血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响.doc

血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响.doc 血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响 作者:陆敏 周娟 陆海英 王飞 刘煜敏 张悦 【摘要】 目的探讨血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠肾间质纤维化的作用及机理。方法雄性SD大鼠34只随机分为4组:正常组(6只)、假手术组(6只)、模型组(11只)、血府逐瘀胶囊治疗组(11只)，采用UUO法建立大鼠肾间质纤维化模型，造模次日予以血府逐瘀胶囊灌胃治疗，3周后检测血清肌酐和尿素氮含量，观察肾功能变化;取肾组织进行HE和六胺银染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)，观察肾组织病理变化;采用Western blotting分别检测肾组织中磷酸化Smad2(phospho-Smad2，p-Smad2)，Smad2，Smad4，Smad7蛋白表达水平，观察Smad信号通路分子表达水平的变化。结果与正常组和假手术组比较，模型组大鼠血肌酐和尿素氮含量显著上升;肾小管基底膜明显增厚，部分肾小管上皮细胞变性，肾小管扩张与萎缩并存，肾间质明显增宽，纤维组织增生，大量炎细胞浸润;p-Smad2和Smad2蛋白表达显著上调，Smad7蛋白表达显著下调(P<0.01)，而Smad4蛋白表达水平无明显差异。各项指标正常组与假手术组均无差异。血府逐瘀胶囊治疗后，大鼠血肌酐和尿素氮含量显著降低(P<0.05)，梗阻侧肾组织病理改变明显轻于模型组，p-Smad2和Smad2蛋白表达明显减少(P<0.05)，而Smad7表达没有明显改变。结论血府逐淤胶囊可通过抑制梗阻侧肾组织中Smad2蛋白的表达以及活化，减少Smad通路信号传导，从而改善梗阻性肾病模型大鼠的肾功能和肾间质纤维化程度。 【关键词】 血府逐瘀胶囊 肾间质纤维化 Smad通路信号分子 肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病发展至后期的共同表现，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。积极防治肾间质纤维化，对慢性肾脏疾病的转归具有重要意义。近年来的临床资料显示，血府逐瘀汤具有改善肾功能、防治肾纤维化发生、延缓肾功能衰竭的作用,1,，但其作用机制尚不明确。本实验应用血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(UUO)所致肾间质纤维化大鼠进行干预，观察其疗效及作用机制，为血府逐瘀胶囊防治肾间质纤维化的临床应用提供理论依据。 1 材料与仪器 1.1 动物 雄性SD大鼠34只，SPF级，体重160,180 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，合格证号:SCXK(沪)2002-0002。 1.2 药物 血府逐瘀胶囊，购自天津宏仁堂药业有限公司，主要成 分为桃仁、红花、当归、川芎、地黄、赤芍、牛膝、柴胡、枳壳、桔梗、甘草，用时将胶囊内药粉用蒸馏水配制成0.24 g/ml的混悬液。 1.3 试剂 血清肌酐检测试剂盒、血清尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)， BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)，兔抗大鼠磷酸化Smad2多克隆抗体(美国Chemicon公司)，小鼠抗大鼠Smad2单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，小鼠抗大鼠Smad4单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠Smad7单克隆抗体(美国R&D公司)，辣根过氧化物酶耦联的小鼠抗兔GAPDH单克隆抗体(上海康成化学生物技术公司)，辣根过氧化物酶耦联的第2抗体(晶美生物工程有限公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Pierce Pierce公司)。 