高效液相色谱质谱法快速鉴定复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分

高效液相色谱质谱法快速鉴定复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分 高效液相色谱质谱法快速鉴定复方毛冬青冲 剂中三萜皂苷活性成分 作者:杨运云 郭鹏然 陈怡禄 邓六勤 钟鸣 吴庆晖 【摘要】 建立了高效液相色谱质谱法(HPLCMS)快速鉴定复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分的方法。以甲醇为萃取剂超声萃取复方毛冬青冲剂30 min。采用高效液相色谱离子阱质谱(HPLCITMS)和高效液相色谱飞行时间质谱(HPLCTOFMS)对萃取液进行分析，选用Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，以水(含0.1 %甲酸)乙腈为流动相进行梯度洗脱，柱后流出液采用电喷雾离子阱质谱(ESIITMS)和电喷雾飞行时间质谱(ESITOFMS)的正、负离子模式进行。检测结果经离子阱一级质谱(ITMS1)、离子阱二级质谱(ITMS2)和分析时间质谱(TOFMS)信息分析，并与相关文献报道进行比较，鉴定出1种三萜酸和8种三萜皂苷成分，并推测了其它3种可能的三萜皂苷化学成分，通过对照品对比分析，三萜酸确证为Ilexgenin A，其中一种三萜皂苷确证为Ilexsaponin A1。本方法无需对照品即可快速有效地鉴定出复方毛冬青冲剂中的三萜皂苷活性成分，为建立冲剂的质量提供了依据。 【关键词】 复方毛冬青冲剂， 三萜皂苷， 高效液相色谱质谱 言 1 引 毛冬青(Radix ilicis pubescentis)为冬青科(Aquifoliaceae)冬 青属植物毛冬青(Ilex pubescens Hook. et Am.)的干燥根，是我国南方常用中药，已有多种成方制剂如毛冬青胶囊、毛冬青注射液、复方毛冬青氯贝酸铝片和复方毛冬青冲剂等收载于部颁标准, 主要用于治疗循环系统疾病，有扩张血管及抗菌消炎的功效[1]。 目前，市售毛冬青品种混乱，化学成分和药理作用差别较大，从而导致了毛冬青制剂的质量难以控制。因此，建立快速、有效地监测毛冬青制剂质量标准的方法十分必要。已报道的毛冬青的主要化学成分有齐墩果烷型和乌索烷型三萜酸及皂苷类、黄酮类、木脂素类、酚酸类、脂肪酸和糖脂类等化合物[2,10]。其中Ilexoside O [2]，Ilexgenin A [3]，Ilexsaponin A1[3]，Ilexsaponin B[7], B1[4], B2[4], B3[4], B4[5] 和 Ilexsaponin C [5,6]等三萜酸和三萜皂苷被认为是其主要活性成分。复方毛冬青冲剂由毛冬青、板蓝根和大青叶3味中药材经适宜工艺制成，三萜酸和三萜皂苷仍为冲剂的主要活性成分。由于冲剂中糖类辅料等基体物质的含量很高，且三萜皂苷化合物的紫外吸收很弱，要通过高效液相色谱紫外检测(HPLCUV)或高效液相色谱二极管阵列检测(HPLCDAD)测定其含量非常困难，并且还需要价格昂贵的对照品。HPLCMS检测三萜皂苷类物质灵敏度很高，并能在线提供每个谱峰的分子量和结构信息，在不需要对照品的情况下，可以快速鉴定出复方毛冬青冲剂中的三萜酸和三萜皂苷活性成分，是冲剂质量标准和指纹图谱建立的有效手段之一。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1100 HPLCMS Trap XCT 高效液相色谱离子阱质谱联用仪(美 国Agilent公司);1200 HPLCMS TOF高效液相色谱飞行时间质谱联用仪(美国Agilent公司);Zorbax Eclipse XDB C18高效液相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm，美国Agilent公司)。 复方毛冬青冲剂(广州市儿童医院);甲醇和乙腈均为色谱纯(美国Burdick & Jackson公司)，实验用水为超纯水，由超纯水设备(美国MiliQ公司)制备。 2.2 实验步骤 2.2.1 样品提取 取复方毛冬青冲剂1袋(10 g)，开袋后倒入50 mL容量瓶中，加入甲醇并定容，超声萃取30 min。萃取完成后冷却至室温，吸取上层清液1 mL，过0.45 μm滤膜，待测。 2.2.2 样品分析 采用HPLCMS Trap XCT和HPLCMS TOF分析复方毛冬青冲剂萃取液。Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱;流动相A为水(含0.1%甲酸)，B为乙腈，从0,5 min，95% A，5% B;5,15 min， B相从5%升至20%;15,40 min，B相从20%升至40%;40,45 min，B相从40%逐渐升至 60%;45,55 min，B相从60%逐渐升至95%;55,70 min，5% A，95% B;流速1.0 mL/min;进样量25 μL。电喷雾(ESI)离子源，正、负离子两种检测模式;雾化N2气压力275.8 kPa，干燥N2气流速9 L/min，干燥N2气温度350 ?;离子源前分流模式，30%柱后流出液分流至ESI源，70%分流至废液瓶;毛细管电压3500 V;扫描质量范围m/z 50,1500。离子阱质谱分析时阱深对应稳定区中心离子m/z 800;Auto MS2模式，自动寻找丰度最高的3个离子进行二级质谱。飞行时间质谱分析时，参比离子m/z 121.0509, 922.0098;分辨率11500(922.0098)。 分 析 化 学第37卷第 10期杨运云等:高效液相色谱质谱法快速鉴定复方毛冬青冲剂中三萜皂苷活性成分 3 结果与讨论 3.1 HPLCMS分析结果 三萜皂苷类化合物ESIMS正、负离子模式下的离子化效果均很理想。图1为复方毛冬青冲剂萃取液的HPLCITMS正、负离子全扫描质量色谱图。文献[10]报道毛冬青药材反相C18柱HPLC图谱有两个指纹区。一个区的保留较弱(保留时间tR较短)，在245,320 nm有紫外吸收，主要为木酯素类化合物;另外一个区的保留较强(tR较长)，波长210 nm以上无明显紫外吸收，低含量用HPLC法测定非常困难，主要为三萜酸和三萜皂苷类化合物。本研究所得HPLCMS图谱与文献[10]类似，tR<33 min为一指纹区，tR>33 min为三萜酸和三萜皂苷类化合物的指纹区。 图1 复方毛冬青冲剂萃取液的正离子(A)和负离子(B)HPLCITMS全扫描质量色谱图 Fig.1 Liquid chromatograms obtained by TIC from positive (A) and negative(B) ion trap(IT)MS of compound Radix ilicis pubescentis medicinal granules3.2 三萜皂苷化合物的鉴定 文献报道毛冬青中所含的三萜酸和三萜皂苷类化合物多以毛冬青酸(Ilexolic acid)，Ilexgenin A，Ilexgenin B和Ilexgenin C为苷元[2,7]，它们的化学结构式见图2。 分析复方毛冬青冲剂HPLCMS色谱图中每个谱峰的ITMS1，IT MS2和TOFMS信息，并与已报道的毛冬青中鉴定出来的三萜皂苷活 性物质进行比较，鉴定出1种三萜酸和8种三萜皂苷化合物，并推测了其它3种可能的三萜皂苷化学成分，色谱峰如图1所示。在相同的实验条件下采用HPLCITMS分析Ilexgenin A和Ilexsaponin A1对照品，通过比较保留时间和质谱信息，色谱峰8确证为Ilexsaponin A1，色谱峰12确证为Ilexgenin A。 色谱峰1: tR=35.5 min;TOFMS:m/z 1092.5951 [M+NH4]+(误差: 0.0002)，1073.5543 [M-H]-(误差:0.0005)，分子式C53H86O22，M=1074.5611;ITMS1:m/z 1097 [M+Na]+，1092 [M+NH4]+，913 [M+H-Glc]+，455 [M+H-H2O-Glc-XylGlcRha]+，437 [M+H-2H2O-Glc-XylGlcRha]+，1119 [M+HCOO]-，1109 [M+Cl]-，1073 [M-H]-;ITMS2:m/z 935 [M+Na-Glc]+，911 [M-H-Glc]-,765 [M-H-Glc-Rha]-，603 [M-H-Glc-GlcRha]-;通过与文献[2]比较，鉴定为Ilexoside O。 图2 毛冬青中已经鉴定的三萜酸和三萜皂苷化合物化学结构式 Fig.2 Chemical structures of triterpene and saponins identified in Radix ilicis pubescentis色谱峰2: tR=37.2 min;TOF-MS:m/z 946.5358 [M+NH4]+(误差:-0.0012)，927.4962 [M-H]-(误差:0.0003)，分子式C47H76O18，M=928.5032;ITMS1:m/z 951 [M+Na]+，946 [M+NH4]+，767 [M+H-Glc]+，455 [M+H-H2OGlc-XylGlc]+，437 [M+H-2H2O-Glc-XylGlc]+，973 [M+HCOO]-，963 [M+Cl]-，927 [M-H]-;IT MS2:m/z 789 [M+Na-Glc]+，765 [M-H-Glc]-,603 [M-H-Glc-Glc]-; 通过与文献[4]比较，鉴定为Ilexsaponin B3。 