当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用

当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用 当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和 红细胞溶血作用 天然产物研究与开发NatProdResDev2009.21:679-683 文章编号:1001-6880(2009)04-0679-05 当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用 刁鹏飞,郭延生,刘宝剑,邓红娟,魏彦明 甘肃农业大学动物医学院,兰州730070 摘要:研究当归水提液和醇提液对小鼠肝组织自发性过氧化酯质分解产物丙二醛 (malondialdehyde,MDA)的 生成和对红细胞膜脂质过氧化及红细胞溶血作用的影响.采用TBA比色法测定肝组织匀浆 MDA生成,分光光 度法测定过氧化氢诱导红细胞膜脂质过氧化和溶血.实验分为空白组,对照组,加药组.加药 组分为25,5O, 100和200mg/mL四个浓度组.当归水提液和醇提液均在25,200mg/mL的浓度范围内,能够 明显抑制小鼠肝 组织匀浆自发性MDA的生成,具有抑制过氧化氢诱导红细胞膜脂质过氧化和溶血的作用, 抑制效果随当归水 提液和醇提液浓度的增大而逐渐增强,抑制率与药物浓度成良好的量效关系.当归水提液和 醇提液具有抗脂 质过氧化和红细胞溶血的作用. 关键词:当归;脂质过氧化;红细胞溶血;小鼠 中图分类号:Q946.91:R285.5文献标识码:A EffectofWaterandAlcoholicExtractsfromRadixAngelicaesinensison Anti—lipidperoxidationandHemolysisofErythrocyteinvitro DIAOPeng—fei,GUOYan—sheng,LIUBao-jian,DENGHong-juan,WEIYan—ming DepartmentofVerterinaryMedwi~,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730D70,China Abstract:InordertostudytheeffectofwaterandalcoholicextractsfromRadixAngelicaesinensisonMDAspontaneous formationinliverhomogenatesofmice,lipidperoxidationandthehemolysisoferythroeyteinvitro.MDAinmouseliver homogenateswasdeterminedbyTBAcolorimetry,andtheerythrocyticmembranouslipidperoxidationanderythrocytie hemolysisinducedbyH2O2weredeterminedwithspectrophotometers.Experimentalanimalsweredividedintonormal group,controlgroup,anddruggroup.Druggroupwasdividedintofourconcentrations(25,50,100and200mg/mL).The resultsshowedthatwaterandalcoholicextracts(25-200mg/mE)CansignificandyinhibitMDAspontaneousformationin homogenatesofmouseliver,theerythrocytiemembranouslipidperoxidationanderythrocytichemolys isinducedby H2O2.Andthatinhibitoryeffectshowedaconcentration—dependantmanner.Itwasconcludedfromth eresultsthatwater andalcoholicextractsfromRadixAngelicaesinensishavetheeffectoftheanti--lipidpemxidationandhe molysisoferythro?- eyte? Keywords:RadixAngelicaesinensis;lipidpemxidation;erythrocytichemolysis;mice 当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels是伞形科当归 属一种多年生草本植物.