医药学论文-磁珠包裹的人视网膜色素上皮细胞受磁场牵拉后ET-1的表达

医药学论文-磁珠包裹的人视网膜色素上皮细胞受磁场牵拉后ET-1的表达 作者：王建洲，惠延年，侯旭，韩泉洪，王雨生，徐渊 【摘要】 目的：探讨在体外RPE细胞受牵拉后内皮素（endothelin-1，ET-1）的表达。方法：用磁珠与RPE细胞粘和后，受磁场受力牵拉细胞的原理，用原位杂交、免疫组化和放射 免疫测定法，检测牵拉对ET-1表达的影响。结果：在磁场中受力牵拉后，随着RPE受牵拉时间的延长，RPE形态发生改变，RPE细胞在各作用时间段后的24h ET-1表达明显，在细胞上清液中，ET-1含量也明显上升，作用10，30min和2h培养24h和48h的细胞调理液的ET-1含量与对照组均有统计学显著性差异（P < 0.05）。结论：RPE 细胞受牵拉后，ET-1表达和分泌增强，提示视网膜脱离发生过程中，会刺激表达ET-1增强。 【关键词】 牵拉 磁珠 磁场 内皮素 视网膜色素上皮细胞 0引言 我们曾发现，在孔源性视网膜脱离（RRD）后玻璃体液中可检测出内皮素（endothelin-1，ET-1）[1]。视网膜脱离后，发生RPE和视网膜神经层的机械分离，是RRD发生和发展的关键环节。这一过程对RPE产生牵拉变形作用，对ET-1的表达是否有作用？RPE细胞是PVR形成的重要细胞，RRD过程中可能的牵拉、缺氧、炎前因子、失去正常的接触等因素中，已经证 明缺氧、炎前因子等因素刺激RPE细胞ET-1的表达[2,3]；而牵拉过程中，细胞变形对ET-1表达的影响尚无报道。我们通过一个机械牵拉模型模拟视网膜脱离前RPE细胞的状态，检测机械牵拉对RPE细胞表达ET-1的影响。 1材料和方法 1.1材料 从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后24h内分离培养RPE细胞。参考王雨生等[4]方法，将眼球用含50mg/L庆大霉素的 D-Hanks’液冲洗2次，当细胞至3～6代后用于实验。DMEM-F12培养基（Costar公司），24孔培养板（Costar公司），ET-1原位杂交试剂盒，兔抗ET-1、SABC试剂盒，DAB试剂盒（博士德公司）。碘125-内皮素放射免疫分析试剂盒（北京免疫技术研究所）。实验所用磁珠(美国Aldrich公司)， I型胶原（美国Sigma公司），矩形永磁铁（2.2cm×9.6cm×11cm）（西北有磁研究所制作）。 1.2方法 将I型胶原加入0.1mol/L醋酸中，室温下搅拌1h至完全溶解，调节终浓度 为1g/L的胶原溶液。在胶原溶1mL中加入磁珠0.4g，用100μLNaOH(0.1mol/L)调pH至7.4，于37?孵育2h，胶原即吸附在磁珠上。磁珠悬液置于磁力架上，静置5min，使磁珠与溶液分离，弃去上清，加入PBS 1mL重悬，重复洗涤3次。最后在PBS中平衡24h。使用前混匀。以5×107/L的细胞密度接种无菌盖玻片平铺于24孔培养板中1mL 细胞悬液，置于50mL/L CO2孵箱中培养。加入包被胶原的磁珠，孵育40min，以PBS冲洗3次，加入磁场受力10，30min；20h，继续培养6，24，48h后，950mL /L酒精固定备用[5]。给细胞施加垂直方向磁场。磁 场由一块矩形永磁铁产生，距离细胞培养板底2cm磁场强度为400 Gauss(G)（图1）。细胞在垂直力的作用下被拉伸，这个力是细胞表面的磁珠在磁场作用下所产生的，物镜位于细胞培 养皿底部。 图1 机械牵拉细胞模式图 1.2.1受力后RPE的形态改变 RPE细胞粘附磁珠后,加入磁场受力10，30min；20h,观察RPE细胞受力后形态改变。 1.2.2 RPE细胞ET-1表达 取已固定的细胞爬片,分别用原位杂交和免疫组化的方法检 测RPE细胞对ET-1的表达。 1.2.3调理液中ET-1含量 在上述细胞培养6，24和48h后，收集24孔板中细胞上清液，按放射免疫测定说明书，冻存于-20?冰箱待用。按其放射免疫测定操作程序，检测在磁 场作用不同时间和作用后不同时间段上清液中ET-1含量，按放射免疫测定步骤，使用美国 Cap Rial 6型自动γ计数器检测，根据标准曲线直接计算ET-1含量。 为定量分析在不同时间磁场作用下RPE表达ET-1的差异，应用LeicaQ5OOMC图像分析仪测定ET-1 mRNA 和ET-1在RPE细胞反应强度(平均黑度)，每张照片任取5个RPE细胞的平均灰度值与背景平均灰度值的差值，进行单因素方差分析。 统计学处理：采用SLM统计软件进行单因素方差分析，多组间的比较采用最小显著差法。 作用组之间的相同观察时间的比较采用配对t检验。 