微量元素锌在豆芽中与富集研究论文

微量元素锌在豆芽中与富集研究论文 Research on Accmulation Characteristics of Trace Zinc in Bean Sprout A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Masterof Science By Yang Qi Supervised by Prof. Liu Chenglun Major: Food Science College of Chemistry and Chemical Engineering of Chongqing University, Chongqing, China April 2011 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘 要 锌作为人体必需微量元素之一，对维持人体的正常生理功能具有重要的作用。 本文在综述了锌的存在形态、锌的生物学功能、人体对锌的吸收、富锌食品的研 究开发现状以及锌的分析方法的基础上，采用铋膜修饰玻碳电极，结合超声波技 术和差分脉冲溶出伏安技术，对豆芽中微量锌测定进行了探索，建立了超声辅助- 铋膜修饰玻碳电极差分脉冲溶出伏安法测试锌含量的新方法。另一方面，采用浸 泡方式的添加外源锌，利用绿豆的发芽过程实现对锌元素的生物富集，制备出富 锌绿豆芽。本论文主要工作如下: ?采用在线同步镀铋的方法制备铋膜电极，将超声波与差分脉冲溶出伏安相结 合，快速简便地测定了豆芽中锌的含量。在优化的实验条件下，锌的溶出特征峰 为-1.14V(vs.SCE)，线性范围为 10,400μg/L，线性方程为 I=0.0576C+1.1113，相 关系数为 r=0.9986，方法的检出限为 0.8μg/L。固定 Zn2+浓度 200μg/L，平行测定 10 次，RSD=3.17%。与传统的差分脉冲伏安法相比，超声波使锌的溶出峰电流增 加近一个数量级，提高了方法的灵敏度。该方法用于自来水样以及豆芽中锌的测 定，均具有良好效果，与原子吸收光谱法测定结果一致。 ?通过研究豆芽的生长状况、锌的吸收富集情况、有机锌转化情况以及对豆芽 SOD 酶系统活性的影响，确定最佳的培养条件。综合考虑豆芽发芽过程中的生长 状况、锌的吸收富集情况、有机锌的转化情况、对豆芽 SOD 酶系统的影响以及结 合世界卫生组织推荐的 2.2mg 锌日摄入量，最终得到最佳的锌培养浓度为 75mg/L。 通过建立锌的新型检测方法和研究豆芽对锌的吸收富集规律，为电化学方法 应用于微量元素的检测和人体补锌提供更为有效的方法以及在食品中的应用提供 了一定的参考价值。 关键词:豆芽，微量锌，铋膜电极，差分脉冲溶出伏安法 I 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 ABSTRACT Zinc is one of the essential trace element and it plays an important role in maintaining the normal physiological function of human.This paper reviewed about the existing forms of zinc, biological function of zinc, absorption of zinc and research status on the zinc-rich food, as well as the methods of detection of zinc. The new method for the rapid detection of zinc was established by using bismuth film modified glassy carbon electrode as working electrode, combined with differential pulse stripping voltammetry and ultrasonic techniques. On the orther hand, zinc-rich bean sprout was prepared by zinc bioaccumulation on mung bean in the process of germination. The main work of this thesis is as follows: ?Trace zinc in bean sprout was determined by sono-differential pulse stripping voltammetry on a synchronously plated bismuth film electrode. Under the optimized experimental conditions, the characteristic peak of Zn2+ was got at -1.14V(vs.SCE). The linear range for detection was 10, 400μg/L and equation was expressed as I=0.0576C+1.1113, r=0.9986, the detection limit was 0.8μg/L, and RSD was 3.17% through 10 parallel determinations. Comparing to the traditional different pulse voltammetry, stripping peak current of Zn2+ was increased near to one order of magnitude and the sensitivity was improved by the sono-voltammetry. This method could be used to detect Zn in tap water and bean sprout samples with good results,which were quite corresponding to the value obtained by atomic absorption spectrometry. ?The optimal culture condition was obtained by the study on the growth of bean sprout, the absorption and accumulation of zinc, organic zinc transformation and the effect on SOD enzyme activity. Considering about the above factors and the recommended daily intake of zinc (2.2mg), the optimum concentration of zinc culture medium was gained 75mg/L finally. The establishment of a new detection method of zinc and the research on the absorption and accumulation of zinc on bean sprout provided a certain reference value for the application of electrochemical technique to the detection of trace element and effective method of zinc supplement. Keywords: Bean Sprouts, Trace zinc, Bismuth Film Electrode, Differential Pulse Stripping Voltammetry II 重庆大学硕士学位论文 目 录 目 录 中文摘要.......................................................................................................................................... I 英文摘要.........................................................................................................................................II 1 绪论 .............................................................................................................................................. 1 1.1 选背景 ............................................................................................................................... 1 1.2 课题研究的目的及意义 ....................................................................................................... 2 1.2.1 植物中锌的存在形态 ................................................................................................ 2 1.2.2 人体对锌的吸收 ........................................................................................................ 2 1.2.3 锌的生物学功能 ........................................................................................................ 2 1.2.4 锌的人体需求量 ........................................................................................................ 4 1.2.5 富锌食品的开发 ........................................................................................................ 4 1.2.6 锌分析测定方法研究现状 ........................................................................................ 5 1.3 主要研究内容 ....................................................................................................................... 8 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 ....................................................... 10 2.1 实验材料和仪器 ................................................................................................................. 10 2.1.1 实验材料 .................................................................................................................. 10 2.1.2 实验仪器 .................................................................................................................. 