色谱峰3: tR=39.5 min;TOFMS:m/z 805.4356 [M+Na]+(误差:0.0011)，827.4424 [M+HCOO]-(误差:-0.0011)，分子式C41H66O14，M=782.4453;ITMS1:m/z 805 [M+Na]+，471 [M+H-H2O-Glc-Xyl]+，453 [M+H-2H2O-Glc-Xyl]+，437 [M+H-3H2O-Glc-Xyl]+，827 [M+HCOO]-，817 [M+Cl]-;ITMS2:m/z 643 [M+Na-Glc]+，619 [M-H-Glc]-;通过与文献[5,6]比较，鉴定为Ilexsaponin C。 色谱峰4: tR=40.3 min;TOFMS:m/z 844.4676 [M+NH4]+(误差:-0.0013)，871.4432 [M+HCOO]-(误差:-0.0001)，分子式C42H66O16，M=826.4351;ITMS1:m/z 849 [M+Na]+，844 [M+NH4]+，665 [M+H-Glc]+，503 [M+H-2Glc]+，485 [M+H-H2O-2Glc]+，467 [M+H-2H2O-2Glc]+，421 [M+H-2H2O-HCOOH-2Glc]+，871 [M+HCOO]-，861 [M+Cl]-，825 [M-H]-;IT MS2:m/z 503， 485， 467， 421， 663 [M-H-Glc]-，501 [M-H-2Glc]-;推测可能为Ilexgenin A与2个葡萄糖形成的三萜皂苷。 色谱峰5: tR=41.8 min;TOFMS:m/z 784.4844 [M+NH4]+(误差:0.0002)，811.4488 [M+HCOO]-(误差:0.0003)，分子式C41H66O13，M=766.4503;ITMS1:m/z 789 [M+Na]+，784 [M+NH4]+，455 [M+H-H2O-XylGlc]+，437 [M+H-2H2O-XylGlc]+，811 [M+HCOO]-，801 [M+Cl]-，765 [M-H]-;ITMS2:m/z 627 [M+Na-Glc]+，455，437，603 [M-H-Glc]-;通过与文献[4]比较，鉴定为Ilexsaponin B1。 色谱峰6: tR=44.6 min;TOFMS:m/z 935.5002 [M+Na]+(误差: (误差:-0.0008)，分子式C47H76O17，0.0027)，957.5057 [M+HCOO]- M=912.5083;ITMS1:m/z 935 [M+Na]+，930 [M+NH4]+，455 [M+H-H2O-XylGlcRha]+，437 [M+H-2H2O-XylGlcRha]+，957 [M+HCOO]-，947 [M+Cl]-，911 [M-H]-;ITMS2:m/z 789 [M+Na-Rha]+，765 [M-H-Rha]-，603 [M-H-GlcRha]-;通过与文献[4]比较，鉴定为Ilexsaponin B2。 色谱峰7: tR=45.2 min;TOFMS:m/z 916.5277 [M+NH4]+(误差:0.0007)，943.4891 [M+HCOO]-(误差:-0.0012)，分子式C46H74O17，M=898.4926;ITMS1:m/z 921 [M+Na]+，916 [M+NH4]+，455 [M+H-H2O-XylGlcAra]+，437 [M+H-2H2O-XylGlcAra]+，943 [M+HCOO]-，933 [M+Cl]-，897 [M-H]-;ITMS2:m/z 789 [M+Na-Ara]+，765 [M-H-Ara]-;通过与文献[5]比较，鉴定为Ilexsaponin B4。 色谱峰8: tR=45.9 min;TOFMS:m/z 682.4152 [M+NH4]+(误差:-0.0009)，663.3751 [M-H]-(误差:0.0001)，分子式C36H56O11，M=664.3823;ITMS1:m/z 682 [M+NH4]+，503 [M+H-Glc]+， 485 [M+H-H2O-Glc]+，467 [M+H-2H2O-Glc]+，457 [M+H-HCOOH-Glc]+，439 [M+H-H2O-HCOOH-Glc]+，421 [M+H -2H2O-HCOOH -2Glc]+，663 [M-H]-;IT-MS2:m/z 503， 485， 467， 457， 439， 421， 663， 501 [M-HGlc]-;通过与文献[3]比较，鉴定为Ilexsaponin A1，并在相同的实验条件下通过对照品进行了确证。 