1.4 仪器纯水系统(美国Labconco)，低温离心机(德国Eppendorf公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪及电转移仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像和图像分析仪(上海复日公司)。Centrifuge 5417R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。LeicaRM213切片机以及LeicaEG119自动包埋机(德国莱卡公司)。 2 方法 2.1 单侧输尿管梗阻动物模型的建立 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉，呈左侧卧位固定于手术板上，常规消毒，打开腹腔、腹膜，暴露并分离左侧输尿管，4,0缝合线在左输尿管上1/3处两次结扎，止血，抗感染，3,0缝合线连续缝合关闭腹腔，间断缝合皮肤。假手术组不结扎输尿管，其余操作过程均相同。正常组不做任何处理。 2.2 分组与给药 大鼠被随机分为正常组(n=6)、假手术组(n=6)、模型组(n=11)以及血府逐瘀胶囊治疗组(n=11)。治疗组于术后第2天以2.4 g/(kg?d)血府逐瘀药液灌胃，假手术组及模型组均以等量生理盐水灌胃，正常组正常饲养。实验期间动物自由进食饮水。治疗21 d后杀检，取材备用。 2.3 血清肾功能测定 分别采用苦味酸法和二乙酰-肟法测定大鼠血清肌酐以及尿素氮含量，严格按试剂盒进行操作。 2.4 肾组织病理染色 取左侧肾脏1/4大小组织块，以10%中性福尔马林缓冲液固定，经常规脱水、包埋、切片后分别进行HE和PASM染色。 2.5 肾组织中Smad通路信号分子蛋白表达分析 采用Western blot 法。取100 mg左右肾组织置于1 ml RIPA匀浆缓冲液中匀浆，离心(12 000 r/min，10 min，4?),留取上清，BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液蛋白浓度。按比例加入适量6×SDS上样缓冲液，100?变性5 min，取30 μg的组织蛋白样本经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上(Pierce Chemical Company, USA，简称标本膜)。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭标本膜1 h，然后分别加入兔抗p-Smad2抗体(1?500)、小鼠抗Smad2抗体(1?1 000)、小鼠抗Smad4抗体(1?200)、小鼠抗Smad7抗体(1?500)，4?孵育过夜，洗膜，再与相应的辣根过氧化物酶耦联的第2抗体室温作用1 h，充分洗涤后，用ECL试剂检测标本膜上的信号，X-片记录实验结果。以计算机成像和图像分析仪，测定X-片上杂交条带的光密度值，代表蛋白的表达量。同一张标本膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸钠洗脱抗体，再与GAPDH抗体(1?5 000)孵育杂交，作为内参照。每个实验重复3批以上不同样本。 2.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件包进行ANOVA单因素方差分析。 3 结 果 3.1 大鼠体重增长、肾脏重量变化比较见表1。造模后大鼠体重增加明显低于正常组与假手术组(P<0.01)，治疗组体重增加高于模型组，但差异无统计学意义。留取左侧肾脏时发现，模型组与治疗组大鼠左侧肾脏较右侧明显增大，颜色变浅，有尿液潴留，肾皮质变薄，肾盂扩张。模型组与治疗组左肾肾体比及左右肾重比均显著高于正常组与假手术组(P<0.01)，模型组与治疗组无明显差异。正常组与假手术组体重增长、左肾肾体比以及左右肾重比均无明显差异。 3.2 各组大鼠血清肌酐与尿素氮含量比较见表1。 模型组、治疗组血肌酐含量显著高于正常组和假手术组，以模型组为重，两组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。模型组尿素氮含量显著高于正常组、假手术组与治疗组(P<0.05)，治疗组与正常组、假手术组比较差异无统计学差异。正常组与假手术组比较无明显差异。表1 各组大鼠体重增长、肾脏重量以及血肌酐、尿素氮测定结果比较与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01;左肾肾体比为左肾重量×2与体重之比;n,6 3.3 各组大鼠肾组织病理检查结果比较见图1。