氧化低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞A型清道夫受体表达的调节作用
氧化低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞A
型清道夫受体表达的调节作用
中国医学科学院
ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE 氧化低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞A型清道夫受体
表达的调节作用
叶文玲李学旺许彩民段琳李艳金晶
?
论着?
(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科,北京100730) 摘要目的研究氧化低密度脂蛋白(Ox.LDL)对人肾小球系膜细胞(HMC)A型清道夫受体(sR-A)表达
的调节作用,探讨在慢性肾脏疾病中Ox.LDL加重肾病进展的作用机制.
脂质体转染含SR.AcDNA的表达质
粒,建立稳定高表达SR.A的人肾小球系膜细胞株(HMCL),油红"O"染色检测HMCL对Ox.LDL的摄取;RT.PCR
法检测Ox.LDL和LDL对HMCSR.AmRNA表达的作用.结果稳定高水平表达SR.A的HMCL对Ox.LDL的摄取明
显强于未转染细胞;Ox.LDL上调HMCSR.AmRNA的表达,作用于24h达到高峰;Ox.LDL(10—100I~g/m1)作用
24h对HMCSR.AmRNA的上调作用呈剂量依赖性;天然LDL对SR.A的表达无明显影响.结论在HMC,SR.A
是Ox—LDL进入细胞内的主要受体之一,Ox.LDL具有上调HMCSR.AmRNA表达的作用,推测在慢性肾脏疾病进展
中,局部沉积的LDL经氧化修饰后可能通过刺激SR.A的表达进人细胞内增强其对HMC的毒性作用,进而加重肾小
球硬化的进展.
关键词氧化低密度脂蛋白人肾小球系膜细胞A型清道夫受体
中图号Q507
EffectsofOxidizedLow—densityLipoproteinonExpressionofTypeAScavenger
ReceptorinHumanMesangialCells
YeWen—lingLiXue-wangXuCai—rainDuanLinLiYanJinJing
(DepartmentofNephrology,PUMCHospital,CAMSandPUMC,Beijing1~730,China) objectiveToexploretheregulationaleffectofoxidizedlow-densitylipoprotein(Ox—
LDL)on
expressionoftypeAscavengerreceptor(SR—
A)inhumanmesangialcells(HMC).MethodsHMCline
(HMCL)withhighexpressionofSR-A(HMCL-SRA)wasestablishedafterstabletransfectionof
expressivevectorwithcDNAencodingSR-A.UptakeofOx-LDLbyHMCLwasevaluatedusingOilRed
"O"staining.SR-AmRNAexpressionwasexaminedusingreversetranscription-polymerasechainreaction
(RT-PCR).ResultsMoreuptakeofOx.LDLwasobservedintheHMCLSRAthanthatinthe untransfectedHMCL.Ox-LDLcouldinduceSRAmRNAexpressioninHMCinadosedependent
manner.andreachedapeaklevelafter24hofstimulation.After24hofstimulationwithOxLDLat
thedoseof10,50and100I~g/ml,SR-AmRNAexpressionwasup-regulatedto1.35,1.83and2.30fold
ofcontrols,respectively.However,LDLhadnoeffectontheexpressionofSR.A.ConclusionsIt
suggeststhatSR?AbeamajorbindingreceptortouptakeOx-LDLinHMC.Ox-LDLmaypromotethe
progressionofchronicrenaldiseasesthroughup-regulationofSR.A. Keywordsoxidizedlow?densitylipoprotein;humanmesangialcells;typeAscavengerrecep
