[生活]髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证

[生活]髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证 ,,大学 目:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽 免疫原性验证 学生姓名: XXX 学号: XXXXXXXXX 指导教师: XXX 职称: 教授 专 业: 生物技术 院,系,: 生物工程系 完成时间: 2011年5月25日 2011年5月25日 摘要 目的: 通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型的建立，验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原肽免疫原性。并通过观察EAE病理学变化，初步探讨多发性硬化(MS)的发病机制。 方法: 本实验室利用Fmoc固相合成法制备的MOG抗原肽(纯度>95%)加完全弗氏35~55 佐剂(CFA)免疫C57BL/6小鼠，观察小鼠发病情况，并采用双盲法进行神经功能评分。利用电子显微镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。 结果: MOG成功诱导了C57BL/6小鼠EAE模型。免疫后15天起，小鼠开始陆续出现35~55 临床症状，至第21天发病率达100%。电子显微镜下可见EAE小鼠脊髓中典型脱髓鞘现象，并伴随有典型的炎性细胞的浸润。 结论: 用本实验室合成的抗原肽MOG诱导的C57BL/6小鼠EAE模型，发病率高，模35~55 型稳定，为进一步研究多发性硬化(multiple sclerosis, MS)的发病机制与治疗打下基础。 关键词:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎、动物模型、神经病理学 Abstract Objective The model of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) was established in female C57BL/6 mice to validate the immunogenicity of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), to observe pathological changes of EAE, and to explore the possible pathogenesis of multiple sclerosis(MS). Methods Each mouse was injected s.c over flanks with MOG, Mycobacterium H37Ra, and CFA, 35-55 injected i.p with pertussis toxin. The clinical symptoms were observed and the pathological changes of EAE were studied with the electron microscopy. Consecutive sections were stained with hematoxylin/eosin(HE) and Luxol Fast Blue(LFB), to assess inflammation and demyelination. Results The incidence of EAE in immunization animal reached 100%, most mice developed clinical EAE with in about 15 days of immunization MOG peptides. With Electron 35~55 microscopy, inflammatory cells in white matter and demyelination were observed. And the component of axon is disappeared. Conclusion The immunogenicity of MOG synthesized by the improved solid-phase synthesis 35~55 method was identified by the induction of EAE in C57BL/6 mice with stable performance and high incidence, which may be helpful in exploring the mechanism and therapy of Multiple sclerosis(MS). Key Words: Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG), Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE), Mouse models, Pathological changes 目录 引言.........................................................................................................................................................1 一、材料和方法 .........................................................................................................................2 1. 试剂和仪器 ............................................................................................................................ 2 1.1. 主要试剂 ............................................................................................................................. 2 1.2 主要仪器................................................................................................................................ 2 2. 实验动物.................................................................................................................................. 2 2.1 小鼠来源................................................................................................................................ 2 2.2 饲养 ......................................................................................................................................... 