11 2.2 实验方法 ............................................................................................................................. 11 2.2.1 溶出伏安法原理 ...................................................................................................... 11 2.2.2 铋膜电极的制备及电极预处理 .............................................................................. 14 2.2.3 锌的差分脉冲溶出伏安测试 .................................................................................. 17 2.3 结果与讨论 ......................................................................................................................... 18 2.3.1 电极的选择 .............................................................................................................. 18 2.3.2 超声作用下锌的溶出伏安行为 .............................................................................. 18 2.3.3 底液及其 pH 值的选择 ........................................................................................... 19 2.3.4 镀铋条件参数的优化 .............................................................................................. 20 2.3.5 操作参数的优化 ...................................................................................................... 23 2.3.6 共存离子的干扰 ...................................................................................................... 25 2.3.7 工作曲线和检出限 .................................................................................................. 25 2.3.8 实际样品中锌的检测 .............................................................................................. 26 2.4 本章小结 ............................................................................................................................. 27 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 ............................................................................ 29 III 重庆大学硕士学位论文 目 录 3.1 实验材料与仪器 ................................................................................................................. 29 3.1.1 实验材料 .................................................................................................................. 29 3.1.2 实验仪器 .................................................................................................................. 29 3.2 实验方法 ............................................................................................................................. 29 3.2.1 富锌绿豆芽的制备方法 .......................................................................................... 29 3.2.2 富锌豆芽生长状况评价 .......................................................................................... 30 3.2.3 富锌豆芽中总锌及有机锌含量的测定 .................................................................. 30 3.2.4 豆芽 SOD 酶活性的测定 ........................................................................................ 32 3.3 结果与分析 ......................................................................................................................... 33 3.3.1 豆芽的生长状况及分析 .......................................................................................... 33 3.3.2 富锌豆芽中总锌含量的分析 .................................................................................. 34 3.3.3 富锌豆芽中有机锌含量的分析 .............................................................................. 35 3.3.4 富锌豆芽 SOD 酶活性的分析 ................................................................................ 36 3.3.5 富锌豆芽的安全性分析 .......................................................................................... 37 3.4 本章小结 ............................................................................................................................. 37 4 结论与展望 ............................................................................................................................ 39 4.1 结论 ..................................................................................................................................... 39 4.2 后续研究工作的展望 ......................................................................................................... 39 致 谢....................................................................................................................................... 41 参考文献....................................................................................................................................... 42 附 录....................................................................................................................................... 47 A.作者在攻读学位期间发的论文目录 ................................................................................ 47 IV 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 1 绪论 1.1 选题背景 锌是人体必需微量元素之一，参与多种酶的合成，其体内含量在微量元素中仅 次于铁。在生物体内，锌主要存在于蛋白质和各种金属酶中，参与生物体内的各 种代谢过程，它对维持人体的正常生理功能，增强免疫力，促进身体与智力发育 具有重要的作用[1-3]。当人体缺乏锌时，容易引发包括心血管系统、免疫系统、神 经系统等多种疾病[4]。目前世界范围内普遍存在着锌摄入量不足，包括美国、加拿 大等一些发达国家也是如此。如何科学补锌，提高人类生命质量，预防和降低疾 病发生是一件刻不容缓的大事。 人们对于科学补锌的探索从未停止过，锌制剂的开发也由从最初的无机锌补剂 到现在的有机锌补剂。有机锌补剂在毒理安全性、生理活性和吸收率上都具有一 定的优越性[5,6]。比较我们日常的主要食品的锌含量，动物性食物的锌含量高于谷 类、豆类食物，谷类、豆类食物又高于水果和蔬菜[7]。由于我国人群每日摄入的食 物仍以谷类和豆类为主，所以谷类、豆类食物是人体锌摄入的重要来源。然而， 天然食物中的锌含量普遍较低，一般不足以满足人体的正常需要，因此，利用谷 类、豆类这一生物体将无机锌进行有机化，是获得有机锌的有效途径。 研究表明，大豆对锌具有较强的生物富集能力。从营养学上讲，豆类含有多种 氨基酸，尤其是人体所必需又不能自行合成的氨基酸，而且蛋白质的含量高达 40%，是一种优质的植物蛋白[8]。豆类营养丰富，具有很好的保健功能，在人们的 膳食中又占有很大的比重，同时在我国的栽培范围比较广泛。因此，利用大豆作 为植物性食物补锌的载体，不仅原料易得，符合人们日常的膳食习惯，而且也容 易被广大消费者所接受[9]。大豆经过发芽后，其体内多种维生素被释放出来，大大 提高了豆芽的营养利用率和营养价值。本实验正是以大豆作为原材料，通过不同 浓度的锌培养液浸豆，在适宜的温度，及一定的工艺条件下，利用大豆发芽过程 的生物转化，将胞外的无机锌源吸收到生物体内实现对无机锌的富集，同时，无 机锌也被同化到有机大分子上，从而得到一种类似于天然产物的有机锌产品。 对于锌元素的检测，目前主要的方法有分光光度法、原子吸收光谱法、电感 耦合等离子体原子发射光谱法等。分光光度法设备简单，成本低，但是方法的检 出限高。而原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法等，具有很好的 检出限，但仪器价格昂贵，使用范围受到一定限制。