改进原代心肌细胞培养

改进原代心肌细胞培养 一、器材及试剂准备 1、4个烧杯(1个装棉球及酒精，1个装大鼠，2个用于盛75%酒精)，离心管架，冰袋; 2、消毒用具: (1)高压饭盒内装:棉球、3把小剪子(1把剪皮肤，1把剪肋骨，1把用于剪碎心脏)、2把镊子(大镊子用于夹取灭菌后的器具，小镊子用于夹取心脏等)、玻璃离心管、培养皿等; (2)玻璃吸管; 3、试剂: (1)过滤除菌的D-Hanks液; (2)含10%胎牛血清的DMEM;(有的用小牛血清，因为其营养成分少，可抑制纤维细胞的生长) (3)不含EDTA的0.125%胰酶; (4)0.08%的胶原酶II; (5)10mmol/L的储存液BrdU(需避光保存),使用时需要以1:100的浓度稀释，直接加入培养瓶中; (6)75%酒精。 二、细胞培养(15只大鼠) 1、将棉球放入含有75%酒精的烧杯，将完全培养基倒入玻璃培养皿中，置于冰袋上; 2、将饭盒打开，将饭盒盖里面朝上放置，用已用紫外照过的大镊子取出2把剪子，1把镊子，沿着饭盒盖摆好备用，用大镊子将离心管夹出放在架子上备用; 3、用大镊子将小鼠从垫料中取出，放入盛有75%的酒精缸I中，10s,取出，放入另一个盛有75%的酒精缸II中，10s,取出; 4、取出一个用酒精浸泡过的棉球，垫于大鼠腹部，以防取心脏时手套被血污染; 5、左手食指和中指夹住小鼠头部，拇指夹住其右上肢，无名指和小指夹住其下腹部，剪刀I从剑突下沿胸骨剪开皮肤，再用剪刀II剪开肋骨，可见心脏蹦出，用镊子将心脏夹出，放入含有血清的DMEM中，用镊子将心脏中的血挤出(每处理完一只大鼠，均要用酒精棉球将剪子和镊子擦干净); 6、将心脏全取出，挤完血后，将培养基吸出弃去，加入无血清DMEM，并用剪刀II及镊子将心房和血管除去; 7、将无血清DMEM及心房和血管组织吸净，用剪刀III将心脏剪成碎，成泥状; 8、用0.125%的胰酶4ml吹悬剪碎的心脏组织(可逐步加至4ml，15只大鼠用4ml胰酶)，并将之移到离心管中; 9、水浴:将离心管放到水浴锅中，振荡5min,弃上清; 10、再向离心管中加入3.5ml的胰酶(胰酶用量逐渐减少，防止细胞过度消化)，振荡水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，分别放到两个新的离心管中; (丝状的物质内含有丰富的细胞，应将它放入盛细胞的离心管中) 11、向有细胞的离心管中加入含有血清的DMEM终止消化，向有沉淀的离心管加入3ml的胰酶，继续水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中; 12、将胰酶的量减至3ml，重复步骤10-11; 13、向含有沉淀的离心管中加入2.5ml胰酶+2.5ml胶原酶II，水浴消化10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中; 14、向有细胞的离心管中加入含有血清的DMEM终止消化，向有沉淀的离心管加入2ml的胰酶+2ml胶原酶II，继续水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中; 15、重复步骤14-15，共计消化8次;(理想状态:无肉眼可见的组织块，每次水浴后可见上清浑浊，吸取时可见丝状物) 16、将含有细胞的离心管离心，1000rpm*10min; 17、将每个离心管中的白色块状沉淀以及漂浮着的丝状物吸出，放入一个新的试管中，加入适量含有血清的DMEM，吹悬细胞，并将之种到培养瓶或培养皿中，以1:100的比例加入10mmol/L的BrdU抑制心肌细胞的生长。(15只大鼠种了5个小培养皿)