其干燥的贮藏根是我国常 用中药.主产于甘肃岷县,历代多以甘肃岷县所产 作为道地药材.药用历史悠久,历代本草均有记载, 始记于《神农本草经》,谓之”当归味温,主呃逆上 气”,被列为中品.有补血活血,调经止痛,润肠通 便等功效?J,为医家常用,素有”十方九归”之称. 现代药理学研究当归具有降血压,镇痛,抗炎, 收稿日期:2008-01-24接受日期:2008-04-01 基金项目:国家自然基金项目(30671541) }通讯作者Tel:86-931-7631226;E—mail:weiym@gsau.edu.an 抗菌,抗辐射作用,以及抗损伤,增强免疫功能,抗氧 化和清除自由基作用,另外还有利胆保肝,松弛平滑 肌,美容等作用l2].随着人类对自身机体认识的不 断深化,1956年英国Harman氏提出了”自由基学 说”.自1968年Mccord与Fridovich氏等发现了清 除自由基的超氧化物歧化酶(SOD)以后,对自由基 (freeradicals,FR)的研究进展迅速.FR与疾病的 关系开始被人们所认识.现已逐渐明确FR参与了 感染,炎症,休克,肿瘤,高脂血症,衰老以及再灌注 损伤等的发生与发展过程.在正常情况下,FR的产 生与清除保持着相互平衡,而在某些病理条件下FR 大量增加,超过了清除能力,导致疾病发生,而自由 天然产物研究与开发 基对组织的损伤90%是由脂质过氧化引起.为此, 本实验进行了当归水提液和醇提液对脂质过氧化和 红细胞溶血作用的影响,以探讨当归抗氧化和清除 自由基的能力,旨在为今后当归的炮制,加工及药理 作用和临床应用提供安全,有效的科学依据. 1实验材料 1.1药物和试剂 当归采自甘肃省岷县(由甘肃农业大学中兽医 教研组鉴定).硫代巴比妥酸(TBA),三氯醋酸,盐 酸,过氧化氢,二甲基亚砜等试剂均为国产纯. 1.2仪器 OPPON.3000型紫外/可见光分光光度计(韩 国);CW-2000超声一微波协同萃取仪(上海新拓); TBZ5一WS多管架自动平衡离心机(湘仪);SHB—III 循环水式多用真空泵. 1.3动物 清洁级昆明小鼠,体重18,22g,雌雄兼用,由 中牧股份兰州生物制品厂提供,动物合格证号:医动 字14-001号.常温下饲养. 2实验方法 2.1当归水提液的制备 取生当归100g,加水进行85?超声提取2次, 每次30min.合并两次提取液,减压浓缩至1g/ mL.4?冰箱保存备用. 2.2当归醇提液的制备 取生当归100g,加80%乙醇60?进行超声提 取2次,每次30min.合并两次提取液,回收乙醇, 浓缩成1g/mL浸膏,4?冰箱保存备用. 2.3小鼠5%肝组织匀浆的制备 取小鼠肝组织,用4?生理盐水洗去残血,滤纸 吸干称重.剪碎(表面皿),在冰浴中匀浆,用生理 盐水制成5%组织匀浆.3000r/min离心10min,取 上清液备用. 2.4小鼠0.5%红细胞制备 小鼠眼球采血1—2mL加人到含抗凝剂肝素钠 的离心管里,用生理盐水5—10mL洗涤三次(3000 rpm),每次5min,除去上层液,将红细胞配制成 0.5%悬浮液. 2.5对小鼠肝组织自发性MDA生成的影响 采用TBA比色法L3.j:取5%肝组织匀浆上清液 1mL加入到各试管,分别为空白管,对照管,加药 管,空白管不加组织匀浆,加药管分别加人不同浓度 药物(25,50,100,200mg/mL,下同)0.05mL,空白 管,对照管加入药物溶媒(二甲基亚砜)0.05mL,每 组平行三管.空白管加1mL生理盐水补足体积,摇 匀37?水浴2h,各管加入20%TCA0.3mL,0.1 mol/LHC12mL,0.67%TBA1mL,沸水浴15min, 自来水流水冷却,3000r/min离心10min,以空白管 标零,取上清液于532nm处测定吸光度A. 抑制率=(Azs.管一加药管)/4对照管X100% 2.6对HO诱导的红细胞膜脂质过氧化及溶血 的影响 2.6.1红细胞膜脂质过氧化试验 取红细胞悬液0.5mL加入到各管,分为空白 管,对照管,加药管,各管加生理盐水1mL,加药管 分Srl~1人不同浓度药物0.05mL,对照管,加药管加 H0.(100mmoL/L)0.1mL,用生理盐水补足体积, 摇匀,37?水浴2h,加入20%TCA0.3mL,HC1 (O.1mol/L)2mL,3500r/min离心15rain,取上清 液3mL加入0.67%TBA1mL,沸水浴15min,自来 水流水冷却于535nm处测定吸光度A. 抑制率=(A对熙管一A加药管)/A对照管×100% 2.6.2红细胞溶血试验10-12j 取0.5%红细胞悬液1mL,加入到各试管,分为 空白管,对照管,加药管,加药管分别加人不同浓度 药物0.05mL,摇匀,37?水浴10rain,对照管,加药 管加入100mmol/LH2O20.05mL,空白管,对照管 加生理盐水补足到同一体积,摇匀37?