23. EAE小鼠模型的制备...................................................................................................... 3 4. 神经功能评分 ....................................................................................................................... 3 5. 脊髓组织病理学检测取材 ............................................................................................ 3 6. 溶液的配制 ............................................................................................................................ 3 7. H&E、LFB染色 ................................................................................................................ 4 7.1 H&E染色................................................................................................................................. 4 7.2 LFB染色................................................................................................................................. 5 8. 数据分析及统计学处理.................................................................................................. 6 二、实验结果与分析.............................................................................................................6 1. 临床评分.................................................................................................................................. 6 2 病理学检测结果 .................................................................................................................... 7 2.1 H&E结果................................................................................................................................. 7 2.2 LFB的结果 ............................................................................................................................ 8 三、讨论 ............................................................................................................................................9 参考文献 ......................................................................................................................................... 10 致谢...................................................................................................................................................... 12 引言 实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是研究多发性硬化(multiple sclerosis, MS)的经典动物模型，是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性模型。其病理特征和MS相似，均现为CNS白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。 制备EAE动物模型的方法多种多样，可通过注射CNS髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其选择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导;或转移已致敏的CD4+T细胞进行过继免疫诱导。诱导EAE由于不同的致敏原，动物品系或诱导方法可以诱导产生不同类型或不同程度的EAE，所以制备EAE动物模型的方法多种多样。目前报道较多的EAE模型动物是Lewis大鼠、SJL/J小鼠、B10.PL小鼠和PL/J小鼠等。但国内不易获得这些啮齿类动物，因而在制作EAE动物模型时均不作为首选。 C57BL/6小鼠也是具EAE敏感特性的品系之一，其对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的敏感抗原表位是35~55位氨基酸。MOG抗原肽含21个氨基酸，分子量为2582.4道35~55 尔顿，是唯一既能引起脱髓鞘抗体反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。虽然MOG在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。参照国内外文献报道的方法，结合本实验室的条件加以改进，拟采用MOG作为抗原，35~55辅以腹腔注射百日咳毒素，以期成功构建C57BL/6小鼠EAE模型，来验证其免疫原性;并采用双盲法进行神经功能评分，利用电镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。 一、材料和方法 1. 试剂和仪器 1.1. 主要试剂 MOG多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由本实验室合成，合成纯度35-55 HPLC>95%，完全弗氏佐剂(CFA, Chodrex)，百日咳毒素(Pertussis toxin, Sigma)，结晶紫Cresyl viole(Sigma)，碳酸锂(上海华硕精细化学品有限公司)，坚牢兰Luxol-fast-blue (Alfa Aesar)，伊红Y(kermel)，PBS缓冲液(0.01M，PH7.4)，苏木素(郑州派尼化学试剂厂)，多聚赖氨酸(Sigma)，多聚甲醛(Kermel)，无水乙醇，甘油。