【doc】对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前遗传学诊断获妊娠1例

【doc】对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前遗传学诊断获妊娠1例 对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前 遗传学诊断获妊娠1例 2002;22(3)第一军医大学(JFirstMilMcdUniv) 对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前遗传学诊断获妊娠l例 罗琛t,邢福祺,罗深敏(第一军医史学’南方医院生殖中心:细胞生轴学与医学遗传学教研室,广东广州 510515) 摘要:目的在体外受精一胚胎移植过程中,对高危夫妇进行胚胎种植前遗传学诊断以避免2l三体综舍征患儿的出 生.常规激素替代治疗,对患者夫妇行胞母细臆质内单精子往射(ICS1),正常受精培养到第3天,对加细胞 期胚胎活检i个细胞,利用荧光原位杂交技术(HSH)进行胚胎种植前遗传学诊断0~OD),挑选染色体数目正常的胚胎 移植A患者子宫.结果共对8个胚胎进行PGD.7十有谚断结果者中6个为正常程胎,1个为2l三体胚胎.挑选3个 胚胎移植,获得妊娠并产下一健康男赛.螬论应用HSH对染色体数目异常的遗传痰病.如21三体综合征,进行胚胎 种植前遗传学诊断是切实可行的. 美?翊:21三体综舍征;胚胎种植前遗传学诊断;荧光原位杂交技术 中叠分类号:R39433文瓤标识码:A文章编 号:1000-2588(2Dff2)D3-0269-03 NormalpregnancyinawomaDhavingbadachild咖 trlsomy21syndromebefore:application ofpreimplantatinngeneticdiagnosis LUOChert,X1NGFu-qi,LUOShcn-qiuz CenterofAssistedReproduction,NanfangHospital,DepartmentofCellularBiologyandMedicalGenetics2, First MilitaryMedicalUniversity,Guangzhou510515,China Abstract:ObjectiveTostudythevalueofprcimphmtationgeneticdiagnosis(POD)beforepregnancyforcoupleswhom pos.dtohi曲 dskof~somy21syndromeinthiefprogeniestoobtsmbirthofhealthychi1<1byfertilization ?.dusMe~odsC~tiona)hormonet’~-piacementtreatmentwithin昀c御Ia 蚰五csperminjection(tscO哪 administeredforOVIIIIIfertilizatlc0n.Oneortwocells(bhstomeres)wmaspiratedfi-omthepreimplantationemthathad grownto6to10cells(day3postfertilizafion)forPGDwithfluorescencein5hybridization(F1SH),and3曲0swith nmlchromo~meworemmsferrcdintotheIltClXL~ResultsPGDwastamedoutinatotalof8embryoswithvalid diagnosesin7.ofwhlch6wcrcidentified日llon]3~iembryosandlhadtrisomy21sy~rolEe. PregnancyWaSobthat resulted_mthebirthofA~lthybaby.ConelnsionDete~onofchromosomalab normalltle*such?~somy21syathomeis 证西ibleforPGDwithFISH. Keywards:rrisomy21syndrome;preimplaumtiongeneticdlagno~is;fluore scenceinsiZubybdd/zation 胚胎种植前遗传学诊断(preimploatationgenetic diagnosis,PGD)是指在体外受精(v/trofertilization, IVF)过程中,对具有遗传风险患者的胚胎进行种植 前话检和遗传学分析以选择无遗传学疾病的胚胎植 入富腔,从而获得正常胎儿的诊断方法,可有效地防 止有遗传疾病患儿的出生. 21三体综台征(trisomy21syndrome)又称为先 天愚型,Down综合征,是人类最常见的一种染色体病, 其病因是多了一条21号染色体.