水浴1h,各 管加生理盐水4mL,3000rpm离心10min,取上清 液于425nm处测定吸光度A.以生理盐水标零. 抑制率=(A对照管-A加药管)/(A对照管-A空自管)X100% 溶血度=(A加药管一空白管)/(A对照管一A空白管)X100% 2.7数据统计与分析 用SPSS13.0统计软件进行显着检验和回归分 析,测定结果以?s表示. 3结果 3.1当归水提液和醇提液对小鼠肝组织自发性 MDA生成的影响 当归水提液和醇提液在25—200mg/mL浓度 范围内,随着当归浓度的增大,吸光度逐渐减小,抑 制率逐渐增强,表明当归水提液和醇提液对肝组织 自发性MAD生成有明显的抑制作用.回归分析得 当归水提液回归方程:Y=0.336X+28.862,r= 刁鹏飞等:当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用 0.895(P<0.05),当归醇提液回归方程:Y=0.268X +42.676,r=0.902(P<0.05).计算半数抑制浓 度(IC.),当归水提液和醇提液分别为39.39和 23.77mg/mL,表明当归醇提液对抑制肝组织自发 性MDA生成的效果较水提液好(表1). 表1当归水提液和醇提液对小鼠肝组织匀浆自发性MDA生成的影响(?s) Table1EffectofthewaterandalcoholicextractsfromRadixAngelicaesinensisonMDAspontaneousfor mationinliverhomogenatesof miceinvitro(?s) 注:和对照管比较,P<0.01,差异极显着.P<O.05,差异显着.不同字母表示不同浓度之间差 异显着,相同字母之间差异不显着. Note:Comparedbycontrolgroup,?P<O. 叭,differencewasextremelySignificant.’P<0.05,DifferencewasSignificant.Differentle~erhassigni ficant differencesindifferentinter—concentration,samele~errepresentationnosignificantdifference. 3.2当归水提液和醇提液对HO诱导的红细胞浓度越大,抑制H:O诱导红细胞膜脂质过氧化 的 膜脂质过氧化影响能力越强.回归分析得当归水提液回归方程:y= 从表2可以看出,在25,200mg/mL浓度范围0.167X+29.128,r=0.864(P<0.05),当归醇提液 内,当归水提液和醇提液对H:0诱导红细胞膜脂回归方程:Y=0.337X+26.737,r=0.919(P< 质过氧化有较强的抑制作用,并且随着当归水提液0.05).计算Ic.,当归水提液和醇提液分别 为 和醇提液浓度的增大,对H:0诱导红细胞膜脂质84.88和41.48mg/mL,表明当归醇提液对H:0 诱 过氧化抑制作用就明显,表明当归水提液和醇提液导红细胞膜脂质过氧化的抑制作用优于 水提液. 表2水提液和醇提液对H0诱导红细胞膜脂质过氧化影响(?s) Table2EffectofwaterandalcoholicextractsfromRadixAngelicaesinensisonlipidperoxidationoferyth rocyticmembraneinducedby H202invitro(?s) 注:和对照管比较,P<0.01,差异极显着.P<0.05,差异显着.不同字母表示不同浓度之间差 异显着,相同字母之间差异不显着. Note:Comparedbycontrolgroup,P<O.01,differencewasextremelySignificant.P<O.05,Differe ncewasSignificant.Differentletterhassignificant differencesindifferentinter—concentration,sameletterrepresentationnosignificantdifference. 3.3当归水提液和醇提液对H0诱导的红细胞细胞溶血的能力越强.回归分析得当归水提液 回归 溶血的影响方程:Y=0.289X+44.169,r=0.848(P<0.05),当 从表3可以看出,在检测浓度为25—200mg/归醇提液回归方程:Y=0.137X+20.322,r=0.967 mL的范围内,随着当归水提液和醇提液浓度的增(P<0.01).