tor
I4etaAcadMedSin,2004,26(1):34—37
DepartmentofBiochemistry,InstituteofBasicMedicalSciences,CAMSandPUMC,Beijin
g;#CorrespondingauthorTel/Fax:010.65295056.E-mail
Lixuew@csc.pumch.ac.ca 34February,2004
氧化低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞A型清道夫受体表达的调节作用
高脂血症不仅是肾病综合征和慢性肾功能衰竭 常见的临床表现,而且会加重原有的系膜细胞病变 和-肾小球硬化性损伤,进一步加速慢性.肾脏疾病的 进展.近年来,在氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow- densitylipoprotein,Ox.LDL)对.肾小球系膜细胞毒 性,细胞外基质的合成及细胞因子和炎症介质分泌 的影响等方面进行了较深入的研究,但Ox-LDL如 何作用于系膜细胞的分子机制仍然不清.在动脉粥 样硬化的研究中发现,清道夫受体是介导Ox—LDL 进入细胞内的主要受体,从而揭示A型清道夫受体 (typeAscavengerreceptor,SR-A)为动脉粥样斑块 形成的关键成分1.肾小球硬化具有与动脉粥样硬化 类似的组织学特征和病理生理机制,因此,推测 Ox.LDL在慢性.肾脏疾病的进展中可能与其在动脉粥 样硬化中具有类似的作用机制和作用途径.目前, 清道夫受体在.肾脏疾病中的表达和作用研究甚少, 该受体表达受多种因素的调节,在血管平滑肌细胞 和单核巨噬细胞的研究中显示,Ox.LDL具有上调清 道夫受体表达的作用[2,31.本研究建立稳定高水平表 达SR-A的人肾小球系膜细胞株,
SR.A在对人 .肾小球系膜细胞(humanmesangialcell,HMC)摄取
Ox—LDL的作用,并研究体内清道夫受体的天然配体 Ox—LDLHMCSR-A表达的调节作用,探讨Ox—LDL 加重肾小球损伤的作用机制.
材料和方法
材料含人SR—AcDNA的质粒pXhSR1及人肾 小球系膜细胞株(humanmesangialcellline,HMCL).
由英国RoyalFreeHospital肾内科阮雄中教授惠赠; SuperfectTransfection试剂盒为Qiagen公司产品, LDH检测试剂盒购自Roche公司;RPMI1640培养 液及胎牛血清(fetalbovineserllm,FBS)购自Gibco 公司;引物由上海生[生物工程公司合成,SR.A的 5端引物为:5-TCGCTCAATGACAGCTITGC.3,3端 引物为:5-CCATGTFGCTCATGTGTFCC.3,扩增产 物为290bp;内参照GAPDH的5端引物为:5.ACC. ACACTCCATGCCATCAC-3,3端引物为:5TCCAC. CACCCTCTTCCTGTA.3,扩增产物为452bp. 人肾小球系膜细胞的培养与鉴定取北京协和
医院废弃的健康成人移植供体肾,分离肾皮质.提 取肾小球,于含15%FBS的RPMI1640培养基中 培养,传代3,5次的系膜细胞用于本实验.经间接 免疫荧光法鉴定,培养的系膜细胞胞浆表达Actin, ?型胶原,Fibronectin及Vimentin,而Cytokeratin及 ?因子阴性.
无脂蛋白血清及Ox.LDL的制备顺次将密度
为1,1.1的Tris.C1液和密度为1.3的血浆加至离心 管底,10qC45000r/min离心1.5h,吸出中层淡黄 色液即为LDL.LDL经终浓度为5Izmol/LCuSO4, 37?氧化15h.LDL氧化后在琼脂糖凝胶电泳中泳 动速度明显增加,相对迁移率为2.8,其硫代巴比
妥反应物含量为每毫克蛋白含22,26nmol丙二醛, 未经氧化的LDL硫代巴比妥反应物含量为每毫克蛋 白含0,3,0.8nmol丙二醛.
密度梯度离心后,吸出下层淡黄色液体,用
NaBr调节密度至1.3,于其上层加入密度为1.2 Tris.C1溶液,42000r/min再次离心16h,收集下 层黄色透明液体,充分透析.无脂蛋白血清(1ipid deficientserum,LPDS)经0.5%琼脂糖电泳后氨基黑 染色蛋白谱类同正常血清,而油红"O"染色阴性,
血清已完全去除脂质.
Ox.LDL的细胞毒性试验细胞静止后,分别
加入含终浓度为0,10,50,100,200,400tzg/ml
Ox-LDL的1%FBSRPMI1640培养基培养24h,运 用台盼蓝排斥试验及LDH释放试验分析Ox-LDL对 HMC的细胞毒性,后者操作方法参照LDH细胞毒 性检测试剂盒说明
.
