【doc】白细胞介素4增强白细胞介素2诱导的A—LAK细胞抗肿瘤作用

【doc】白细胞介素4增强白细胞介素2诱导的A—LAK细胞抗肿瘤作用 白细胞介素4增强白细胞介素2诱导的A— LAK细胞抗肿瘤作用 由棒一q印回 中华血液学杂志1999年6月第2I1卷第6期Chi?JHemmo1.June1999,20,No+6 )^寻 白细胞介素4增强白细胞介素2诱导的 A_LAK细胞抗肿瘤作用?7?/ 王志华史 ?谢凯 ,一— 近年的研究证明淋巴因子活化的粘 附性杀伤细胞(Adherentlymphokineac— tiviteelkillercells,A-LAK)是一种与普通 LAK细胞不同的细胞群体,对肿瘤细胞 具有较高的杀伤活性.目前国内,外多 采用白细胞介素2(IL2)进行A-LAK细 胞的诱导及活化,为了进一步提高该细 胞的抗肿瘤作用,我们探讨用白细胞介 紊4(IL4)和IL一2联合诱导A_LAK细 胞,以调节其杀伤肿瘤细胞的活性. 材料和方法 1试剂基因重组IL-2(rlL-2)购于长 春生物制品所,重组IL4【rlL一4)为日本 盐野义株式含社产品,LDH—L试剂盒系 中国科学院生物物理研究所制作. 2细胞株人红白血病K562细胞引自 日本北海道大学医学部,Anilp973肺腺癌 细胞及结肠癌细胞系为奉所建立的人癌 细胞株 3实验动物BAL~c裸小鼠,5,6周 龄,雌雄兼用,由中国医学科学院肿瘤研 究所动物室提供. 4培养液及培养条件古体积分数为 10%的小牛血清的I1640培养渡 用于培养肿瘤细胞,含体积分数为10% 的人AB型血清的RPMI1640液用于培 养人的A_LAK细胞,于37?,体积分数 为5%的?湿化空气中培养. 5A-LAK细胞的诱导常规方法分离 脾细胞,用含体积分数为10%的人AB 型血清的RPMI1640培养液调成浓度2 ×IO'/ml,于塑料培养瓶中(每瓶中含 500U/ml的IL一2),常规培养2天,第4 天再加人IL25O0,联合组踪IL2 之外再加^11.45OOml,常规条件再 培养3天用于实验. 6体外细胞毒作用的检测按文献[1] 方法 7体内抗肿瘤作用的观察将BALNc 裸小鼠随机分成对照组.IL一2单独应用 组和IL2+IL一4联合应用组.每组5只, 每只裸小鼠背部皮下接种细胞浓度为5 ×10/的人结肠癌细胞0.1rIll,然后 第1,3,5天单独和联合应用组分别静脉 注入细胞浓度为1x10f砌的效应细胞 02ml,此后每3天用游标卡尺测量1次 肿瘤大小并加以记录. 8统计学处理根据实验不同分别采 用检验和检验. 结果 1体外细胞杀伤活性单用IL2及 IL-2和IL4联用可成功地诱导A-LAK 细胞的活化,该细胞对NK细胞敏感的 K562细胞和NK细胞非敏感的Anip973 细胞均显示较强的杀伤活性,但联合应 用组比单用组杀伤靶细胞的能力有较大 的提高.从表1可见联合组对Anip973 细胞的系伤率为7768%.而单用组为 ? 研究? 3900%,对K562细胞的杀伤率也显示 类似结果. 2体内抗肿瘤作用按前述方法,先将 结肠癌细胞接种给Rc裸小鼠,再给 予IL2或IL_2和IL_4联合诱导的A LAK细胞,和对照组相比,治疗组有明 显的抑制肿瘤生长的作用但联合组的 治疗结果较之单用IL-2诱导组差异更 加明显(P<Oo1),结果详见表2. 实验结果提示用IL2和IL4联合 诱导可更好地活化A_LAK细胞,增强其 抗肿瘤作用. 讨论 研究结果表明在肿瘤免疫中细胞免 疫发挥相对重要的作用,近年来有关A- LAK细胞的研究发现,该细胞比常规 LAK细胞具有扩增速度快,杀伤活性强 等特点,引起了研究者们概火的关注. 然而如何加强肿瘤生物疗法及其疗 效一直是研究者们致力解决的一大难 ,A1LAK细胞的发现无疑给肿瘤的牯 床治疗提供了一种新的手段. 表1IL增强IL2诱导的A-LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性(?S) 注:敢应细胞和靶细胞之比为40:1,杀伤活性显示的数值为3扶测定的平均值 *P<oo1.#P<o01 表2IL-4联合IL-2诱导的A.LAK细胞对裸鼠移植人 结肠癌细胞生长的抑制作用 本课题受国家自然科学基金资助注:对照组为静脉注人经同样培养条件的不加人 IL2括化的脾细瞻;肿瘤重量为第40无 作者单位:1500~咭尔滨医科大学肿的测量结果;J【,2组与JL_4】L_2蛆分别为IL_2 诱导的LAK细胞组和IL4IL-2诱导 辔研究所的A-LAK细胞组?两者比较?P<001 讯 日益增多的事实证明,结构不同的 细胞园子常有类似或重叠的活性,联合 使用可出现累加甚至协同作用,不同因 子联合使用既可提高疗效叉可降低剂 量收到增效减毒的作用拉. 有研究者证实在诱导人或鼠的淋巴 细胞时,IL-4和lL2共同应用比单独使 用一种细胞园子更有促进细胞增殖的能 力能更好地促进幼稚CD4细胞分化为 成熟细胞..』