本中心利用荧光原位 杂交(fluorescences舰hybddization,HSH)技术,对 曾育1名21三体综合征男婴的夫妇培养到第3天的 1O细胞期胚胎话检1个细胞,进行胚胎种植前遗传 学诊断以获得妊娠并产下一健康男婴,现报告如下. 1材料与方法 牧精日南2001t09-12 作者俺,r:罗琛《1972t),女,~l*lnlt>,,1995年毕业于期南师}莨大 学生物景,现为第一军医大学在滨磺士研究生,电话020-85141~ 1.1病例 患者女,30岁,1998年妊娠40周产下一男婴,染 色体检查证实患21三体综合征,10d后死亡.产后来 避孕但一直未再次怀孕,来本院生殖中心就医,诊断 为继发不孕.患者夫妇染色体橙测均正常,2001年3 月开始进行试管婴儿治疗.经病人同意,实施胞母细 胞质内单精子注射(intmcytophm’nicsperm.mj~orion, ICSI)和胚胎种植前遗传学诊断(pr~imphntation geneticdiagnosis,PGD). 1.2方法 1.2,1促排卵促排卵采用长周期降调节加高纯 度促卵泡成熟激素(FSH-HP)方案,B超介导下阴遭 取卵.在4x10解剖显微镜下捡卵,共收集出14个 卵子. 1.2,2精液处理精液采用80%和40%两层Percoll 法处理. 1,2—3ICSI过程取卵后2h,经透明质酸酶消化 后,去除卵子外的颗粒细胞.卵子置于HTF-HEPEs培 第一军医大学(JFMilMedUniv)第22卷 养液微漓中,精子置于5%的多聚乙烯毗咯烷酮(PVP) 中.检查卵子的极体及成熟度,对有第一极体的成熟 卵子行ICs】.ICSI后,卵子转移至HTF培养液中培养, 118h后根据原核及第二极体数检查受精情况. 12.4膳胎活检检查受精情况后继续培养48h,观 寨胚胎生长发育情况,挑选出由2原核发育而成,处 于10细腻期且碎片少于40%的胚胎.其中,8细胞 期I级胚胎5个,6细胞期I级胚胎2个,6细胞期? 级胚胎1个.用FA工CON#1006培养皿作操作皿,将 活检胚胎置于5Oml无ca2,M的HEPES-缓冲液 (皿lo)中培养10.-,15miu,以喷酸针吸一定量的酸 性Tyrodc溶液在透明带上打孔后,以另一平端的显 徽操作吸管从打好的孔中插入胚胎中,然后将极体或 卵裂球趣照吸出(图1). 田1胚胎活梭 Fig.1BI呻町of the目_ 1.25荧光原位杂交选用LSI2lSpectrumOrange揉 针(Loeus-sp~ificIdentifierFISHProbes,美国Vysis 公司),此为位于21号染色体长臂21q22.13至 21q22.2之问且包含I)21S259,I)21$341和I)21S342 的21号染色体单一序列探针,橙红色标记.选用正 常男性淋巴细胞作为对照. 将活检细胞置于含2~3l1%NaAc/BSA(6 mm1)低渗液中至细胞肿胀,以2lO.1% Tweeu-20/0,01moVL盐酸固定液滴于细胞上方进行 固定至细胞胞质完全去除.PBS洗2次,7O%,85%, 1o0%酒精群度脱水各1rain.宣温下风干. 将样品在去离子甲酰胺变性液中73?变性5 rain;酒精梯度脱水,室温下风干;7I的LSI杂交缓 冲液,探针1和纯净水2I 混匀,将探针混合液 73?中水浴变性5rain,加入到准备好的样品上;将 加好探钟混合液的目标样品,盖上蓝玻片,用封口膜 封住玻片,放人解育好的湿盒中,37?杂变4h滂交 后移去盖玻片.分别在73?的0.4xSSc,0鲫烈P-4O中, 和室温的2xSSc,0.1%NP-40中.先后洗片2rain和1 miu;将10的DPI?(4’,6-diamidino-2-plenylittdole) 复染荆复染10min.NIKON荧光显徽镜下用B?2A 和D-E-T滤光片观寨结果. 1.2.6胚胎移植和妊娠诊断挑选3个经FBm检查 染色体正常的s细胞期胚胎进行移植.移植后14d 抽血查lICG值为467,移植后45d阴道B超检查证 实单胎.可见孕囊和胎心搏动.妊娠18周进行羊水检 查证实胎儿染色体正常(核型为46,)),妊娠39周 剖宫产分娩一健康男婴. 2结果 2.1ICSI和胚胎发育结果 患者共取14个卵,全部成熟.经Ic后13个卵 受精,均为2原棱,1个卵未受精,只有一个极体.培 养到第3天,胚胎发育结果为:8细胞期I级胚胎5 个;6细胞期I级胚胎2个,?级胚胎1个;5细胞期 ?,?级胚胎各1个;4细胞期?级胚胎1个;3细胞 期I级胚胎1个. 2.2胚胎活辁和PGD蛄果 荧光显微镜下观察,当细胞出现2个橙红色信 号,即诊断为正常胚胎(2121);当细胞出现1个橙红 色信号,即诊断为21号染色体单体(21):当出现细腻 3个橙红色信号,即诊断为21号染色体三傩 (212121),见图2. 