稳定高水平表达SR—A的l{口MCL的建立将 pXhSR1质粒与转染试剂混合,10min后加入含 10%FBS的RPMI1640培养基.HMCL在转染基质 中37qC温育3h,换用含RPMI1640培养基继续培 养.24h后,换用含400tzg/mlG418的RPMI1640 培养基,细胞经G418选择3周后,即得到G418抗 性的稳定表达SR.ADNA的人系膜细胞株(命名为 HMCL—SRA).经RT-PCR法检测显示未转染细胞表 达低水平的SR.A,而转染细胞SR.AmRNA水平明 显增加,证实SR.AcDNA已整合入HMCL基因组. 脂质化学染色分析转染细胞对Ox.LDL的摄取 HMCL—SRA和未转染的HMCL静止后,在含100g/ mlOx—LDL的1g/LIDSRPMI1640培养基中37qC
培养24h.玻片经5%中性福尔马林固定,油红 "0"染液染色,苏木素复染等处理后,光学显微镜 下观察.
RT-PCR法检测Ox.LDL和LDL对HMCSR-A mRNA表达的作用HMC分别于含50g/mlOx—LDL Vo1.26No.135
中国医学科学院
和LDL的培养基中培养,培养O,6,12,24,48h 后收集细胞,观察Ox.LDL和LDL作用不同时问对 SR.AmRNA表达的影响.在此实验基础上观察不同 剂量Ox.LDL的作用,细胞随机分为4组,分别换 用含O,1O,50,100~g/mlOx—LDL的1g/LLPDS RPMI1640培养基,于24h收集细胞.按Trizol试 剂盒方法提取总RNA,取等量的RNA进行逆转录 反应,反应条件:65?5min后,加入1l逆转录
酶,37?1h.SR.A与GAPDH于25lPCR反应 体系中同时扩增,扩增参数为94?60S,52.5oC 60S,72oC60S,共3O个循环
结果
Ox—LDL的细胞毒性试验Ox.LDL对HMC的 细胞毒性呈剂量依赖性,Ox.LDL在1O,100~g/ml 浓度范围内,细胞生长状态良好,轮廓清晰,细胞 的存活率>95%,对细胞无明显毒性作用. 系膜细胞通过SR.A摄取Ox.LDL在LPDS培 养基中加入100~g/mlOx.LDL培养后,未转染细 胞呈现弱而稀的红色颗粒,而转染SR.AcDNA的 HMCL胞浆内红色颗粒明显增多,主要分布于核周, 且强度明显强于未转染的HMCL(图1).
Ox-LDL对HMCSR-AmRNA表达的作用如
图2所示,Ox.LDL(50p~g/m1)上调HMCSR.A mRNA的表达,其作用于24h达高峰,其SR.A/ GAPDH的相对光密度值为0h对照组的1.85倍,48h 开始下降.Ox-LDL作用于HMC24h,剂量依赖性 (1O,100~g/m1)地增加HMCSR.AmRNA的表达 (图3),1O,50,100p~g/ml组SR.A/GAPDH相对
光密度值分别为对照组的1.35,1.83和2.3O倍. bp
1631
517
220
GAPDH(452bp)
SR—A(290bp)
图2Ox?LDL作用不同时间对HMCSR.AmRNA表达的作用 Fig2EffectofOx—LDLonexpressionofSR.AmRNAinhuman
mesangialcellsafterdifferentincubationperiods
M.marker
SR?A:typeAscavengerreceptor 36February,2004
LDL对HMCSR—AmRNA表达的作用在
LPDS培养基中加入100~g/mlLDL,0,48h各时 问点HMCSR.AmRNA表达均无明显改变(图4). M01050100t~g/ml
H(452bp)
(290bp)
Ox—LDL(0—100Cg/m1)作用24h对SR—AmRNA表达 的作用
ExpressionofSR?-AmRNAinresponsetodifferentcon?-
centrationsofOx—LDL
M.marker
GAPDH(452bp)
SR?A(290bp)