色谱峰9:tR=47.8 min;TOFMS:m/z 912.5039 [M+NH4]+(误差:-0.0006)，939.4952 [M+HCOO]-(误差:-0.0007)，分子式C47H76O16， MS1:m/z 917 [M+Na]+，912 [M+NH4]+， 437 M=894.4977;IT [M+H-H2O-Xyl-Glc-Rha]+，939 [M+HCOO]-，929 [M+Cl]-，893 [M-H]-;IT MS2:m/z 771 [M+Na-Rha]+，437，747 [M-H-Rha]-;推测可能为Ilexolic acid与一个鼠李糖、一个葡萄糖和一个木糖形成的三萜皂苷。 色谱峰10: tR=48.8 min;TOFMS:m/z 603.3896 [M-H]-(误差:-0.0006)，分子式C35H56O8，M=604.3975;ITMS1:m/z 622 [M+NH4]+， 455 [M+H-H2O-Xyl]+，437 [M+H-2H2O-Xyl]+，603 [M-H]-;ITMS2:m/z 455， 437， 471 [M-H-Xyl]-;推测可能为Ilexgenin B与一个木糖形成的三萜皂苷。 色谱峰11: tR=49.5 min;TOFMS:m/z 766.4741 [M+NH4]+(误差:0.0005)，分子式C41H64O12，M=748.4398;ITMS1:m/z 771 [M+Na]+，766 [M+NH4]+， 437 [M+H-H2O-XylGlc]+，793 [M+HCOO]-，783 [M+Cl]-，747 [M-H]-;ITMS2:m/z 609 [M+Na-Glc]+， 437， 585[M-H-Glc]-;通过与文献[7]比较，鉴定为Ilexsaponin B。 色谱峰12: tR=52.0 min;TOFMS:m/z 503.3363 [M+H]+(误差:-0.0004)，501.3228 [M-H]-(误差:0.0006)，分子式C30H46O6，M=502.3294;ITMS1:m/z 503 [M+H]+， 485 [M+H-H2O]+，467 [M+H-2H2O]+，457 [M+H-HCOOH]+，439 [M+H-H2O-HCOOH]+，421 [M+H-2H2O-HCOOH]+，501 [M-H]-;ITMS2:m/z 485， 467， 457， 439， 421， 483[M-H-H2O]-，465 [M-H-2H2O]-，455 [M-H-HCOOH]-，437 [M-H-H2O-HCOOH]-，419 [M-H-2H2O-HCOOH]-;通过与文献[3]比较，鉴定为Ilexgenin A，并在相同的实验条件下通过对照品进行了确证。 3.3 三萜皂苷化合物ESIMS特征质谱规律 表1对以Ilexolic acid，Ilexgenin A，Ilexgenin B和Ilexgenin C为苷元的三萜酸和三萜皂苷化合物ESIMS特征质谱规律进行了， 其ESIMS除了可以检测到m/z [M+Na]+， [M+NH4]+， [M-H]-， [M+Cl]-， [M+HCOO]-特征峰以外，正离子ESIMS1还有非常明显的特征碎片峰， 详细特征峰如下: Ilexolic acid苷元m/z 437; Ilexgenin A苷元m/z 503， 485， 467， 457， 439， 421;Ilexgenin B苷元m/z 455， 437;Ilexgenin C苷元m/z 471， 453， 435。Ilexsaponin A，B和C三萜皂苷的正、负 ESIMS2表1 毛冬青中三萜酸和三萜皂苷的ESIMS质谱特征峰 [M+HCOO]-[M+Na-糖苷(indican)]+[M-H-糖苷(indican)]-均可检 测到失去一个或多个糖苷的特征碎片峰，通常情况下，-162为失去一个葡 萄糖或半乳糖苷，-146为失去一个鼠李糖苷，-132为失去一个木糖或阿 拉伯糖苷。这些规律可用于快速推测复方毛冬青冲剂或毛冬青药材中其它 可能存在的三萜皂苷，为新的三萜皂苷化合物鉴定提供理论依据。 【参考文献】 1 Xiong YouXiang(熊友香), Li Chang(李 昶), Luo XianTang(罗 宪堂). 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