.中国海 洋大学硕士学位论文,1—46 2)吕振明,2006.栉了L扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗 传学分析.青岛:中国海洋大学博士学位论文,90一l06 3期二E卫军等:异源精子诱导栉孑L扇贝(Chlamysfarreri)l~核发育 二倍体早期胚胎的缃胞学研究及GISH鉴定329 tionsonnuclearbehaviorinnormalandgynogenesl’seggsof thePacificoyster.Crassostreagigas.Suisanzoshoku,48(2): l93—198 LiQ,OsadaM,KashiharaMetal,2000b.Cytologicalstudieson artificiallyinducedgynogenesisinthePacificabalone. FisheriesScience,66(4):701—707 NaruseK,ljiriK,ShimaAelal,1985.Theproductionofcloned fishinthemedakarOryziaslatipes).JExpZoo1.236:335— 341 PanLiQ,YuRHetal,2004Inductionofgynogeneticdip— loidsandcytologicalstudiesinthezhikongscallop,Chlamys r”.AquatLivingResour,17:20l一206 SambrookJ.RussellDw.2001.MolecularCloning:ALabora— toryManua1.ColdSpringHarborLaboratoryPress,461—— 5l2 SchwarzacherT,LeitchAR,BennettMDetal,1989.Insitu locationofparentalgenomesinawidehybrid.AnnBot,64: 3】S一324 CYToLoGYoFGYNoGENTICDIPLoIDSINDUCEDBYHETERoLoGoUSSPERMIN SCALLoPC妇 MlRR,ANDGYNoGENETICIDENTIFICATIoNWITHGISH WANGWei—Jun,,YANGJian—Min’ ,LIUZhi—Hong,ZHOULi—Qing,YANGAi—Guo (1.MarineFisheriesResearchInstituteofShandongProvince,Yantai,26400 6;2.KeyLaboratoryforSustainableUtilizationofMarineFisher— iesResources,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitu te,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,266071) AbstractArtificialdiploidallo—gynogenesisofChlamysfar,rwasinducedusingultravioletfuv)一irradiatedhetero— genousspermofclosely—relatedevolutionspecies(Crassostreagigas)toact ivatemeioticdivisionoftheeggsbyblocking extrusionofthesecondpolarbodyfromfertilizedeggswith6-dimethylaminopurine(6-DMAP);thechromosomewas doubledbyphysicalorchemicalmethods,andthenall—femaleinheritancew asobtained.Nuclearbehaviorofitsgynoge— neticembryoswasobservedonparaffinsection.MaternalhereditarymaterialanditsploiditywerecheckedwithGISH technique.TheresultsshowedthattheUV-irradiatedspermcouldexpandslightlyafterenteringtheegganddevelopedinto amalepronucleus,butcouldnotformchromosomesandbecameadensechromatinbody(DCB).Nopaternalsignalswere detectedbybothC.far,randC.gigasprobes.indicatingthattherewasnopaternalchromosomesparticipateinembryo. TheresultsshowedthattheUV-irradiatedspermsofC.gigascouldentertheeggsofC.far,randactivatetheeggs.but failedtodevelopintozygocyte.6-DMAPcouldprohibittheexcursionofthesecondpolarbodytoproducediploids.Cyto— logicalevidenceofgynogenesisinC.farreriinducedbyheterologousspermwasthereforedemonstrated. KeywordsAllo—gynogenesis,Diploid,Paraffinsection,GISHidentification
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