计算Ic卯,当归水提液和醇提 液分别 大,吸光度逐渐减小,抑制率逐渐加强,溶血度逐渐为23.42和155.82mg/mL,表明当归水提液 对 降低,表明当归水提液浓度越大,抑制H0诱导红H:0诱导红细胞溶血的抑制作用较醇提液更 好. 682天然产物研究与开发 表3当归水提取液和醇提液对H:0诱导红细胞溶血的影响(4-s) Table3EffectsofthewaterandalcoholicextractsfromRadixAngelicaesinensisonthehemolysisoferyth rocyteinducedbyH202in vitro(?s1 注:和对照管比较,P<0.0l,差异极显着.’P<0.05,差异显着.不同字母表示不同浓度之间差 异显着,相同字母之间差异不显着. Note:Comparedbycontrolgroup,P<O.01,differencewasextremelysignificant;P<0.05,differen cewassignificant.Differentletterhassignificant differencesindifferentinter—concentration,sameletterrepresentationnosignificantdifference. 4讨论 MDA是脂质过氧化的终产物之一,它可与硫代 巴比妥酸反应形成一种粉红色的物质,并且可以在 532nm处测得.本研究结果表明当归水提液和醇 提液对肝组织匀浆自发性MDA生成均有明显的抑 制作用,并且随着药物浓度增大抑制效果也逐渐增 强.统计分析结果表明,当归水提液和醇提液各浓 度管与对照管比较差异极显着(P<0.01),当归水 提液除200与100mg/mL之问差异不显着外,其它 各浓度之间差异极显着(P<0.O1).当归醇提液相 邻浓度管之间差异不显着,其它各浓度管之间差异 显着(P<0.05).但两种提取液抑制MDA生成的 效果不同,表现为醇提液抑制效果优于水提液,其水 提液的IC50为39.39mg/mL,醇提液的IC50为23.77 mg/mL,这可能与当归醇提液得到的化学成分比水 提液更复杂有关.药物化学研究表明,当归中主要 含有挥发油,糖类,氨基酸,有机酸等化学成分?引. 当归水提液含有各种水溶性化学成分,例如阿魏酸, 水溶性多糖以及其他可溶于水的各种复杂的化学成 分.阿魏酸是当归抗氧化作用的有效成分,通过直 接消除自由基,抑制超氧自由基引起的膜脂质过氧 化反应和自由基反应以及与生物膜磷脂结合保护膜 脂质等多种机理拮抗自由基对组织的损害_1.研 究发现,当归多糖通过抑制MDA,NO生成,减少谷 胱甘肽清除作用,拮抗CCIA诱导的氧化性肝脏损 伤,表现出抗氧化作用.本实验醇提液是采用 80%乙醇溶液进行提取的,其提取液中包含有水溶 性化学成分,也包含有溶于乙醇等有机溶剂的一些 复杂的化学成分,可能是其抑制肝组织自发性生成 MDA的原因之一. 红细胞膜脂质过氧化的测定原理同肝组织自发 性生成MDA相同,均是以测定MDA来反映脂质过 氧化程度.本实验结果表明,当归水提液和醇提液 对HO诱导的红细胞膜脂质过氧化都有明显的抑 制作用,回归分析和Ic卯均表明,随药物浓度增加抑 制效果逐渐增强.同样当归醇提液的抑制作用优于 水提液,与上述测定肝组织匀浆自发性MDA生成 的结果一致. 红细胞在体外与H:O:反应后也可产生脂质过 氧化的主要产物MDA,MDA可交联磷脂及蛋白质, 还可使蛋白质的巯基氧化,损伤红细胞膜,使之容易 产生溶血?.本实验结果显示当归水提液和醇提 液对红细胞溶血有明显的抑制作用,随浓度增加抑 制效果逐渐增强,并且溶血的抑制率同上述实验测 得红细胞膜脂质过氧化抑制率的趋势是一致的,这 提示抑制红细胞溶血与抑制红细胞膜脂质过氧化相 关.统计分析结果表明,当归水提液和醇提液各浓 度与对照管之间差异极显着(P<0.01).但是,两 种提取液的作用效果不同,醇提液对红细胞溶血的 抑制效果没有水提液的效果明显.这说明红细胞溶 血不完全取决于红细胞膜脂质过氧化作用,可能是 由于当归醇提取液中含有的某些化学成分促进了溶 血作用的产生,使其抗溶血作用的效果较差,其有关 机理还有待于进一步研究. 当归水提液和醇提液对小鼠肝组织匀浆自发性 MDA的生成,H:0诱导的红细胞膜脂质过氧化及 H0:诱导的红细胞溶血都有明显的抑制作用,从回 V0L21刁鹏飞等:当归水提液和醇提液体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用683 归分析和Ic.均可以看出,随着药物浓度的增大其 抑制效果逐渐增强,且抑制效果与药物浓度之间呈 良好的线性关系.但当归醇提液对小鼠肝组织匀浆 自发性MDA生成和对H:0诱导的红细胞膜脂质 过氧化的抑制效果要好于水提液,而当归醇提液对 H:0诱导的红细胞溶血的抑制作用不如水提液的 效果明显. 参考文献 1LiYB(李元波),YinHA(殷辉安),ZengY(曾英),eta1. 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