电化学方法因具有设备简单、 分析速度快、灵敏度高、选择性好等优点在分析领域中显示出很大的潜力和优越 性。本文将超声技术与差分脉冲溶出伏安技术相结合，简便、快速地测定了豆芽 1 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 样品中的锌。同时，以铋膜电极代替汞膜电极为工作电极，可避免汞对环境的污 染。 1.2 课题研究的目的及意义 1.2.1 植物中锌的存在形态 锌的存在形式主要有以下几种:无机态锌，如氧化锌、硫酸锌、氯化锌等;简 单的有机酸锌，如葡萄糖酸锌、柠檬酸锌等;锌的氨基酸、蛋白络合物，如蛋白 质螯合锌、赖氨酸锌等[10]。汪等[11]将植物中的锌分为 4 种形态:水溶态、醇溶态、 酸溶态和难溶态。 在植物中锌没有化合价的变化，主要是以 Zn2+的形态被植物吸收转运。叶片中 的锌大多是以低分子化合物、金属蛋白以及自由离子的形式存在，但也有少部分 和细胞壁结合形成不溶态。植物中 58%到 91%的锌是可溶的，可溶态锌是植物中 起生理作用的主要锌形态，通常也是反应锌丰缺的较好指标[12]。在种子或谷粒中， 锌与其它矿质元素一样，以独立的颗粒状或球状晶体的蛋白质体形式存在。此外， 锌还与氯离子、磷酸根、硝酸根等形成可溶性或难溶性的络合物或盐类形式存在 [13,14] 。 1.2.2 人体对锌的吸收 锌在体内主要以有机结合态的形式进行吸收、转运、储存和利用。无机锌只有 当其转化为有机态时才能被机体所利用。因此，无机锌的生物学效价取决于它转 化成有生物活性的有机锌的能力。有机锌在消化道内存在稳定，不与纤维素、植 酸等形成阻碍吸收的复合物，因此能够更有效的被吸收，并转化成具有生物化学 功能的形式[14]。 锌可以与食物或生物体内的许多化合物生成稳定的络合物，锌的吸收会受到 这些组分的影响，包括不同的植物成分、其他的锌络合配体、黏膜上锌载体之间 对锌的竞争反应，以及其他金属离子对配体的争夺[7]。食物中众多成分都可提供与 锌结合的配体，有些可改善锌的吸收，另一些则不能。膳食中吡啶酸促进锌吸收， 膳食植酸盐、膳食纤维、钙、3 价铁可抑制锌的吸收。食物中大部分锌与蛋白质和 核酸结合，一般处于稳定的络合状态，需要消化作用使锌能够被利用，故膳食中 蛋白质是影响锌营养状况的重要因素之一[7]。 1.2.3 锌的生物学功能 ?酶的重要组成 锌与多种酶的结构及功能密切相关。人类认识的第一个锌的金属酶是 Keilen 和 Mann 在 1938 年分离和提纯的碳酸酐酶[7]。随着酶和蛋白质鉴定技术的发展， 现已鉴定出的各类含锌金属酶和锌依赖酶超过 200 种。锌在这类酶中的主要功能 2 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 可归纳为催化、结构和调节作用[7,15](见表 1.1)。 表 1.1 几种主要含锌酶及作用 Table1.1.Role of main zinc containing enzyme 含锌酶 主要作用 碳酸酐酶 维持机体酸碱平衡和 CO2 的释放 羧肽酶 催化水解多肽链含羧基末端氨基酸 乳酸脱氢酶 催化丙酮酸加氢还原为乳酸 超氧化物歧化酶 清除机体内自由基 碱性磷酸酶 碱性环境中水解有机磷酸酯类化合物，促进磷酸钙在骨 骼沉积 催化 DNA 的合成 DNA 聚合酶 催化基因的转录过程 RNA 聚合酶 血管紧张素转化酶 催化血管紧张素 I 转化为血管紧张素 II 和使缓激肽失活 ?调节细胞分化和基因表达 锌是核酸的丰富组分，能稳定 DNA、RNA 和核糖体的结构，核酸合成和降解 的关键是锌依赖酶，包括不同的锌金属酶、参与 DNA 合成限速酶等，广泛地参与 核酸和蛋白质的代谢，调节细胞的分化和基因表达，影响细胞复制等基本过程。 锌可以通过键合于 DNA 骨架链上的磷酸基团和核苷的碱基而稳定 DNA 双螺旋结 构，缺锌时干扰正常染色质的重组及基因的表达，影响细胞的分裂和分化。有研 究报道，锌可以促进 DNA 从左手 B 构型向左手 Z 构型转变，而 Z-DNA 具有与基 因表达有关的调节功能[7,15,16]。 ?维持细胞膜的结构和功能 在细胞膜质中，锌主要结合在细胞膜含硫、氮的配基上，少数结合在含氧的 配基上，构成牢固的复合物，从而维持细胞膜稳定，防止组织损伤，对屏障功能、 转运功能和受体结合都有影响。缺锌可能造成膜的氧化损伤，结构变性，膜酶活 性、通透性改变，以及膜内载体和运载蛋白的功能改变。体外研究实验表明，锌 缺乏将影响血管内皮细胞膜的屏障功能，补充锌屏障功能可恢复[1]。 ?参与机体免疫过程 锌直接参与机体细胞免疫和体液免疫过程锌是淋巴细胞一种非特异性有丝分 裂原，能使淋巴细胞的有丝分裂增加，T细胞数量增多，活性增强，从而对人体免 疫起到调节作用。缺锌将导致胸腺素活性降低，影响淋巴细胞的分化和成熟;锌 缺乏还严重影响B细胞在骨髓中的发育，显著降低T细胞功能，抑制巨噬细胞膜上 3 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 的ATP酶，减弱其趋化作用，从而削弱机体的免疫功能[1,2,7]。 ?对生长发育的作用 锌参加唾液蛋白构成，锌缺乏可导致味觉迟钝，食欲减退，还可引起口腔黏 膜增生及角化不全、半衰期缩短而易于脱落;锌与人的视觉有关，参与维生素 A 还原酶和视黄醇结合蛋白的合成，缺锌时人体中维生素 A 降低，视力减弱;锌促 进身体正常发育，保持正常的生理功能，缺锌导致生长发育停滞、智力低下、性 器官发育不全[4,17]。 1.2.4 锌的人体需求量 美国全国科学研究委员会推荐半岁以内婴儿每人每天需锌3mg，1岁以内5mg， 1,10岁儿童每天10mg。11岁以后至成年均需15mg。妇女妊娠期每天增加5mg，哺 乳期增加10mg。中国营养学会推荐的每日膳食中锌的供给量与美国相似，但儿童 从10岁起便每日增加15mg，而孕妇和乳母均每天只增加5mg。 1.2.5 富锌食品的开发 目前，微量元素锌的生物转化主要有三种方法:微生物合成转化法、植物天然 合成转化法、动物转化法。微生物合成转化法最常见的是酵母转化法，是通过将 含有微量元素锌的溶液加入到培养基中，从而得到高富含锌元素的酵母。应用微 生物合成转化法的还有螺旋藻、乳酸菌或其它食用菌。植物天然合成转化法应用 较多的是麦芽转化法, 它是以富含微量元素锌的培养液使植物种子发芽，起到富集 和生物转化作用。动物转化法是将一定元素的锌盐类化合物加入动物的饲料中, 从 而使无机态的元素锌转化成有机态的元素锌[6]。 ?富锌酵母 通过微生物发酵方法制备的富锌酵母，具有生物活性高、毒性小、生产成本 低等特点，并且能同时补充一定量的氨基酸，是一种有较好应用前景的生物有机 锌补充物。孔林[18]等以紫外诱变配合驯化的方法获得富锌酵母HB524，富锌总量 达130mg/L，其中47.84 %的锌是以有机态形式结合。王战勇[19]等通过在培养基中 添加Zn2+的方法制备富锌酵母，并对富锌酵母和未富锌酵母样品中的17种氨基酸含 量进行了分析，结果表明富锌酵母中各种氨基酸的含量大多高于未富锌的酵母样 品。红酵母除了具有一般酵母的特点外，还含有以虾青素为主的类胡萝卜素，具 有较高的营养价值。刘兴平[20]等报道了用红酵母SCLI富集锌，研究锌离子浓度、 氮源对红酵母生长和富锌量的影响，富锌的最佳条件是以尿素为氮源，Zn2+浓度 0.0275mol/L。 ?富锌食用菌 食用菌含有丰富的蛋白质、氨基酸及多糖等，具有食用和药用价值，提高人 体免疫力、抗肿瘤、防衰老等保健功能，对其进行富锌研究具有独特的意义。黄 4 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 仁术，李耀亭[21]以金针菇F19为出发株，通过测定金针菇诱变及富锌前后EST、POD 两种同工酶的变化进而揭示金针菇的富锌机理。结果发现，12min处理使菌丝体生 物量减少了5.14 %(p>0.05)，但富锌量提高了18.78%(p<0.01);在连续3代的 遗传稳定性实验中，菌丝体生物量为 1.324, 1.419g/100ml ，富锌量为 49.78, 50.45mg/g;高锌通过提高EST、POD的合成和活性来促进有机锌的转化和菌丝体 的生长。秦义[22]等运用Plackett- Burman设计对影响灵芝富锌率的营养因子进行筛 选，并在此基础上, 利用响应面法(RSM)优化了富锌灵芝发酵培养基，提高了灵 芝的富锌率，最大富锌率为27.06%。 ?富锌藻类 藻类不仅含有丰富的蛋白质、维生素等多种生理活性物质，还是一类高效的 生物吸附剂，能富集许多微量元素，具有高效、经济、选择性好的特点，可用于 医疗保健食品的研制。魏新林[23]等研究了活体螺旋藻、死体螺旋藻和螺旋藻粉对 锌的吸附能力，结果螺旋藻粉吸附Zn2+能力大于死体螺旋藻和活体螺旋藻，在pH 值为6，螺旋藻粉浓度为1g/L，锌浓度为0.06g/L时，吸附率达到最大50%，此研究 为提高螺旋藻的营养价值及富锌螺旋藻产品的研制与开发奠定了基础。 ?富锌蔬菜 蔬菜是人们日常饮食中不可缺少的食物，如果摄食蔬菜时又具有补锌的效果， 意义重大。目前进行富锌的蔬菜有白菜、大豆、豆芽等。徐磊[24]进行的盆栽试验 表明，在一定的浓度范围内，土施或叶面喷洒锌后，白菜积累锌明显增加，锌增 加量基本与增施量呈正相关，土施和叶面喷洒的最大锌积累量分别为123、404 mg/kg。黄新江[25]等菠菜和甘蓝耐锌与富锌能力的研究表明，当施锌量为500kg/亩 时，即土壤速效锌分别为602mg/kg和612mg/kg时，菠菜和甘蓝的鲜物产量与对照 相比无显著差异，它们体类含锌量都随土壤速效锌的增加而显著提高。 1.2.6 锌分析测定方法研究现状 ?分光光度法 分光光度法测定锌的方法有多种， 所需显色剂及测定条件如表1.2。 表1.2 锌的分光光度测定方法 Table1.2 Determination of zinc by Spectrophotometry 显色剂 测定条件 线性范围 备注 参考文献 0,25μg/25ml 5-Br-DMPAP pH=9.0,λmax=556nm r =0.9998 [26] ε=7.74×104L?mol-1cm-1 0.16,0.72μg/L 十二烷基苯磺酸钠-亚 pH=5.95,λmax=668nm r =0.9999 [27] 5 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 显色剂 测定条件 线性范围 备注 参考文献 甲基蓝-溴化钾 检出限4.0ng/L (DBS-MB-KBr) 2-羟基-3-羧基-5-磺酸 pH=11.0，乳化剂OP 0,0.3mg/L r =0.9996 [28] 基苯重氮氨基偶氮苯 ε=1.66×105L?mol-1cm-1 (HCSDDA) 4,4’-二偶氮苯重氮氨 0,8μg/25ml pH=11.0，TritonX-100, ε=1.63×105L?mol-1cm-1 [29] 四硼酸钠 基偶氮苯(BBDAB) 0,12μg/25ml 5-Br-PADA P pH=8.5,TritonX-100 ε=1.29×105L?mol-1cm-1 [30] r =0.9993 0,0.8μg/ml 4L?mol-1cm-1 ε=2.519×10OP-52Br-PADAP pH=5.7 [31] 4-(2-吡啶偶氮 )-邻苯 0,25μg/25ml ε=6.66×10pH=5.7,λmax=494nm 4L?mol-1cm-1 [32] 二酚(PAPC) 过氧化氢氧化二甲酚 0,5.2μg/ml λmax=690nm ε=1.52×104L?mol-1cm-1 [33] 橙 检出限0.13μg/ml 1-(2- 吡 啶 偶 氮 )-2- 萘 0,25μg/ml λmax=550nm，表面活 ε=5.26×104L?mol-1cm-1 [34] 酚(PAN) 性剂SDBS 检出限0.01μg/ml 四硝基卟啉(TNPP) 0,10μg/ml pH=5.7, λmax=536nm r =0.9836 [35] ε>105 L?mol-1cm-1 此外，L.K. Shpigun[36]等提出流动注射分光光度法测定锌，分析速度快，1h内 可对90个样品进行检测。魏良[37]等将在线浓缩与流动注射分光光度法联用，建立 了在线自动测定水体中痕量锌的新方法。该方法使用自动化仪器，灵敏度高，选 择性好，线性范围宽(2.0,360μg/L) ，检出限低(0.42μg/L)，且不用有机溶剂萃取， 可用于现场快速、在线自动分析。 ?原子吸收光谱法 原子吸收分光光度法是指以气态的自由原子对于同种原子发射的特征光谱具 6 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 有吸收现象为基础的光谱分析方法。林建原[38]等应用非完全消化-悬浮液进样相结 合的样品前处理技术，用火焰原子吸收光谱法(FAAS)测定海产品中的锌，该方法 简便、快速，样品处理时间短。