.另外.G~nma等比较了 A-LAK和lAK细胞在l2存在下产生 细胞因子的情况,指出LAK细胞比 LAK细胞产生更多量的肿瘤坏死园子, 并且A—LAK细胞本身还产生IL—l和 IL4,这可能是A'LAK细胞在抗肿瘤方 中华血液星翌志1999年6月第20卷第6期chIn』Herrmto],June1999,vd加,No6 面优于普通LAK细胞的一个因素.生物学特性及其体内外抗肿瘤作用的研 实验中,我们在IL-2单独诱导A-究中国实验临床免疫学杂志,1997,9: 胞的基础上,尝 .皇L联合诱2细胞因子的抗瘟和促癌作用.见:导活化A- LAK~,结果在Anlp973和':;: K562细胞中获得了较好的效果,在小鼠云南科技出版社,1994.19. 体内实验中提高了该效应细胞对人结肠3SederRAThepr~aceofinterleukln4 癌细胞的抑瘤作用.这一结果支持上述duringinvivoprimingdetermine~the]ym一 研究者的观点ph.kmp州uc.曲namuceUs 至于l4是如何通过与细胞表面Mfro .d m .裂嚣删吣' 的IL-4受体的结台,触发细胞内的某种4(印瑚aCIni【不)andivo?Dar9_m0f 结构导致细胞活化增强及抗肿瘤机制的 theacfivity0fhumea~I>vrkohokin}acrivited 发生,还有待于今后更深入地研究.ki[1er(LAK)cellddherentLAKodls. 参考文献 1史桂兰.王志华,邢任儒A-LgK细胞的 3l一{ 抗P-gp单克隆抗体的制备和鉴定jz一亏 熊冬生杨纯部晓枫许元富许立忠栾风君王小华 n~lrl基因的表达产物P一糖蛋白 (PI70,P-gp)作为一种外排泵,在ATP 的参与下,可将细胞内的药物运到细胞 外,从而使细胞产生多药耐药(愀). 我们利用杂交瘤技术制各了一株抗P—gp 单抗,并初步探讨了其在枯床上的应用 前景. 材料和方法 1细胞系}?,60,K562,小鼠骨髓瘤 细胞系&o2/0均由本所提供,阿霉素和 长春新碱诱导的多药耐药细胞林K562/ A02和K562/VCR由本室建立,MCF_ 7,阿霉紊诱导的多荮耐药细胞株MCF- 7]Adr由北京市肿瘤防治研究所刘叙仪 教授惠赠,HL一60/ADR是由阿霉素诱导 的MDR相关蛋白基因过度表达的MDR 细胞株,引自日本细胞库,JSB-1单抗购 自香港SeekersTechnicalTrading公司. 2抗K562/A02单克隆抗体杂交瘤的制 本课题受国家863项目和卫生部科学基 金(93006)资助 作者单位:300020天津,中国医学科学 院,巾国协和医科大学血液学研究所 备8周龄雌性BAc小鼠(中国医学 科学院动物中心提供)常规腹腔免疫 K562/A023捉,每攻l×l细胞,每次 间隔3周,末次静脉加强免疫K562/A02 细胞后按常规方法取免疫脾细胞与sin/ 0骨髓墙细胞融台,促融剂为体积分数 为50%的PEG(相对分子质量为1450, Sigma公司).经问接免疫荧光法筛选和 有限稀释法3次克隆,获得一林能分越 抗K~62/A02和MCF-7/Adr单抗的杂交 瘤细胞株P印.将杂交瘤细胞注八 经降植烷处理的&c小鼠腹腔中,诱 导腹水,采用硫酸铵沉淀法和DEAE-蓝 色亲和凝胶分离纯化P}{MAf)2单克隆 抗体. 3免疫球蛋白(Ig)亚类和轻链类型的 鉴定PHMA02培养上清,经浓缩2O倍 后,用双向免疫扩散法鉴定单抗的lg亚 类和轻链亚型. 4单克隆抗体识别抗原的鉴定K562 和K562/A02细胞膜的制备按文献[2]方 法进行.将制各的K562和K562/A02 细胞膜进行SDS-PAGE(50L)电诛. 电泳完毕,将凝胶覆盖在硝酸纤维素膜 (Promega公司)上,用蛋白质转移电泳仪 (收稿:1998-0618修回:1998—12.15) (校对:忤乾玉) (~io-Rad公司)进行转移(电压l2(】V,2 小时),然后按文献[3]的方法进行. 5单克隆抗体n2的初步枯床应 用用PHMA02单抗检测35例白血病 患者骨髓标本,5名正常人外周血(由本 所血液病医院和中国人民解放军总医院 提供),白血病患者均经Mlc分型确诊. 取患者骨髓2--3rnl,肝索抗凝,FimU分 离单个核细胞,用FACS和间接免疫荧 光法检测P—gp的表达.同时,用国外抗 P-gp单克隆抗体JSB1做平行实验. 6统计学处理采用检验,用医学统 计软件处理. 结果 1分泌抗P-gp单克隆抗体杂交瘤细胞 系的建立将sP2J'0骨髓瘤与K562/ A02免疫的小鼠脾细胞融合,融台率为 70%,经间接免疫荧光法筛选和3次克隆,建立了一株能分泌P—gp单抗的杂交 瘤细胞株,命名为~HMA02,体外连续培 养传代3个月和蒗氨保存18个月以后 复苏,其单克隆抗体分泌水平不变,在降 植烷预处理的BAI.c小鼠中诱导出富 含单克隆抗体的腹水.