图4LDL作用不同时间对HMCSR—AmRNA表达的影响 Fig4Effectoflow—densitylipoproteinonexpressionofSR—A mRNAinhumanmesangialcellsatdifferenttime
M.marker
讨论
异常脂蛋白血症影响业已存在的肾小球系膜细 胞病变和肾脏的硬化性损伤,加速肾功能不全的进 展.在异常的脂质成分中,低密度脂蛋白,尤其是 Ox-LDL在慢性肾脏疾病进展中的作用最为学者所关 注.在局灶节段性肾小球硬化动物模型及人类多种 慢性肾小球疾病的肾活检组织中,均检测出了
Ox—LDL的沉积,并且Ox-LDL沉积的程度与肾功能 不全和蛋白尿的程度呈正相关H一1.在动脉粥样硬化的 研究中已证实,清道夫受体是介导细胞摄取Ox.LDL 的主要途径,清道夫受体的表达是动脉粥样斑块泡 沫细胞形成及病变进展的一个关键因素….清道夫 受体与LDL受体不同,其作用不受细胞内胆固醇含 量的调节,当培养基质或局部组织的Ox.LDL持续 存在时,细胞将摄人大量的脂质成为脂质过负荷细 胞,细胞病变的发展会加速.在所有的清道夫受体 中,SR?A最受关注.SR—A表达于巨噬细胞,Kuffer "%钳加,3?瑚33图啦%加}653i21
氧化低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞A型清道夫受体表达的调节作用
细胞和内皮细胞,在血管平滑肌细胞,人肾小球系
膜细胞等细胞中也可诱导其表达_6'7】.
SR—A识别多种修饰的脂蛋白和多聚阴离子,但 Ox—LDL是SR—A在体内主要的天然配体.本研究将 含人SR—AeDNA的pXhSR1质粒转染入HMCL,建 立稳定高水平表达SR—A的HMCL.HMCL—SRA摄入 Ox—LDL的能力明显增强,未经转染的HMCL仅摄入 极少量的Ox—LDL,说明Ox—LDL主要在SR—A的介 导下进入肾小球系膜细胞内,而未转染的系膜细胞 则表达低水平的SR—A.研究表明Ox—LDL可上调平 滑肌细胞SR—A的表达f21,肾小球系膜细胞的生理特 性类似于平滑肌细胞,推测Ox—LDL的局部刺激可 能会影响清道夫受体的表达.本结果显示,Ox—LDL 具有上调体外培养的HMCSR—A表达的作用,其作 用于6h开始出现,24h达高峰,48h效应开始下 降.作用24h后,10,50,100Ixg/ml各组mRNA 表达的诱导作用呈剂量依赖性.但天然的LDL与 HMC作用在48h内各时间点对SR—A的表达均无 明显影响.提示天然LDL对HMCSR—A的表达无明 显调节作用,LDL经氧化修饰后可上调SR—A的表 达,增强自身在系膜区的清除,其调节作用与 Ox—LDL沉积的数量有关.但SR—A表达达一定程度后 细胞内Ox—LDL聚积逐渐增加,细胞成为脂质过负荷 细胞,可能反而加重修饰脂蛋白对细胞的毒性作用. 迄今为止,已发现至少有6类清道夫受体与
Ox—LDL的摄取有关_7】,但对清道夫受体的认识多来 源于与动脉粥样硬化相关细胞的研究.SR—A在肾小 球系膜细胞中对修饰脂蛋白的摄取中所占的比例不 清楚,清道夫受体在不同类型细胞上的表达差异较 大,在单核巨噬细胞中,多种清道夫受体参与
Ox—LDL的摄取,如SR.A,CD36,LOX一1(1ectin.1ike
oxidizedLDLreceptor),CD68等.在HMC,SR—A
也非介导Ox—LDL进入细胞内的唯一受体.在高血
压肾小动脉硬化症的动物模型中发现LOX一1表达于
肾小球细胞r9J.近年来,在动脉粥样硬化的研究中,
已经肯定了SR—A是动脉粥样硬化发展中的主要危
险因素NO],肾小球硬化具有与动脉粥样硬化类似的
病理改变和病理生理机制,SR—A在肾小球硬化的发
展中是否具有与动脉粥样中同等程度的作用有待于
进一步研究.
(本文图1见插图第1页)
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(2003—05—29收稿)
VoI.26No.137