程先忠[39]等报道了用微波消解技术对酵母粉样品 进行前处理，原子吸收光谱法测定其中的铜锌等5中微量元素，相对标准偏差为 3.65%。微波消化样品的方法不仅省试剂，污染少，且待测样品不易损失。 0.54%, Dimosthenis L. Giokas[40]等直接以PAN为络合剂，采用FAAS法对水样中的锌进行测 定，测定结果与石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)基本一致。 ?原子荧光法 原子荧光光谱法通过测定待测元素的原子蒸汽在辐射下所产生的荧光而对样 品进行分析。目前使用最多的是氢化物发生原子荧光，就是元素氢化物发生之后 形成的气态氢化物用原子荧光仪器来检测，具有灵敏度高、检出限低等优点。蒋 晓凤 [41]采用顺序注射双道原子荧光光谱法测定环境水样中锌，锌在 20.0μg/L, 200μg/L范围内线性良好，检出限为1.76μg/L。 ?电化学法 电化学分析方法因其具有设备简单、分析速度快、灵敏度高、选择性好等优 点在金属元素分析中显示出很大的潜力和优越性。包括离子选择电极法、极谱法、 溶出伏安法、电位溶出分析等，其中应用得最广的是极谱法和溶出伏安法。李巧 云和闫月荣[42]研究了在HCl-KSCN底液中用单扫描示波极谱法连续测定五味子、榛 蘑中铜和锌的方法。锌于-1.03V( vs.SCE)处产生一敏锐的二阶导数波，检出限为 0.01μg/mL，线性范围为0.01,10.00μg/mL。J.F. van Staden[43]等提出了一种灵敏度 较高，在没有表面活性物质干扰下的流动体系中测定锌的新方法，该法不涉及复 杂样品处理，操作方便。Ki-Won Cha[19]等以悬汞电极为工作电极，吸附阴极溶出 伏安法测定锌，最低检出限为30 ng /mL。Ziying Guo[44]等用铋膜电极代替汞膜电极， 采用玻碳电极同位镀铋阳极溶出伏安法测定紫云英中锌，结果峰形好、灵敏度高、 -9 峰电流值大 ,检测限为 9.6×10 mol/ L。李俊华 [45]等以羧基化多壁碳纳米管 (c-MWCNT) 修饰碳糊电极为工作电极,建立了无汞和高灵敏测定痕量锌的新方 法。电富集100s时，检出限可达1.0×10 -13 mol/L。Giacomo Dugo[46]等采用微分电位 溶出法测定食用植物油中的Zn2+，该法不需要对样品进行前处理，简化了操作程序。 ?其他方法 电感耦合等离子体质谱( ICP- MS) 是近十几年来发展最快的无机痕量分析技 术之一。易于进行多元素同时分析且检出限低(一般比ICP-AES低2-3个数量级)。 李磊和谢明勇[47]将微波辅助溶样/萃取(MAP)与电感耦合等离子体质谱( ICP- MS) 联用，建立了对青钱柳叶及其浸提物中锌等多种矿质元素同时测定的方法，结果 令人满意。毛细管电泳(CE)是一种发展迅速且高效的分离技术，具有多种模式， 7 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 毛细管离子分析法(CIA)是用于小分子离子分析的一种新模式。舒友琴和童岩[48]用 CIA法对人发中钙和锌进行了测定，在10 mmol/L咪唑、10 mmol/L α-羟基乙酸、pH 4.0的电泳介质中, 两离子在10min内实现了分离，锌的检出限为0.2 mg/L。反相液 相色谱因其固有的高选择性，可将光度分析中选择性极差但灵敏度很高的显色剂 用作柱前衍生组试剂，可同时分离离子型、分子型及其混合物。赵永光[49]等报道 了用二甲酚橙作柱前衍生试剂，在C18色谱柱上,以乙腈-水(12:88)作流动相，六次 甲基四胺为对离子试剂，反相离子对高效液相色谱法快速分离测定人发中痕量锌 和铜，Zn2+的检出限为0.01ng/ml。 1.3 主要研究内容 本论文主要研究以绿豆芽为富锌载体，采用浸泡方式添加不同浓度的无机锌 溶液，通过绿豆的发芽过程实现对锌元素的生物富集，制备出富锌绿豆芽，并促 进绿豆芽把生物利用度低的无机锌转化成为人体易吸收的、毒性小的有机锌化合 物，为人体补锌提供更为有效的方法以及在食品中的应用奠定必要的研究基础。 同时，以铋膜电极代替汞膜电极为工作电极，结合超声技术和差分脉冲溶出伏安 技术测定水样及豆芽中的锌，该方法操作简便、快速、灵敏度高，具有广阔的应 用前景。 本论文一方面可以提高豆芽自身的食用价值和营养价值，开拓我国传统菜肴 和食疗品种研究的新思路，填补目前国内外在豆芽生物富锌领域研究的空白和不 足，弘扬我国传统的食疗珍品，另一方面也为电化学方法应用于微量元素的检测 奠定必要的科学基础。 主要研究内容如下: ?以铋膜修饰玻碳电极为工作电极，将超声技术与差分脉冲溶出伏安法相结 合，优化测定方法的参数。采用三电极系统:Ag/AgCl 电极为参比电极，铂丝电极 为辅助电极，铋膜修饰玻碳电极为工作电极;溶液为锌标准液;测试方法采用超 声辅助-差分脉冲溶出伏安法，并对底液的选择及其 pH、铋离子浓度、富集电位和 富集时间、清洗电位和清洗时间、静置时间以及脉冲幅值、脉冲宽度、脉冲周期、 采样宽度等操作参数进行优化选择。在最佳的实验条件下，进行测试。 ?富锌绿豆芽的制备工艺。富锌绿豆芽的制备工艺流程为:挑选绿豆?锌溶 液浸豆?发芽?采集?清洗?干燥?研磨?富锌豆芽。首先用清水洗豆，将漂浮 的豆种除去，挑选颗粒饱满的大豆，采用不同浓度的硫酸锌溶液浸泡处理，并设 一对照组。浸豆 12h，待种子吸饱锌培养液后，设置温度 22,25?，置于黑暗处 培养 5d，每天早晚浇水。 ?富锌豆芽生产情况测试。分别于豆芽生长的第 1、3、5 天，采集各实验组 8 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 的豆芽样品，并记录其芽长、重量，培养 5d 后停止发芽，测定发芽率，并对照分 析结果。 ?豆芽锌含量的测定。分析测定富锌豆芽中总锌、有机锌的含量。分析讨论不 同浓度的锌溶液处理对豆芽总锌含量的影响以及有机锌转化规律的影响。 ?豆芽 SOD 酶活性的测定。分析测定不同锌处理浓度对豆芽 SOD 酶活性的影 响。 ?根据实验结果，优化得出豆芽富锌培养的最佳处理条件。 9 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 2.1 实验材料和仪器 2.1.1 实验材料 表 2.1 实验所用试剂 Table 2.1 Reagents used in experiment 实验材料 产地 纯度 铁氰化钾 分析纯 西安化学试剂厂 硫酸锌(七水) 分析纯 重庆吉元化学有限公司 乙醇 分析纯 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 冰醋酸 分析纯 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 乙酸钠 分析纯 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 氯化铵 化学纯 重庆北碚化学试剂厂 氨水 分析纯 重庆川东化工有限公司化学试剂厂 硼酸 分析纯 重庆博艺化学试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 磷酸二氢钾 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 氯化钠 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 氯化钾 分析纯 上海化学试剂总厂 硝酸钾 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 硝酸铋 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 无水氯化钙 分析纯 国营重庆无机化学试剂厂 氯化镁 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 硫酸锰 分析纯 重庆博艺化学试剂有限公司 硫酸铜 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 硫酸铝 分析纯 重庆北碚化学试剂厂 氯化铬 重庆川东化工有限公司化学试剂厂 分析纯 硫酸铅 重庆北碚化学试剂厂 分析纯 硝酸 分析纯 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 硫酸 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 分析纯 盐酸 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 分析纯 高氯酸 分析纯 重庆市川东化工有限公司化学试剂厂 10 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 2.1.2 实验仪器 表 2.2 实验所用主要仪器 Table 2.2 Main instruments used in the experiments 仪器名称 型号 产地 电化学工作站 上海辰华仪器有限公司 CHI620C 电子天平 上海衡平仪器仪表厂 FA1004 型 酸度计 上海大中分析仪器厂 pHS-3C 恒温干燥箱 上海圣欣科学仪器有限公司 DHG-9037A 超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 AS2060B 型 工作电极:玻碳电极 天津艾达恒晟科技发展有限公司 d=4mm 参比电极:饱和甘汞电极 天津艾达恒晟科技发展有限公司 辅助电极:铂丝电极 上海辰华仪器有限公司 1*5 本论文涉及到的电解池是 25mL 小烧杯，其上置有适当大小的橡胶塞，用于固 定三电极系统，电解池中各电极位置如图 2.1 所示。 图 2.1 电解池示意图 Fig.2.1 The illustration of the electrolytic cell 2.2 实验方法 2.2.1 溶出伏安法原理 近年来，溶出伏安法因其低成本、高灵敏度的优点在分析领域显示出其极大 地优越性，是检测痕量金属的一种有效技术，被广泛应用于环境、临床以及食品 11 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 中各种样品的检测[50]。该方法的高灵敏度是由于它结合了有效的预富集步骤以及 先进的测量方法，从而得到了理想的信噪比。 溶出伏安法(StrippingVoltammetry，SV)又称反向溶出极谱法，是在极谱分析基 础上发展起来的，是一种将电解沉积与电解溶出两个过程相结合的电化学测定方 法[51]。溶出伏安法分为两个过程:首先是在一定电位下将被测离子预先电解沉积 在电极上，然后通过反向扫描电极电位，使已沉积的物质电解溶出，记录溶出过 程中的伏安曲线，该曲线称为溶出伏安曲线。溶出曲线中峰电流的大小与溶液中 被测金属离子的浓度，电解富集时间，电解时溶液的搅拌速度等因素有关。在一 定条件下峰电流与被测金属离子的浓度成正比，而峰电位则与被测离子的性质有 关[52]。 电解沉积过程相当于一个浓缩富集的过程，被测金属离子从较大体积的溶液 中被沉积到小体积的电极上，其浓度大大提高，因而在溶出过程中能产生较大的 电流。所以溶出伏安法具有较高的灵敏度，最低检测限可达到 10-12g/dm3。在实际 操作过程中，为了提高电解富集效率，可使电极旋转或搅拌溶液，从而加快被测 物质输送到电极表面的速率，被测物质富集的量与电解富集电位、电解富集时间、 电极面积以及搅拌速率等有关[53]。因此在溶出伏安法实验中要严格控制上述实验 条件。 在电解溶出过程中，应当使溶液保持静止。根据溶出时电位的扫描方向，溶 出伏安法可以分为两种类型。在电解富集时，工作电极作为阴极，溶出时向阳极 方向扫描，这种方法称为阳极溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammetry，ASV)， 常用于金属离子的测定。反之，电解富集时工作电极作为阳极电解富集，然后向 阴极方向扫描，则称为阴极溶出伏安法(Cathodic Stripping Voltammetry，CSV)。该 类方法可用于某些阴离子的测定[54]。 ?差分脉冲溶出伏安法 溶出伏安法在溶出过程中的电位扫描方式可以采用线性扫描，也可以采用差 分 脉 冲 的 方 式 扫 描 ， 而 差 分 脉 冲 溶 出 伏 安 法 (Differential Pulse Stripping Voltammetry，DPSV)具有更高的灵敏度和分辨率。差分脉冲溶出伏安法是在溶出 过程中，在缓慢线性变化的直流扫描电压上，叠加小振幅的矩形脉冲电位，如图 2.2(a)(b)所示为差分脉冲阳极溶出伏安法和阴极溶出伏安法的扫描电压曲线。 