梗阻侧肾组织HE染色和PASM染色可见模型组大鼠肾小管扩张，部分肾小管萎缩，肾小管上皮细胞浊肿，部分坏死与脱落，肾小管基底膜明显增厚;肾间质明显增宽，成纤维细胞增多，炎性细胞浸润，纤维组织增生;皮质中肾小球数量明显减少，肾小球形态基本正常。血府逐瘀胶囊治疗组大鼠皮质中肾小球数量明显多于模型组，肾间质略有增宽，扩张与萎缩的肾小管数量少于模型组，肾小管基底膜轻度增厚，肾小管上皮细胞以变性为主，少见坏死，病变明显轻于模型组(图1)。 3.4 各组大鼠肾组织中Smad通路信号分子蛋白表达比较 Wsetern blot显示，模型组肾组织中p-Smad2与Smad2蛋白表达均显著高于正常组与假手术组(图2，表2)，Smad7蛋白表达显著低于正常组与假手术组(P<0.01)(图3)。中药血府逐瘀胶囊能明显抑制p-Smad2与Smad2蛋白表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但对Smad7蛋白表达没有明显影响。Smad4蛋白表达各组间比较差异无统计学意义(图4)。p-Smad2，Smad2， Smad7蛋白表达，正常组与假手术组无明显差异。 4 讨论 单侧输尿管结扎(UUO)模型是目前国际公认的肾小管间质纤维化模型。该模型由于尿液排出受阻,肾盂及肾小管压力增高,导致肾盂等集合管系统扩张,肾间质水肿,局灶性炎症细胞浸润,最终造成肾间质纤维化及肾萎缩。本实验采用经改良的大鼠肾间质纤维化模型,2,，观察到UUO模型大鼠左肾肾体比、血肌酐、尿素氮含量较正常组和假手术组显著增高，梗阻侧肾组织病理染色显示肾小管扩张萎缩并存、肾小管基底膜增厚，肾间质增宽、间质炎细胞浸润、纤维组织增生，证实单侧输尿管梗阻诱导的大鼠肾间质纤维化模型已制备成功，与文献报道一致,3,4,。 肾间质纤维化是肾脏受到各种致病因素作用后，慢性损伤与修复反应反复进行的结果。根据中医“病久入络”“久病在血”的理论，肾间质纤维化的中医病机可概括为气滞血淤，淤血内停，阻滞于肾络。血府逐瘀汤由桃红四物汤合四逆散加桔梗、牛膝而成。全方行气活血，化淤止痛，专为“胸中血府血淤”而设，故临床以血府逐瘀汤加减，采用活血化瘀法治疗肾纤维化，取得了满意的疗效,5,。本实验应用血府逐瘀胶囊对UUO大鼠灌胃治疗21 d后，观察到治疗组大鼠血肌酐、尿素氮含量较模型组显著降低，组织病理染色显示其病理改变也明显轻于模型组，说明血府逐瘀胶囊对梗阻性肾病的肾功能及肾间质纤维化具有明显的改善作用。表2 各组大鼠肾组织中p-Smad2与Smad2蛋白表达比较与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01;n=3 肾间质纤维化的发生、发展是一个多途径、多环节的作用过程，涉及多种细胞因子的表达调控，其中转化生长因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是国际公认的最重要的促纤维化因子之一。大量研究证实，Smad蛋白是TGF-β1信号从受体到核的细胞内转导分子。Smad蛋白根据其结构和功能不同可分为3类:第1类为受体调控型Smads，包括Smad2和Smad3;第2类为Co-Smad，即Smad4;第3类为抑制型Smads，即Smad6和Smad7。Smad2和Smad3能直接被跨膜的TGF-β1第1类型受体激酶磷酸化，活化的 Smad2/Smad3与Smad4形成复合物转移至核内，激活TGF-β1靶基因的表达，加速肾纤维化的进展,6,。Smad6和Smad7是Smad信号通路中的逆向调控因子，它们可通过与磷酸化的Smad2/3结合或与活化的受体结合，直接或间接地减少Smad2/3的活化，从而阻断Smad通路信号传导，抑制肾间质纤维化的进展,7,。本实验中Western blot结果显示，UUO模型大鼠肾组织中p-Smad2，Smad2蛋白表达较正常组和假手术组显著上调，Smad7蛋白表达显著下调，表明存在Smad信号通路分子的活化。血府逐瘀胶囊可明显降低增高的p-Smad2和Smad2蛋白表达水平，但对Smad7蛋白表达影响不大，说明血府逐瘀胶囊能明显抑制Smad2蛋白的表达和活化，从而减少Smad通路信号传导，但这种作用不是通过上调Smad7蛋白表达实现的。本实验中Smad4蛋白表达水平虽然无明显变化，但可能存在其它因子例如Smad转录共抑制因子SnoN/Ski与p-Smad2竞争结合Smad4，减少活化的Smad2与Smad4异源复合物的形成的情况,8,。这有待于今后的实验加以证实。 上述实验提示，血府逐瘀胶囊抑制Smad2蛋白的表达与活化，减少TGF-β1依赖的Smad信号通路的激活，可能是其抗肾间质纤维化的重要作用机制之一。 【