蛋2蛔胞mH分析结果 s:21单件(1个信号).b:21二倍律(2十信号);c:21三件(3个信号) mg.2Theflueresee~intituhybridizationresultsoftheceils 日:Haploid21(1signa1);b:Ddiploid21(2a1sc:Trisd2I(3s~aals) 将6”-10细胞期的8个胚胎进行活检,每个胚胎 取一个卵裂球细胞.按序号固定于玻片上,每个细胞 都有核,其中有一个细胞核裂解,FISH结果为无信 号,其他均成功,PGD成功率87.5%.1,3.4…567号 胚胎为正常(其中.1,3,4号胚胎用于移植,5,6,7号 胚胎冷冻保存),3号胚胎为21三体胚胎,2.8号胚胎 元信号放弃.详细结果见表1. 2.2刺余胚胎FISH分析蛄果 经患者同意,将来进行PGD检查(l3母甄置白) 和检查后放弃的胚胎(2,8号胚胎)甩酸性T~’ode溶 第3期罗琛,等.对曾育2I三俸综合征患儿者行旺胎种植前遗传学诊 断获妊娠l例’271 液去除胚胎透明带,固定于硅化的载玻片上,对应编 号.这次检查进一步证实了8号胚胎为21三体胚胎, 确应放弃,而l3号胚胎为嵌舍型胚胎(表2). 表l8个胚胎的荧光原位杂交结果 Tab.1Thefluore~ccenceinsituhybridizaflonresults of8embryosandembryonicmorphology 3讨论 3.1FIsH分析的有效性和准确性 本中心从2000年开始开展利用FISH技术对2l 三体综合征发病的高危患者进行PGD,共对21名患 者的21个治疗周期的197个胚胎进行过诊断检查, 胚胎活检成功率为98%,PGD成功率稳定在90%左 右,与文献报道的结果十分接近,是较有效和准确的. 总结经验,我们认为PGD诊断失误的主要原因 是有:(1)细胞无核,核丢失或固定时核裂解退化,诊 断时无信号,如2号和1O号胚胎中就有一细胞中无 核;(2)胚胎如果为嵌台型胚胎,一个细胞舛j不能准确 说明其真实的情况,如l3号胚胎. 有学者提出一个胚胎检测2个细胞,或者1个极 体和一个卵裂球细胞.但我们考虑胚胎中取2个细胞 对于胚胎后期发育影响较取单个细胞大,而进行两次 表2剩案胚胎黄光原位杂交结果 Tab.2Thefluorescences/tuhybridizafionresults ofthereste~tbryos Nostageoftheembryo~Gradeoftheembryo~R~’ults 活检的活检成功率也相对降低,因此仍采用单细胞进 行分析. 32利用FISH技术扦PGD检查21三体综合征的意叉 新生儿2l三体综合征的发病率是1/1oo2/l0O0[, 且随母亲的年龄增高而升高,母亲年龄若超过37岁, 其发病率是群体发病率的2倍,曾生过此类患儿的夫 妇,再生同类患儿的比率为1/1oo也/100Es】.因此,对高 龄孕妇和高危妇女进行PGD可以有效地避免遗传病 患儿的出生另外PGD也可以有效地避免传统的产 前诊断技术,对异常胚胎进行治疗性流产,避免中期 妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦. 3_3PGD过程中实施ICSI的意叉 本病例中的精液根据世界卫生组织诊断属 于正常范围,可以进行常规IVF.但在PGD过程中卵 细胞上颗粒细胞和透明带上附着的精子的细胞核可 能引起干扰而误诊.征得病人同意采用ICSI受精,可 有效地避免相关核的干扰,从而降低误诊率. 参考文献: [1珊福棋,蒜士Il争,朱兰韩.等.体外受精.胚精移植治疗不孕症85 例报逋[J].中国娄用妇科与产科杂志,1998.14(回:? mngFQ,CheaSLSonget./nv/~rofettili~tionandembryo 岫sferusedfortreaUxtentofinfcrdlepatients:ad】nica[reportof85 cases[J]ChinJPractiC~necolObstet.1998,14(6):353-4 l2同宗舍.邢福棋,阵东红,等卵母细胞脆质单精子注射的形态学 观察[Jj中国妇产科杂志.2000.35(9):540-3 YahZH?唱FQ,ChenDH,eAnalysisoftherelevemt morphologica]ch~texisticso雠Dph锄icsperm JnjectJon[Jj.ChinJOb~tetOy~eoo,,2000,35(:540-3 [3]邢福祺,陈士蜂,闫宗告.等+卵母细胞质内单精于注射治疗不孕 症34例临床总结j].第一军医大学,I999,19(4):343.4 ?ngFQ,chensL,YenzelEvaluationof34cyclesofin. tracytoplasmicsperm蛳ecfionforinferdlity[J_JFirstMilMed Univ,I999(4):342-4. 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