12 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 图 2.2 DPASV 和 DPCSV 扫描及采样示意图 Fig.2.2 The scanning and sampling processes about DPASV and DPCSV 对于差分脉冲阳极溶出伏安法(DPASV)，当直流电压扫描达到离子的氧化电 位之后，由于电极反应已经产生，故所加的脉冲电压就使电极产生脉冲氧化电流， 而又因这一电流是离子氧化产生的，属于法拉第电流行 iF，法拉第电流随时间下 降的速度很慢，是以 t-1/2 关系下降的。在施加脉冲电压的时候，同时对电极上的双 电层也有充电作用，因而产生脉冲电容电流 iC，电容电流是以 e-t/RC 关系下降的。 式中 t 为施加脉冲的时间延迟，RC 为溶液电阻与双电层电容的乘积即时间常数， 电容电流比法拉第电流的下降速度要快很多，因此经过一定的时间延迟，电容电 流几乎衰减为零，而法拉第电流仍然很大。这时采样的电流是已经除去了电容电 流的法拉第电流，由此信噪比可提高 100 倍左右。差分脉冲溶出伏安法在每次叠 加脉冲前的某一采样时间和脉冲终止前的某一采样时间测量电流，记录两次测量 的电流差值，得到差分脉冲溶出伏安曲线，可以有效的消除溶氧残余电流等背景 电流的影响，使检测限降低，灵敏度提高[51]。 ?超声-溶出伏安法 超声技术与电化学相结合形成了新兴的超声电化学研究领域。超声在电化学 中的应用主要包括超声电分析化学、超声电化学发光分析、超声电化学合成、超 声电镀等[55-57]。 近年来建立的超声伏安法即在超声存在下进行的伏安法，是研究电化学过程 强有力的工具，其研究主要是基于超声波加快液相传质速度提高检测灵敏度;基 于电极的预处理和活化电极表面，从而提高重现性;以及非均相样品中的超声电 化学分析等。超声增强伏安法的优点有:1)超声辐射能使电极表面附近的电活性 物质及产物的质量传递大大加快。2)超声存在下，电化学反应中电极的吸附将被 减弱。3)超声空化作用形成的高活性自由基如羟基自由基 OH?和氢基自由基 H?改 13 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 变电化学反应的机理。4)超声还能使电极表面连续地活化[55-59]。 传质过程是电化学反应过程中一个非常重要的过程，提高传质过程有利于提 高电化学反应速率，降低槽电压和节约能耗，因此提高电化学反应过程中的传质 过程具有十分重要的意义，图 2.3 为电极表面在超声作用下的传质变化，可以看出 超声波在加快传质速度，提高传质过程表现出一定的优越性[55]。 图 2.3 超声波对电极表面传质的影响 Fig2.3 The effect of ultrasound on mass transfer at electrode surface 超声伏安法在非均样样品分析中具有广阔的应用前景。在在非均相体系中， 由于在超声波的作用下电极表面能不断地被更新，所以电极的钝化作用被减弱。 原理是由于超声波诱导声流动空化，在电极表面和溶液界面液体产生高速的微喷 射流，通过使电极的基体腐蚀进而使电极的钝化作用被减弱。 虽然已经发现的超声波具有增强固-液体系中有效扩散系数，加快传质速度、 增加空化能量等作用。然而，这些增强机制尚不完全清楚。超声电极过程动力学 的研究，有待超声作用机理的深入研究。 2.2.2 铋膜电极的制备及电极预处理 ?铋膜电极的制备 电化学溶出伏安法广泛应用于痕量重金属离子的测定，其工作电极主要为各 种汞电极，如悬汞电极或汞膜电极[50]。由于汞具有很强的毒性，而且在正电位不 能使用，因此其应用受到了很大限制。近年来许多科技工作者致力于研究新型电 极来代替汞电极，如贵金属金电极[60]、膨润土-卟啉修饰碳糊电极[61]、纳米金修饰 玻碳电极[62]、以及生物传感器[63,64]等。2000 年，Wang[65]等研究了铋膜修饰玻碳电 极(Bismuth film electrodes，BiFEs)对重金属离子的溶出伏安法测定，引起了众多电 14 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 分析工作者的浓厚兴趣。在合适的基质电极上沉积铋膜，铋可以和重金属形成类 似于汞齐的合金，具有能够与金属汞基电极相媲美的电化学性质，具有广阔的发 展前景。同时，铋是公认的对环境友好的金属元素，早先已作为药物使用，至今 为止尚未发现有明显的毒性副作用[66,67]。与其它固体电极相比，金属铋膜电极有 以下几方面显著的优点:1)高析氢过电位使阴极还原电位窗口宽，可以对多种金 属离子进行同时分析;2)对溶液中的溶解氧不敏感，因此实验过程中无需预除溶 解氧;3)高的灵敏度，检测下限通常可达 ppb 数量级，甚至更低;4)具有明确 的无形变溶出信号以及优良的分辨率。目前的研究已经将铋膜电极应用于镉、铅、 锌等金属的含量测定，并取得了良好的效果[68-70]。 目前，铋膜电极的制备方法主要有以下三种: 1)在线 / 同位镀铋。在线镀铋方法是最常使用的方法，一般将浓度为 400~1000μg/L 的 Bi3+加入到待测样品溶液中，通过分析过程中和待测离子一同沉 积在电极表面[71,72]。当采用这种方法镀铋时，镀铋的电压和时间是根据具体实验 条件来进行设定的。 在线镀铋的优点是简化了实验步骤，其缺点是具有一定的局限性，比如样品 溶液的 pH 值范围受到限制，必须在酸性条件下进行，因为 Bi3+很容易在中性和碱 性的溶液中发生水解，水解反应如下: Bi3+ + 3H2O Bi(OH)3 + H+ 但也有研究发现 Bi3+在强碱性溶液中没有水解而是与 OH-形成了稳定的络合 物: Bi3+ + OH- Bi(OH)2+ 这种络合物是可溶的并且可以在电极表面沉积，故在强碱性溶液中也可以使 用在线镀铋的方法[73]。 2)预镀铋。是在电极插入样品溶液进行分析测定之前，采用电镀方式沉积铋 膜。尽管文献中所采用的镀铋条件不完全相同[74]，但是大多数是在酸性介质中进 行镀铋(由于铋离子在中性和碱性的溶液中易发生水解)，通常镀铋液的浓度为 Bi3+:5~200mg/L，电镀电压:-0.5~-1.2V，电镀时间为 1~8 分钟，电镀的同时一般 通过搅拌或者旋转的方式来增强溶液的对流[75,76]。 预镀铋方法的优点是比较容易使用，因为镀铋的过程是分离的，可以通过改 变铋离子浓度和操作参数来控制镀铋的过程，缺点是相对于在线镀铋，预镀铋更 加繁琐、耗时。 3)第三种方法是基于铋及其化合物对电极基体的修饰方法，比如 Bi2O3 修饰 玻糊电极[74]。这种方法一般是以碳糊电极为电极基体，而目前也只发现应用在碳 15 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 糊电极表面的例子，其优点是比较容易制备，而且也是唯一不用铋盐镀铋膜的方 法。缺点是在阳极溶出法检测金属离子时效果并不好，比如线性度差以及溶出峰 电位漂移等[77]。 通过对上述三种方法的优缺点进行比较，本论文采用在线镀铋的方法。 ?电极预处理 在所有 sp2 杂化类碳材料中，玻璃碳(Glassy Carbon，GC)因具有宽电化学窗口 和易于修饰、高机械硬度等优点，成为使用最为频繁和最为广泛的一类碳材料基 础电极[73]。电化学分析中，玻碳电极在每次实验之前都需要对其表面进行清洁处 理。目的是为了保持一种清洁、高活性和重现性好的电极表面状态，以便利对电 极加以修饰[78]。 1)机械研磨和抛光 固体电极表面预处理的第一步是进行机械打磨，将抛光至镜面程度。尤其当 电极表面上存在难以除去的堕化层或强吸附层时，必须采用机械或加热的方法处 理，以彻底清除电极表面的污染物[79]。 通常用于抛光电极的材料有金刚砂、ZrO2、MgO、CeO2 以及 α-Al2O3 粉等。抛 光时总是按抛光材料的粒度从大到小的顺序依次进行。本实验中，首先将玻碳电 极在 2000#、3000#金相砂纸上打磨，然后依次用 0.5μm、50nm 的 Al2O3 粉在麂皮 上抛光至镜面, 每次抛光后先用蒸馏水洗去表面污物，再转入超声清洗器中清洗， 每次 2,3 分钟，重复三次，直至电极表面清洗干净。最后依次用用硝酸(1:1)、 乙醇(1:1)、蒸馏水彻底清洗，得到一个光洁平滑的，干净的电极表面。 2)电化学法活化处理 虽然打磨处理的方法比较简单，但打磨后的电极其电化学重现性也受到了一 定程度上的影响，同时方法的灵敏度和电子传导速率也会下降。有报道指出，这 可能与 Al2O3 粉和打磨过程中产生的石墨化碎片残留在电极表面有关[80]。因此，在 一些对灵敏度、重现性以及电子传导速率要求较高的实验研究中，特别在是电分 析检测研究中，仅仅对玻碳电极采取打磨处理的方法已经不能满足实验的高要求， 必需采用进一步的预处理方法来活化电极，改善和提高电极的性能。 在这些前处理方法中，电化学法活化是一种操作简便、快速、可行性强的前 处理方法，且电化学方法本身也具有较高的重现性[81]。经电化学法处理活化后的 玻碳电极，不仅其电极性能得到极大改善，同时，电子转移速率及灵敏度等性质 也有较大程度的提高。经电化学法处理活化后的电极表面通常能够满足电分析测 试中所需的各种要求。研究表明，各种有效的电化学活化方法均采用一个较高的 阳极极化电位，在氧化极化过程中，电极表面的一部分碳以 CO2 的形式被除去 16 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 [73,81-83] 。电化学法活化不仅可以除去残留在打磨的电极表面的石墨碎片及 Al2O3 粉 末，而且还有可能改变了电极表面的本质结构[80]。电极表面新结构的形成及其性 质与电化学法活化所采用的具体条件和处理过程有着密不可分的联系。虽然在一 些以玻碳电极为工作电极的实验中，实验前并未刻意对电极进行电化学活化处理， 但实验过程中往往涉及到一个较高的阳极电位，因此，之后的研究实际上是在已 发生改变的电极表面上进行的。 本实验首先将玻碳电极在 0.5 mol/L H2SO4 底液中，以 0.05V/s 扫速，于-1.00, 0.80 V 范围内进行循环伏安扫描，直至电极的电化学响应曲线达稳定。然后将其 置于 5mmol/L 的 K3Fe(CN)6 及 0.5mol/L 的 KCl 溶液中进行循环伏安扫描，直至出 现稳定的循环伏安图(图 2.4)，使电极表面达到清洁及活化完全。 图 2.4 活化后裸玻碳电极上铁氰化钾的循环伏安图 Fig.2.4 The cyclic voltammogram of K3Fe(CN)6 at bare electrode after activation 2.2.3 锌的差分脉冲溶出伏安测试 在 0.2mol/LHAc-NaAc(pH=5.5)底液中，加入 40μL100mg/LBi3+溶液及适量 的 Zn2+标准溶液。在-1.3V 下超声富集 60s，静止 20s 后，进行差分脉冲溶出伏安 扫描(-1.4,-0.8V)，测定 Zn2+的峰电流。仪器参数为:电位增量 0.004V，振幅 0.05V，脉冲宽度 0.07s，采样宽度 0.0167s。每次测试后，设置电位+0.4V，清洗电 极表面，清洗时间 10s。 17 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 2.3 结果与讨论 2.3.1 电极的选择 在相同试验条件下比较了锌在裸玻碳电极、铋膜电极上的溶出峰(图 2.5)。 从 图中可以看出，锌在裸电极上得到非常小的溶出峰，而在铋膜电极上有灵敏的溶 出峰。且铋膜电极稳定、重现性好，对环境无污染，因此，用铋膜电极能有效地 替代汞膜电极。 图 2.5 锌在裸电极(a)与铋膜电极(b)上的溶出伏安图 Fig.2.5 The stripping voltammograms of Zn2+ at bare electrode (a) and bismuth electrode (b) 2.3.2 超声作用下锌的溶出伏安行为 超声波应用于差分脉冲伏安法，主要是依靠在电极表面形成的空化泡的崩溃 和在界面连续保持空化作用，从而提高电极活性;超声波空化作用形成的高活性 自由基如羟基自基?OH 和氢自由基?H，大量自由基的产生增强了分子碰撞，增加 了活化分子数目, 加速了金属离子的沉积速度。此外，超声空化产生的微射流和冲 击波能够引起溶液强制对流，从而强化了传质，降低了由于浓度梯度引起的过电 位。超声辐射还能连续地使电极表面活化，从而加快反应的速率。 图 2.6 为 200μg/LZn2+在不同条件下的溶出伏安图。从图中可以看出，Zn2+在超 声富集条件下，得到更灵敏、尖锐的溶出伏安峰，峰电流为 14.44μA，较无超声作 用(1.60μA)增大近一个数量级，且其峰电位正移。由此可见，超声波富集可以极大 地提高检测的灵敏度。 