2结果 2.1 RPE细胞牵拉后的表现 磁场作用前，包被磁珠的RPE细胞为较为圆的梭形、三角形 和多边形，并伸出突起细胞间连接（图2A）；磁场作用10min，细胞形态和密度没有明显的改 变（图2B），作用30min，细胞变长，密度有所下降，但细胞连接变粗大，细胞尚饱满（图 2C），作用2h和4h，除了细胞变稀疏外，少数细胞变圆，并有空泡，细胞进一步变细变长（图 2D）。 图2 粘附磁珠作用的RPE细胞（×400）。A：未加磁场；B：磁场作用10min；C：磁场作用30min；D：磁场作用2h 2.2 RPE的ET-1的表达 牵拉10，30min；2h后，观察6，24，48h的细胞爬片免疫组化染色，在牵拉30min组和2h组，ET-1的表达逐渐加强，2h组除随时间表达增强外，RPE形态变长（图3，4）。免疫组化图片：磁场作用30min，F =25.181，P <0.01，培养24和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.05，0.01，图5）。原位杂交图片：磁场作用10，30min；2h，培养24h后，F =15.732，P < 0.01，30min和2h与对照组有统计学显著性 差异（P < 0.01，图6）。 2.3细胞调理液中ET-1的含量 经牵拉的细胞调理液，经放射免疫测定（表1）：磁场作用10min，F= 5.754，P < 0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异 （P <0.05，0.01）。磁场作用30min，F =6.366，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P < 0.05，0.01）。磁场作用2h，F =6.96，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.01，0.05）。作用组之间的相同观察时间用配 对t检验比较均无统计学显著性差异。 3讨论 孔源性视网膜脱离的发生是一个多方面影响因素所导致的结果，其中，玻璃体对视网膜 的牵拉和视网膜下液的重力作用，均可造成视网膜神经上皮与RPE的分离，而这种拉力会造 成RPE的变形和损伤，在这样的过程中，会对RPE内部造成怎样的影响，一直是悬而未解的 问题。本实验模型所生成的力是通过一块永磁铁作用在包被于细胞表面上的金属磁珠而产生 的。可以近似地模拟视网膜脱离发病前RPE细胞在眼内的受力情况。前期工作发现，在这种 磁场条件下，对培养人视网膜色素上皮细胞的增生和移行造成影响，并对RPE细胞内钙离子造成改变[5,6]。 ET-1是最早从脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的一种分子量为2.5KD (M, 2500D) 的活性物质，是21个氨基酸残基多肽，有较强收缩血管作用。随后的研究发现，ET-1不仅仅是血管收缩剂，而且是一种多功能调节肽，具有广泛的生物学效应，具有介导炎症、刺激其 它激素分泌、促有丝分裂、刺激细胞增殖、移行和粘附等多种功能，通过自分泌和旁分泌方 式经受体发挥作用。ET-1是一种多项生物学活性的多肽，具有促进细胞有丝分裂，促增生作 用[7]，并且，前期工作，在视网膜脱离病人的玻璃体液中检测出ET-1的含量[1]，在视网膜脱离病人的手术中取出的增生膜中，检测出ET-1的细胞表达[8]，并探讨了ET-1 与增生膜收缩的关系[9]。那么，在RPE细胞，视网膜脱离的关键环节－牵拉会对ET-1的表达与分泌有怎样的影响？ 丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）级联是细胞内重要的 信号转导系统，参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程。细胞受力可以通 过MAPK级联反应途径，刺激转录ET-1 mRNA[7,10]。White等[11]发现在血管内皮，血流的 剪切力可以通过MAPK途径促进ET-1的分泌，以调节血管的紧张度。Liang 等[12]在体外培养的心肌细胞机械牵拉，细胞变形受力后可以使MAPK途径激活和转录ET-1 mRNA。实验显示，在牵拉后的形态观察中，随着牵拉时间的延长，RPE从在培养状态中的密度，形态都发生了 改变。牵拉10，30min；2h后，观察培养6，24，48h的细胞爬片免疫组化和原位杂交染色， 在牵拉30min组和2h组，ET-1的表达逐渐加强。，磁场作用10，30min；2h，培养24h后，ET-1mRNA的表达逐渐加强。图像分析显示，呈强度依赖性。