18 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 图2.6 200ug/LZn2+在不同条件下的溶出伏安图 Fig.2.6 The stripping voltammograms of Zn2+ at different conditions (a)no ultrasonic radiation (b) ultrasonic radiation 2.3.3 底液及其 pH 值的选择 考察了 Zn2+在醋酸-醋酸钠(pH=5.0)、硼酸-氢氧化钠(PH=6.0)、氨水-氯化 铵(PH=9.0)、磷酸二氢钾(pH=6.5)、氯化钾、硝酸钾、氯化钠(浓度均为 0.2mol/L) 多种底液中的溶出伏安行为。结果发现，在酸性的缓冲溶液中，在线镀铋的效果 较好，原因是因为 Bi3+很容易在中性和碱性的溶液中发生水解。实验结果显示，在 醋酸-醋酸钠体系中，Zn2+溶出伏安曲线峰型最好。 同时，考察了底液 pH 值对峰电流的影响，结果如图 2.7 所示。当缓冲溶液的 pH 值小于 4 时，溶出峰不明显，铋膜在较小 pH 的底液中稳定性降低，铂对电极 上会有大量氢气析出，影响了 Zn 的溶出峰;当 pH 超过 5.5 时，Zn 的峰电流降低 是由于铋膜在较高的底液 pH 中易水解。 综合考虑锌的出峰效果，本实验选择 PH=5.5 的 0.2mol/L 醋酸-醋酸钠溶液作 为底液。 19 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 图 2.7 底液 pH 对峰电流的影响 Fig.2.7 Effect of pH on the peak current 2.3.4 镀铋条件参数的优化 本实验采用在线镀铋的方法制备铋膜电极，考察铋溶液浓度、沉积电位、沉 积时间、清洗时间等因素对峰电流的影响。 ?铋浓度的选择 在线镀铋过程中，固定 Bi3+浓度为 100mg/L，改变 Bi3+用量，考察铋离子用量 对 Zn2+出峰效果的影响，结果如图 2.8 所示。铋膜的存在，有利于 Zn2+的溶出，随 着铋离子浓度的增大，溶出峰电流不断增大，但当用量大于一定值时，峰电流开 始下降，原因是铋浓度增大，铋膜厚度相应增加，从而不利于配合物在膜中扩散 氧化。综合考虑 Zn2+的出峰效果，本实验选择 40μL 作为铋离子溶液的用量。 20 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 图 2.8 铋浓度对峰电流的影响 Fig.2.8 Effect of Bi3+ concentration on the peak current ?富集电位及富集时间对峰电流的影响 以差分脉冲溶出伏安法研究在超声作用下，富集电位在-1.0V到-1.5V范围内, 对Zn2+的峰电流的影响(见图2.9)。随富集电位负移, 溶出峰电流逐渐增大，当富 集电位为-1.3V时，峰电流达最大。考虑到富集电位更负时，容易带来其他金属离 子的干扰，所以本实验选择富集电位为-1.3V。 图2.9 富集电位对峰电流的影响 Fig2.9 The effect of accumulation potential on the peak current 21 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 在富集电位为-1.3V 时，超声辐射下进行富集，改变富集时间，见图 2.10。从 图中可以看出，在 10,120s 之间，随着富集时间的增加，峰电流也逐渐增加。但 沉积时间过长，超声波清洗器中水温升高，影响峰电位及电沉积锌的形态，因此， 本实验选择沉积时间为 60s。 图2.10 富集时间对峰电流的影响 Fig2.10 The effect of accumulation time on the peak current ?静置时间对峰电流的影响 富集过程结束后，分别于 10s,50s 时间内静置，然后进行溶出伏安扫描，观 察静置时间对扫描结果的影响，结果见图 2.11。从图中可以看出，随静止时间的 增加, 峰电流先逐渐增大后减小，静置时间为 20s 时，峰电流达到最大，因此，本 实验选择 20s 为静止时间。 22 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 图2.11 静置时间对峰电流的影响 Fig2.11 Effect of quiescent time on the peak curren 2.3.5 操作参数的优化 正交法是多因素试验与优选法相结合的一种试验设计方法，它不仅符合试验 处理的重复、随机化和局部控制等原则，而且能比较合理地安排多因素试验，分 析试验结果，确定影响试验结果的主要因素及寻求最佳的操作条件。具有可以用 较少的试验次数就能较准确而迅速地找到最佳的试验操作条件的优点。因此，为 了使检测过程在最优的操作参数下进行，本实验采用正交实验对采样宽度、脉冲 宽度、振幅、电位增量等仪器参数进行了优化，各因素及水平如表 2.3，实验结果 见表 2.4。通过对实验结果进行极差法和综合平衡法的分析，确定了操作参数的最 佳条件，而其中极差 R 的大小反映了各因素对峰电流的影响程度。 表2.3 正交试验-因素水平表 Table2.3 Orthogonal experiment-Factos and levers 序号 1 2 3 4 因素名称 电位增量 振幅 脉冲宽度 采样宽度 (E/V) (A/V) (W/s) (S/s) 水平 1 0.003 0.02 0.07 0.0164 水平 2 0.004 0.03 0.11 0.0165 水平 3 0.005 0.04 0.15 0.0166 水平 4 0.006 0.05 0.19 0.0167 水平 5 0.007 0.06 0.23 0.0168 23 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 表 2.4 正交试验-直观分析表 Table2.4 Orthogonal experiment-The intuitive analysis 序号 1 2 3 4 5 电位增量 振幅 脉冲宽度 采样宽度 锌峰电流 因素名称 ip/10-6A (S/s) (E/V) (A/V) (W/s) 实验 1 1 1 1 1 0.822 实验 2 1 2 2 2 1.507 实验 3 1 3 3 3 1.791 实验 4 1 4 4 4 1.773 实验 5 1 5 5 5 1.278 实验 6 2 1 2 3 1.036 实验 7 2 2 3 4 1.549 实验 8 2 3 4 5 1.59 实验 9 2 4 5 1 1.805 实验 10 2 5 1 2 2.427 实验 11 3 1 3 5 1.357 实验 12 3 2 4 1 0.574 实验 13 3 3 5 2 0.471 实验 14 3 4 1 3 2.532 实验 153 5 2 4 1.885 实验 16 4 1 4 2 0.656 实验 17 4 2 5 3 0.413 实验 18 4 3 1 4 2.902 实验 19 4 4 2 5 1.719 实验 20 4 5 3 1 1.821 实验 21 5 1 5 4 0.635 实验 22 5 2 1 5 2.612 实验 23 5 3 2 1 1.781 实验 24 5 4 3 2 0.845 实验 25 5 5 4 3 1.154 1.4342 0.9012 2.259 1.3606 K1j 1.6814 0.931 1.5856 1.1812 K2j 1.3638 1.707 1.4726 1.3852 K3j 24 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 序号 1 2 3 4 5 电位增量 振幅 脉冲宽度 采样宽度 锌峰电流 因素名称 (S/s) (E/V) (A/V) (W/s) ip/10-6A K4j 1.5022 1.7348 1.1414 1.7408 K5j 1.4054 1.713 0.9204 1.7112 Rj 0.3176 0.8336 1.3386 0.5596 对表 2.4 中的实验结果采用极差法和综合平衡法分析，得出如下的定性结论: ?各因素在不同水平的 K 值大小顺序分别为: 电位增量:K2j >K4j>K1j >K5j> K3j 振幅:K4j>K5j>K3j>K2j>K1j 脉冲宽度:K1j>K2j>K3j>K4j>K5j 采样宽度:K4j>K5j>K3j>K1j>K2j ?实验中以峰电流 ip 为主要考察指标，峰电流 ip 越大越好，同时也兼顾峰形以及 峰电位。综合分析得出仪器参数的最优条件为:电位增量 0.004V，振幅 0.05V， 脉冲宽度 0.07s，采样宽度 0.0167s。 ?根据极差的大小，得出各因素对峰电流的影响大小顺序为:脉冲宽度>振幅>采 样宽度>电位增量。 2.3.6 共存离子的干扰 研究了不同浓度的金属离子对于 10μg/L Zn2+测定结果的影响，在给定允许误 差为?5%时，下列物质共存时不干扰:K+(1000)、Na+(1000)、Ca2+(500)、Mg2+(500)、 Mn2+(100)，此外，10 倍的 Cr3+和 4 倍 Cu2+的 Pb2+干扰测定结果。 2.3.7 工作曲线和检出限 分别取 10、50、100、200、300、400μg/LZn2+标准溶液于 25ml 烧杯中，加入 5ml 0.2mol/LHAc-NaAc(pH=5.5)缓冲溶液及 40μL 100mg/L Bi3+溶液。 在上述实验条件下，Zn2+浓度在 10,400μg/L 范围内，溶出峰电流与 Zn2+浓度 呈良好的线性关系(图 2.12)，一元线性回归方程为:I=0.0576C+1.1113，相关系 数为 0.9986。检测限为:0.8μg/L。固定 Zn2+浓度 200μg/L，平行测定 10 次， RSD=3.17%，表明铋膜电极具有良好的重现性和较长的使用寿命。 25 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 2+ 图 2.12 峰电流与 Zn 浓度的关系 Fig.2.12 The relationship between the peak current and the concentration of Zn 2.3.8 实际样品中锌的检测 按上述实验方法对自来水和豆芽样品进行测试，结果见表 2.5。测试结果与原 子吸收发射光谱法一致。且自来水含量较高，主要原因是由于一般水管都是采用 镀锌钢管，在弱酸性 pH 值下，可以和镀锌层发生反应，所以锌含量较高。 表 2.5 样品测定结果 Table 2.5 Determination results of samples 样品 电化学 原子吸收 相对标准偏差(%) Sample DPSV AAS RSD 自来水样 209.3(μg/L) 210(μg/L) 3.2 豆芽样品 23.1(μg/g) 24.5(μg/g) 3.5 对上述样品进行加标回收实验，测定回收率，结果见表 2.6。 26 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 表 2.6 加标回收率实验 Table 2.6 Results of recovery test 样品 加标量(μg/L) 测得量(μg/L) 回收率(%) Sample Added Found Recovery 0 209.3 自来水样 10 219.1 98.0 20 229.8 102.5 0 358.2 豆芽样品 10 368.5 103.0 20 378.1 99.5 2.4 本章小结 本章采用在线镀铋方法制备铋膜电极，将超声波与差分脉冲溶出伏安相结合， 对豆芽中微量锌的测定进行了新的探索。 ?实验中，以峰电流 ip 为主要考察指标，峰电流越大越好，同时兼顾峰形与 峰电位。对测定体系的底液组成及 pH 值、铋浓度、富集时间和富集电位、静置时 间等镀铋条件参数进行了优化选择，并采用正交试验法对操作参数(电位增量、 振幅、脉冲宽度、采样宽度)进行了优化，根据极差分析法莱确定各因素的最佳 条件以及评价对实验结果的影响程度的大小。通过对大量实验测试和数据分析， 最终得出该实验的最佳参数组合。 电极的选择:在相同试验条件下锌在铋膜电极上的溶出峰比在裸玻碳电极的 溶出峰高，铋膜修饰电极提高了 Zn2+在电极上富集的量，提高了电化学响应信号。 超声辐射下锌在铋膜电极上的电化学行为:超声辐射有效地破坏了电极表面 Zn2+的浓度梯度，减小了双电层厚度，提高了富集效率，较大程度地增加了溶出峰 电流。 底液的选择及其 pH 的最佳条件:在 pH=5.5 时，醋酸-醋酸钠体系中，锌离子 的溶出峰形最好。 镀铋条件参数的优化，最佳组合为:铋浓度为 100mg/L，40μL;富集电位-1.3V， 富集时间 60s，清洗电位+0.4V，清洗时间 10s，静置时间 20s。 操作参数的优化，最佳组合为:电位增量 0.004V，振幅 0.05V，脉冲宽度 0.07s, 采样宽度 0.0167s。根据极差分析结果，各因素对 Zn2+的峰电流影响大小顺序为: 脉冲宽度,振幅,采样宽度,电位增量。 ?在最佳参数条件下，Zn2+浓度在 10,400μg/L 范围内，溶出峰电流与其浓度 27 重庆大学硕士学位论文 2 超声辅助差分脉冲伏安法测定豆芽中的锌 呈良好线性关系，一元线性回归方程为:I=0.0576C+1.1113，相关系数为 0.9986。 检出限为:0.8μg/L。固定 Zn2+浓度 200μg/L，用同一支铋膜电极平行测定 10 次， 峰电流 RSD=3.17%，表明铋膜电极具有良好的重现性和较长的使用寿命。 ?利用上述铋膜电极，采用超声-差分脉冲溶出伏安法在最佳条件下简便快速 地测定了自来水样及豆芽中的痕量锌，所得结果与运用原子吸收光谱法测定的结 果一致。 ?与传统汞膜电极相比，铋膜电极在测定过程中更加稳定，电极表面易更新， 重现性好，且铋对环境无毒，是能代替汞膜电极的一种新型友好电极。同时，通 过在富集过程中加入超声波，利用超声波的空化作用加快了电极表面的传质速度， 增强了锌离子的溶出峰电流，有效地提高了富集效率。以此可见，超声波在电分 析中具有具有广阔的应用前景。 28 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 3.1 实验材料与仪器 3.1.1 实验材料 绿豆购自超市;磷酸氢二钠(分析纯，重庆北碚化学试剂厂);磷酸二氢钠(分 析纯，重庆北碚化学试剂厂);NBT(分析纯，上海沪峰生物科技有限公司);EDTA (分析纯，重庆化学试剂总厂);其余试剂同2.1.1所述。 3.1.2 实验仪器 电动离心机(800 型，江苏盐城市科学仪器厂);分光光度计(722 型，上海 棱光技术有限公司);其余仪器同 2.1.2 所述。 3.2 实验方法 3.2.1 富锌绿豆芽的制备方法 环境对豆芽的生长情况以及对锌的生物富集都起着十分重要的作用，适宜的 环境能够促进豆芽的生长发育，不适宜的环境则抑制豆芽的生长。豆芽富锌效果 主要受以下 3 个方面环境因素的影响，培养液锌离子浓度、发芽时间及发芽温度 等。其中，锌培养液的浓度是影响富锌的一个至关重要的因素。适宜的锌浓度， 对豆芽的生长具有促进作用，当锌浓度过大，超出豆芽对锌的耐受范围，将使豆 芽的生长延缓、停止甚至腐烂。而培养液中锌离子浓度太小，则导致对锌的吸收 转化量较小，使富锌豆芽中锌的含量较低。 首先用清水洗豆，除去漂浮的豆种，选取颗粒饱满的绿豆作为豆种，分别于 25mg/L、50mg/L、75mg/L、 100mg/L、150mg/L、200mg/L 的硫酸锌溶液中浸泡 12h，待种子吸饱锌培养液后，置于底铺纱布的带孔塑料盒中，上盖纱布于 22,25? 黑暗处进行培养，每天早晚浇水。分别于豆芽生长的第 1、3、5 天，采集各实验 组的豆芽样品，并记录其芽长、鲜重。培养 5d 后停止发芽，将豆芽取出，用水冲 洗，测定发芽率。将豆芽在 60?下恒温干燥，干燥后的豆芽研磨成粉末状，待测。 富锌绿豆芽的制备工艺流程见图 3.1。 29 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 绿豆 ZnSO4?7H2O 浸泡 22,25?黑暗处培养 清洗 干燥 研磨 富锌绿豆芽 图 3.1 富锌豆芽的制备工艺流程图 Fig.3.1 Flow chart of zinc-enriched bean sprouts preparation 3.2.2 富锌豆芽生长状况评价 分别于豆芽生长的第 1、3、5 天，采集各实验组的豆芽样品，并记录其芽长、 鲜重(取 10 株平均值)，待发芽结束后，对发芽率进行测试，对照分析结果。 3.2.3 富锌豆芽中总锌及有机锌含量的测定 目前测定锌元素的方法有很多种，主要包括分光光度法、原子吸收光谱法、原 子荧光法、电感偶合等离子光谱法、中子活化分析法等，各种联用技术也已经用 于锌的测定及形态分析，但普遍前处理都比较麻烦，且易挥发损失，影响测试结 果。 其中分光光度法、原子吸收光谱法、电感偶合等离子光谱法是最常见的测定 方法。分光光度法设备简单，成本低，但是方法的检出限高。而原子吸收光谱法、 电感耦合等离子体原子发射光谱法等，具有很好的检出限，但仪器价格昂贵。本 论文采用差分脉冲溶出伏安法对锌进行测量，该方法操作简便、快速、灵敏度高、 选择性好，同时通过在富集过程引入超声技术，使检测的灵敏度大大提高。 ?样品的消化方法 生物试样中微量元素多以结合态存在于有机物中，因此在测定前需经物理或 化学处理，也称样品消化，是将试样的有机基质破坏，使试样中所含的痕量元素 30 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 转化成便于测定的离子状态。对于富锌豆芽样品的消化过程主要是将试样中各种 形态的锌转化为 Zn2+。常见的消化方法主要有干法灰化法、湿法消化法、微波消 解法[84]。干法灰化是在一定温度条件下加热，破坏有机物，余下的残留矿物质成 分用溶剂(水或酸)溶解，使被测组分转化为离子状态后测定。其优点是无试剂 污染，不引入外来干扰物质，缺点是消化温度不易控制，而在高温时某些金属易 损失，造成误差。湿法消化也称氧化分解法，是目前溶出伏安分析最常用的样品 处理方法。湿法消化又可以分为回流式、敝口式、空气冷却式烧瓶消化法，其实 质是在加热下，用强氧化剂和强酸混合破坏有机试样，使待测元素以可溶形式存 在。其优点是适应性强，简便、快速，效果好，缺点是在消化过程中会产生大量 酸雾以及氮、硫的氧化物等对人体有害气体，且具有强烈的腐蚀性，危险性大， 需要在良好的通风条件下进行。 为了避免被测组分的损失，本论文中采用湿法消化对豆芽样品进行前处理。 影响消化效果的主要因素有消化液的选择、消化条件的控制以及对消化终点的正 确判断等。合适的消化液对样品消化程度是至关重要的。消化液的选择有很多， 如 HNO3-H2SO4、HNO3-HClO4、HNO3-HClO4- H2SO4 等[84]，本实验选择常用的 HNO3-HClO4 混合酸体系对样品进行消化。 称取 1.0g 富锌豆芽干粉样品置于 50ml 烧杯中，加入 5:1 HNO3-HCIO4 混合酸 10ml，置于通风橱中，在电炉上缓慢加热消化至冒白烟时取出，稍冷，再加入少 量 HNO3 继续消化至溶液澄清透明。消化结束后，将消化液冷却到室温，调节滤液 至 7.0，并稀释、定容至 100mL 容量瓶中，待测。应注意的是在整个消化过程中要 保持各实验组样品间的消化条件平行。 ?总锌含量的测定方法 样品中总锌含量的测定:称取 1.0g 待测样品粉末置于 50ml 烧杯中，加入 5:1 HNO3-HCIO4 混合酸 10ml，置于通风橱中，在电炉上缓慢加热消化至冒白烟时取 出，稍冷，再加入少量 HNO3 继续消化至溶液澄清透明。消化结束后，将消化液冷 却到室温，调节滤液至 7.0，并稀释、定容至 100mL 容量瓶中。移取 10ml 溶液至 25mL 烧杯中，加入 5mL 0.2mol/L HAc-NaAc(pH=5.5)缓冲溶液及 40μLBi3+溶液， 在最优的实验条件下按照上述实验方法对样品锌含量进行测定，通过锌标准曲线 计算出样品中锌的含量。 ?有机锌的测定方法 豆芽中有机锌的含量是评价豆芽富锌效率的重要标准。本论文参照郑乙梅[85] 等人的方法测定富锌绿豆芽的有机锌含量，消化方法有所不同。将 1.0g 样品粉末 加入盛有 10.0mL 蒸馏水的离心管中，每隔一段时间进行彻底的搅拌，静置 12h， 以 3500r?min-1 的转速离心 20min，去除上清液(主要为无机金属离子)，反复操 31 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 作。将离心管中的下层沉淀过滤，干燥后消化，定容，按总锌的测定方法测定有 机锌含量。 3.2.4 豆芽 SOD 酶活性的测定 锌的加入会对豆芽的生理和生化反应造成一定的影响。为了研究锌元素对豆 芽酶系统的影响，本论文选择超氧化物歧化酶(SOD)作为研究对象，研究了锌 的加入对豆芽中 SOD 酶活性的影响，利用比色法检测了经不同浓度锌溶液处理过 的豆芽中 SOD 酶活性，结果见图 3.5。 ?比色法原理 超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物细胞中普遍存在的一种含金属的酶，它 .– 能催化超氧阴离子自由基(O2)的歧化反应，其反应式为: SOD 2O2.- + 2H+ H2O2 + O2 CAT 2H2O2 2H2O + O2 SOD 与过氧化氢酶、过氧化物酶等酶协同作用可御防活性氧或其他过氧化物 自由基对细胞生物大分子物质的破坏作用，被称为细胞的保护酶。本实验以 SOD .– 抑制氮蓝四唑(NBT)的光还原作用来测定酶的活力。NBT 在光下被 O2 还原为 .– 蓝色物质，在 560nm 波长处有最大吸收峰。SOD 能够通过降低 O2 的量而抑制 NBT 光还原过程，使生成的蓝色物质的量降低，其降低的程度与酶活力有关。SOD 活 力以活力单位表示，一个酶活力单位为将 NBT 光还原抑制到对照一半(50%)时 所需的酶量。 ?SOD 活性的测定 称取豆芽样品(鲜重)1.0g，剪碎置于预冷的研钵中充分研磨，加入 5mL 预 冷的 0.05mol/L(pH7.8)磷酸缓冲液(分几次加入)，研磨成匀浆，3000r/min 离心 10min，上清液即为酶的粗提取液，取上清液，量其总体积。按参考文献[86]所述， 利用比色法测定样品中 SOD 酶的活力。 按下式计算 SOD 的活性。 式中 SOD 活力以每克鲜重酶单位(U/g)表示; A0 为对照组(无酶反应液)的吸收光度值; As 为样品溶液的吸收光度值; VT 为试样总体积(mL); V1 为测定时样品用量(mL); FW 为样重(g) 32 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 3.3 结果与分析 ) (cm) 3.3.1 豆芽的生长状况及分析 g)(cm) g 采用不同的浓度的锌溶液浸泡大豆，分别于豆芽生长的第 1、3、5 天，采集 平均芽长豆芽重量(平均芽长豆芽重量(各实验组的豆芽样品，对豆芽的芽长、重量(取 10 株平均值)进行测试，结果见 图 3.2、图 3.3。待发芽结束后，对发芽率进行测试，结果见表 3.1。 12.0 1.7 3 1.7 5 1.7 7 1.7 1 10.0 1.3 2 8.0 1d 0.95 0.98 0.99 0.93 0.9 8 6.0 3d (cm) 0.7 2 0.72 0.7 0 5d 0.6 9 0.6 8 0.6 5 4.0 0.5 6 平均芽长 2.0 0.0 0 25 50 75 100 150 9.8 锌处理浓度(mg/L) 9.5 8.8 8.3 7.2 图 3.2 不同锌处理浓度对豆芽芽长的影响 6.5 5.5 5.1 Fig.3.2 The effect of different zinc concentration on bean height 4.9 4.6 4.3 3.8 1.5 2.00 1.2 1.0 0.8 1.7 3 1.7 5 1.7 7 1.7 1 1.50 1.3 2 1d 0.95 0.98 0.99 0.93 0.9 8 1.00 3d )0.7 2 0.72 5d 0.7 0 0.6 9 g0.6 8 0.6 5 0.5 6 0.50 豆芽重量( 0.00 0 25 50 75 100 150 9.8 9.5 锌处理浓度(mg/L) 8.8 8.3 7.2 图 3.3 不同锌处理浓度对豆芽重量的影响 6.5 5.5 5.1 Fig.3.3 The effect of different zinc concentration on bean weight 4.9 4.6 4.3 3.8 1.5 1.2 33 1.0 106.3 0.8 97.2 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 表 3.1 各实验组豆芽的发芽率 Table 3.1 The germination rate of bean sprouts of each experimental group 锌培养液度 0 25 50 75 100 150 mg/L 发芽率 99 98 98 96 94 88 % 综合分析图 3.2、3.3、及表 3.1，可以看出当豆芽生长到第 1 天和第 3 天时， 各处理浓度的豆芽芽长及重量的差别不大，但生长到第 5 天时，则发现前四组长 势较好，其中当锌浓度为 50mg/L 时，豆芽的芽长和重量较大，当锌浓度增大到 100mg/L 时，豆芽的芽长和重量明显降低。这说明经过锌营养液处理过的豆芽，在 低浓度时对豆芽的生长具有促进作用，但随着培养液锌浓度的增加，豆芽的芽长 及重量并没有随着生长时间的延长而增加，甚至有减小的趋势，表明豆芽的生长 受到了一定程度的抑制，这可能是由于锌浓度过高时破坏了豆芽组织细胞的结构。 研究中还观察到，当培养液浓度为 150mg/L 时，豆芽的平均芽长与重量均较低， 并且相当一部分豆芽没有发芽，有小部分豆芽发芽后出现腐烂现象，这种现象可 能是因为锌在植物体内积累过量引起的毒害作用所造成的。