经牵拉的细胞调理液，经放射免 疫测定，磁场作用10，30min；2h，培养24和48h均与对照组有统计学显著性差异。作用组 之间的相同观察时间用配对t检验比较均无统计学显著性差异。实验结果表明，RPE细胞受到牵拉后，RPE从形态和信号转道等多方面发生改变，因此，牵拉是视网膜脱离发生的原因 之一，也是RPE细胞发生改变的一个因素。其中，受到牵拉后，表达ET-1增强，说明RPE细胞牵拉损伤后可能对ET-1的表达有一定的影响，因此，在RRD，牵拉可能是刺激视网膜表 达和分泌ET-1的一个因素。 【参考文献】 1王建洲,惠延年,王丽丽,朱赛林,朱忠桥,马吉献,林国成.内皮素-1在裂孔性视网膜脱离玻璃体液中的含量测定.眼科研究,2003;21(2):116-1172 Narayan S, Prasanna G, Krishnamoorthy RR, Zhang X, Yorio T. Endothelin-1 Synthesis and Secretion in Human Retinal Pigment Epithelial Cells (ARPE-19): Differential Regulation by Cholinergics and TNF-alpha. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003;44(11):4885-48943 Udono T, Takahashi K, Nakayama M, Yoshinoya A, Totsune K, Murakami O, Durlu YK,Tamai M, Shibahara S.. Induction of adrenomedullin by hypoxia in cultured retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42 (5):1080-10864王雨生,严密.可见光对原代培养人视网膜色素上皮细胞的光化学损伤.中华眼底病杂志,1996;12(3):174-1765侯旭,惠延年,韩泉洪,张晓光,王建洲,郭长梅.机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响.国际眼科杂志,2005;5(1):50-546侯旭,惠延年,韩泉洪,张晓光,王建洲,郭长梅,王海燕.机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞增生和移行的影响.眼科新进展,2005;25(3):3205-32087 Prasanna G, Narayan S, Krishnamoorthy RR, Yorio T. Eyeing endothelins: a cellular perspective. Mol Cell Biochem, 2003;253(1-2):71-888王建洲,惠延年,马吉献.增生性玻璃体视网膜病变增生膜中内皮素的表达.第四军医大学学报,2003;24(10):921-9229王建洲,惠延年,马吉献,苏静波.内皮素与平滑肌激动蛋白在视网膜增生膜中的表达.第四军医大学学报,2002;23(7):623-62510 Angel P, Karin M. The role of Jun,Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta,1991;1072:129-15711 White CR, Haidekker MA, Stevens HY, Frangos JA. Extracellular signal-regulated kinase activation and endothelin-1 production in human endothelial cells exposed to vibration. J Physiol ,2004;555(Pt 2):565-57212 Liang F, Lu S, Gardner DG. Endothelin-dependent and -independent com- ponents of strain-activated brain natriuretic peptide gene transcription require extracellular signal regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase. Hypertension,2000;35(1 Pt 2):188-192