由此可见，当锌培养 液浓度高于 150mg/L 时，对豆芽的生长具有明显的抑制作用。 3.3.2 富锌豆芽中总锌含量的分析 采集发芽好的各实验组豆芽，通过对样品的干燥、粉碎、消化预处理后，采 用差分脉冲溶出伏安法在最佳仪器设定参数下，分别测定各实验组豆芽的锌含量， 结果如图表 3.2。 表 3.2 各实验组豆芽中总锌含量的测定结果 Table 3.2 Derterminated results of the total zinc content in the bean sprouts of each experimental group 锌培养浓度 0 25 50 75 100 150 (mg/L) 总锌含量(μg/g) 20.1 40.6 68.3 89.8 106.3 97.2 从表 3.2 可以看出，经锌培养液浸泡过的豆芽中的锌含量明显高于对照组，说 明豆芽发芽过程中对锌具有良好的富集作用，且富锌程度受到锌溶液浓度的影响。 在锌溶液浓度为 100mg/L 以内时，豆芽的锌含量随着锌浓度的增加有明显的增加 34 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 趋势，说明浓度增加有利于锌的富集，在浓度为 100mg/L 时豆芽富锌效果最好。 当继续增加锌浓度到 150mg/L 时富锌量反成下降趋势，浓度过高会抑制豆芽对锌 元素的吸收，说明豆芽对锌的耐受量已经达到最大。如果再提高锌浓度，将会对 豆芽的生长产生毒性作用，从而抑制豆芽的生长。 3.3.3 富锌豆芽中有机锌含量的分析 对各实验组豆芽中有机锌的含量的测定结果如表 3.3 所示。 表 3.3 各实验组豆芽中有机锌含量的测定结果 Table 3.3 Derterminated results of the organic zinc content in the bean sprouts of each experimental group 锌培养浓度 0 25 50 75 100 150 (mg/L) 有机锌含量(μg/g) 3.2 9.8 22.1 37.3 37.8 26.1 有机化程度 (%) 15.9 24.1 32.4 41.5 35.6 26.8 可以看出，前4个处 无机锌通过绿豆发芽转化为有机锌的程度见表3.5。从表3.5 理豆芽中的有机锌含量随着锌培养液的浓度增加而增加，说明绿豆本身在发芽过 程中具有将无机锌部分转化为有机锌的能力。当锌培养液浓度为75mg/L左右时， 锌的有机化程度达到最高值，有机锌含量占总锌的41.5%，是对照组的2.5倍左右。 结果表明，外源锌不是以单纯的离子吸附或扩散的方式在豆芽中富集，而是通过 生物转化形成了易被吸收的有机锌。继续增加锌培养液浓度其有机锌含量不再提 高，反而呈下降趋势，这说明豆芽对锌的转化能力有一定限度，锌浓度过高反而 抑制豆芽对锌元素的吸收和转化，这主要是因为当环境锌浓度过高时，豆芽的正 常生长受到抑制，体内的生物合成代谢缓慢，对锌元素的生物转化能力降低，所 以对于富锌豆芽的生产过程中锌培养液的浓度选择75 mg/L为最佳。 富锌豆芽中有机锌含量的变化情况与总锌含量的变化总体趋势相同，都是先 增加后减少，具体趋势如图3.4所示。 35 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 120 ) (cm) g100 89.8 平均芽长豆芽重量(80 68.3 总锌 )60 有机锌 g/g 40.6 μ37.3 37.8 40 26.1 22.1 20.1 20 锌含量(9.8 3.2 0 0 25 50 75 100 150 锌处理浓度(mg/L) 图 3.4 不同锌培养液浓度对豆芽总锌及有机锌含量的影响 Fig.3.4 The effect of different zinc concentration on total and organic zinc content in bean sprouts 106.3 3.3.4 富锌豆芽 SOD 酶活性的分析 97.2 通过比色法检测了经不同浓度锌溶液处理后豆芽中的 SOD 酶活性，结果见图 3.5。 图 3.5 不同锌培养液浓度对豆芽 SOD 活性的影响 Fig3.5 The effect of different zinc concentration on SOD actinity in bean sprouts 由图 3.5 可以看出，当锌浓度小于 50mg/L 时，SOD 的活性变化不大，但当锌 浓度大于 50mg/L 时，随锌浓度增加，SOD 活性迅速降低，这说明过量的锌会抑制 36 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 SOD 酶活性。其作用机制可能是由于高浓度的锌胁迫植物产生大量的活性氧，当 活性氧的增加超过正常的歧化能力，过多的氧自由基就使细胞内多种功能膜及酶 系统遭到不同程度的破坏，SOD 活性受到抑制而继续下降。 3.3.5 富锌豆芽的安全性分析 通过对绿豆芽富锌特点的研究，用 75mg/L 浓度的 ZnSO4 进行处理时，豆芽中 有机锌含量高达 37.3μg/g,占总锌的 41.5%，是对照的 2.5 倍左右，10g 富锌豆芽粉 中锌的含量就达到了世界卫生组织推荐的 2.2mg 锌日摄入量，因此建议生产时最 佳的锌培养液浓度为 75mg/L。这样的处理有利于达到人体日需要锌量，又降低了 生产成本，而且豆芽生长正常，外观及口感与对照无差异，说明在此浓度用 ZnSO4 作为培养液生产绿豆芽是可行的。 3.4 本章小结 本文研究了以绿豆为富锌载体，采用浸泡方式添加不同浓度的锌溶液，通过 绿豆的发芽过程实现了锌元素的生物富集，制备出了富锌豆芽。在此基础上，通 过对制备出的豆芽的生长状况、总锌含量、有机锌含量进行测定分析以及对 SOD 酶的活性的影响进行分析，以此探究出富锌豆芽制备的最佳锌添加量以及豆芽对 锌的耐受力。因此，可以得出如下结论: ?经锌溶液处理后的豆芽，在浓度低于 50mg/L 时，对生长具有一定的促进作 用。但随着所采用的锌溶液浓度的增大，豆芽的生长速度放缓，甚至在后期还出 现腐败现象。说明，高浓度的锌对豆芽生长具有毒性作用。 ?绿豆在发芽过程中对锌有一定的富集能力，锌培养液浓度对富锌量起决定 性因素。当锌溶液浓度小于 100 mg/L 时，豆芽的锌含量随着锌浓度的增加有明显 增加趋势，浓度分别为 25mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L 的锌溶液处理后的 豆芽，富锌量分别达 40.8、68.3、89.8、106.3μg/g，但锌处理浓度为 100 mg/L 时， 对豆芽的生长有一定的抑制作用，故不考虑作为生产用。而当继续增加锌浓度到 150 mg/L 时富锌量反成下降趋势，由此证明豆芽对锌的吸收能力有一定限度，锌 浓度过高反而会抑制豆芽对锌的吸收。 ?绿豆在发芽过程中具有将无机锌部分转化为有机锌的能力，有机锌含量随着 锌培养液的浓度增加而增加。当浓度达到75mg/L时，豆芽锌的有机化程度最高， 达到41.5%，是对照组的2.5倍左右。表明，外源锌不是以单纯的离子吸附或扩散的 方式在豆芽中富集，而是通过生物转化形成了易被吸收的有机锌。继续增加锌培 养液浓度其有机锌含量不再提高，反而呈下降趋势，这说明豆芽对锌的转化能力 有一定限度，所以对于富锌豆芽的生产过程中锌培养液的浓度选择75 mg/L为最佳。 ?通过对豆芽 SOD 酶活性的测试，结果表明，当锌浓度小于 50mg/L 时，SOD 37 重庆大学硕士学位论文 3 微量元素锌在豆芽中的富集研究 的活性变化不大，但当锌浓度大于 50mg/L 时，随锌浓度增加，SOD 活性迅速降低， 这说明过量的锌会抑制 SOD 酶活性。其作用机制可能是由于高浓度的锌胁迫植物 产生大量得活性氧，当活性氧的增加超过正常的歧化能力，过多的氧自由基就使 细胞内多种功能膜及酶系统遭到不同程度的破坏，SOD 活性受到抑制而继续下降。 ?综合考虑豆芽发芽过程中的生长状况、锌的吸收富集情况、有机锌的转化 情况、对豆芽SOD酶系统的影响以及结合世界卫生组织推荐的2.2mg锌日摄入量， 最终得到最佳的锌培养浓度为75mg/L。本论文采用锌溶液处理大豆，有利于提高 豆芽中的锌含量，同时也降低了生产成本，且对豆芽的生长无抑制作用，因此， 通过浸泡方式添加一定浓度的无机锌溶液，然后利用绿豆的发芽过程实现对锌元 素的生物富集，制备出富锌绿豆芽的方法是可行的。 38 重庆大学硕士学位论文 4 结论与展望 4 结论与展望 4.1 结论 锌作为人体必需微量元素之一，参与多种酶的合成，对维持人体的正常生理功 能，增强免疫力，促进身体与智力发育具有重要的作用。目前世界范围内普遍存 在着锌摄入量不足，因此，科学补锌必要而迫切。由于我国人群每日摄入的食物 仍以谷类和豆类为主，然而，天然食物中的锌含量普遍较低，一般不足以满足人 体的正常需要，为此，研究利用谷类、豆类这一生物体将无机锌进行有机化，得 到类似于天然产物的有机锌产品具有重要意义。通过研究豆芽的生长状况、锌的 吸收富集情况、有机锌转化情况以及对豆芽 SOD 酶系统活性的影响，确定最佳的 培养条件。 同时，采用铋膜修饰玻碳电极，结合超声波技术和差分脉冲溶出伏安技术，对 测定豆芽中微量锌进行了新的探索，建立了超声辅助-铋膜修饰玻碳电极差分脉冲 溶出伏安法测试锌含量的新方法。 ?采用在线同步镀铋的方法制备铋膜电极，将超声波与差分脉冲溶出伏安相结 合，快速简便地测定了豆芽中锌的含量。与传统的差分脉冲伏安法相比，超声波 使锌的溶出峰电流增加近一个数量级，提高了方法的灵敏度。在 0.2mol/LHAc-NaAc (pH=5.5)缓冲溶液的铋膜上，锌的溶出特征峰为-1.14V(vs.SCE)，线性范围为 10,400μg/L，线性方程为 I=0.0576C+1.1113，相关系数为 r=0.9986，方法的检出 限为 0.8μg/L。固定 Zn2+浓度 200μg/L，平行测定 10 次，RSD=3.17%。该方法用于 自来水样以及豆芽中锌的测定，均具有良好效果，与原子吸收光谱法测定结果一 致。 ?使用一定浓度的锌培养液浸豆后会对豆芽的生长、总锌含量、有机锌含量、 豆芽的有机化程度以及 SOD 酶的活性产生显著影响，并以此探究出富锌豆芽制备 的最佳锌添加量以及豆芽对锌的耐受力。综合考虑豆芽发芽过程中的生长状况、 锌的吸收富集情况、有机锌的转化情况、对豆芽 SOD 酶系统的影响以及结合世界 卫生组织推荐的 2.2mg 锌日摄入量，最终得到最佳的锌培养浓度为 75mg/L。 4.2 后续研究工作的展望 本文对富锌豆芽制备的研究主要是以豆芽的生长、总锌含量、有机锌含量、 豆芽的有机化程度以及 SOD 酶的活性的影响作为的主要考察指标。对豆芽各部分 对锌的吸收规律以及对豆芽生理生化功能的影响等方面未做系统的研究。以下几 个方面的问题需进一步深入研究: 39 重庆大学硕士学位论文 4 结论与展望 ? 豆芽各部分，包括根、茎、子叶对锌的吸收富集情况的差异; ? 豆芽中有机锌的分布规律以及主要的结合形态; ? 锌对豆芽生理生化代谢方面的影响，对蛋白质含量、多糖含量的影响， 对豆芽中各种水解酶和氧化还原酶类活力的影响等。 ? 进一步研究探索锌对豆芽 SOD 酶系统影响的机理。 40 重庆大学硕士学位论文 致 谢 致 谢 衷心感谢恩师刘成伦教授，在研究生三年的学习和生活中给予我的关心和帮 助，使我不断成长，知识得到不断积累。此论文能够顺利完成，与刘老师的悉心 指导和实验室师兄、师姐的热情帮助是分不开的。恩师渊博的专业知识，严谨的 治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的 崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大 的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的 道理。 衷心感谢徐老师及其他老师对我的诸多关心、帮助和指导;感谢实验室全体 同学以及其他兄弟实验室的同学，他(她)们给予了学习上的支持及工作中的帮助; 感谢化学化工学院全体领导和老师对我的教育和培养，在此表示诚挚的谢意。 感谢我的家人，这么多年来，正是你们的支持和鼓励，才使我顺利地完成学业; 正是你们的关心和默默的奉献，才能使我在学习的道路上乐观向上、勇往直前。 借此机会，向我的家人致以崇高的敬意。 最后衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授～ 杨琦 二 O 一一年四月 于重庆 41 重庆大学硕士学位论文 参考文献 参考文献 [1] 万发达,徐松龄.微量元素锌与人体健康[J].宜春医学专报,1988,4(1):76-78. 胡惟勤.微量元素锌的生理功能与临床[J].医师进修杂志,1986,(6):20-23. 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