其它试剂均为国产分析纯。 1.2 主要仪器 TDL80-2B离心机(Anke)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，电子天平(Sartorius)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，4?C冰箱(Siemens)，微波炉(海尔)，冰盒，2ml、5ml玻璃注射器(上海鸽牌玻璃厂)，医用一次性三通管(德国贝朗医疗股份有限公司)，Olympus BX51荧光显微镜(日本Olympus公司)，Leica石蜡切片机(Leica，RM2145)，手术器械(眼科剪、眼科镊、手术刀等)。 2. 实验动物 2.1 小鼠来源 b 健康6~8周龄的雌性野生型C57BL/6(H-2)小鼠(SPF级)共16只。体重16~18g，购自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心，许可证号:SCXK(津)2004-0001。正常组:8只，不作任何处理，EAE病理模型组8只，诱导EAE模型。 2.2 饲养 在,,大学生物工程系SPF级动物房中饲养、繁殖，幼鼠至八周龄后进行实验。 3. EAE小鼠模型的制备 C57BL/6小鼠随机分为EAE组和正常组，各8只。MOG多肽用PBS稀释后与完35~55 全弗式佐剂(结核杆菌的终浓度为4mg/ml)按等体积混合，用注射器反复推拉成油包水的乳剂，每只小鼠注射0.2ml乳剂，其中MOG多肽剂量为300μg/只，分别于鼠背部35~55 两侧皮下注射;在第1次免疫后0小时和48小时腹腔注射百日咳毒素稀释液0.1ml，200ng/只。正常组不做任何处理。 4. 神经功能评分 自免疫当天开始，每日称体质量，观察小鼠的摄食情况，并从初次免疫第0天起至第31天实验终止前，采用盲法，每天2人至少1次在同一时间按Benson评分，对EAE严重性进行临床评估，评分?2分以上者(包括2分)进行发病率的计算。1级:尾部无力或蹒跚步态伴尾部有力;2级:蹒跚步态伴尾部无力(共济失调);2.5级:共济失调伴部分单肢麻痹;3级:单肢完全麻痹;3.5级:单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹;4级:双肢完全麻痹;4.5级:四肢麻痹;5级:死亡。 5. 脊髓组织病理学检测取材 在EAE模型发病的高峰期，将小鼠脱颈处死，迅速取其脊髓，置于4%的多聚甲醛中固定，0.1mol/l PBS 24小时、70%酒精30分钟、95%酒精I 60分钟、95%酒精II 60分钟、100%酒精I 60分钟、100%酒精II 60分钟、60?C二甲苯I 60分钟、60?C二甲苯II 60分钟、60?C石蜡I 60分钟、60?C石蜡II 60分钟后包埋。将石蜡包块用切片机连续切成3~4μm切片，分别作H&E染色、LFB髓鞘染色。 6. 溶液的配制 6.1 Harris苏木精的配制:苏示精1g、硫酸铝钾15g、无水乙醇10ml、蒸馏水200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1分钟后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g。继续加热至浆夜变为紫红色。用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 6.2 乙醇性伊红液Y的配制:伊红Y0.5g、90%酒精100ml先将伊红溶于酒精，用玻棒研 碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。 6.3 盐酸酒精分化液的配制:浓盐酸0.5~1ml、75%酒精99ml。 6.4 LFB的配制:LFB 1.0g、95%酒精100ml、10%冰醋酸5.0ml混匀、过滤。 6.5 0.05%碳酸锂的配制:碳酸锂0.5g、双蒸水1000ml。 6.6 0.25%Cresyl viole结晶紫的配制:结晶紫0.25g、双蒸水100ml、10%冰醋酸1.0ml混匀、过滤。 7. H&E、LFB染色 7.1 H&E染色 ? 使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为3-4μm厚，用毛笔小心将其放入45?水浴锅中展片， 并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于,60?烘箱中烘干(3小时); ? 将切片依次直接放入有500ml的100%二甲苯的两个染缸中，各5分钟; ? 之后再将切片依次放入有500ml的95%酒精的两个染缸中，各2分钟; ? 结束后再将切片依次放入有500ml的80%酒精的染缸中，染色1分钟; ? 之后将其置入蒸馏水中，浸泡1分钟; ? 取出后置入有500ml的Harris苏木素的染缸中，染色5分钟; ? 取出切片，快速用流水冲去多余Harris苏木素液(3s)。8，将切片快速依次置入有 500ml的1%盐酸乙醇的两个染缸中，各分化2秒，并用流水冲去多余染液，20分钟; ? 用蒸馏水冲一下，立即置入有500mml的伊红的染缸中，染色2min; ? 用蒸馏水快速冲一下，2秒，之后依次过80%酒精，2秒，95%酒精3秒，95%酒精5 秒，100%酒精两次，各5分钟，二甲苯两次，各3分钟; ? 取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。 7.2 LFB染色 ? 使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为3-4μm厚，用毛笔小心将其放入45?水浴锅中展片， 并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于60?烘箱中烘干(3小时); ? 将切片依次直接放入有500ml的100%二甲苯的两个染缸中，各7分钟; ? 之后再将切片依次放入有500ml的100%酒精的两个染缸中，各2.5分钟; ? 结束后再将切片依次放入有500ml的95%酒精的三个染缸中，各2.5分钟; ? 再将切片置入有500ml的LFB染液的染缸中，置于60?水浴锅中20分钟，避光放置; ? 时间到时取出切片，用95%酒精小心冲洗掉组织及玻片上的多余染液，之后用蒸馏水 浸泡20分钟，使冲洗更干净; ? 将切片置入有500ml的0.05%碳酸锂的染缸中，15秒; ? 立即取出切片，依次置入有500ml的70%酒精的两个染缸中分色15秒，之后用蒸馏 水冲洗干净，并用显微镜观察，直至脊髓白质与灰质有鲜明的对比，核为无色，髓鞘 在浅灰或是浅蓝色背景下为绿色，如不是，则重复7，8两个步骤; ? 合格后，再次将切片置入有500ml的70%酒精的染缸中分色15秒; ? 立即取出并置入有500ml的醇性伊红的染缸中，染色30秒，之后用蒸馏水冲洗干净， 并浸泡10分钟; 11 之后将切片置入有500ml的结晶紫的染缸中，染色1分钟，之后用蒸馏水冲洗干净， 并浸泡10分钟; 12 依次快速的将切片浸入有500ml的95%酒精，以及有500ml的100%酒精的两个染缸 中，各5秒; 13 再次依次将切片浸入有500ml的二甲苯的三个染缸中，各4分钟; 14 取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。 8. 数据分析及统计学处理 采用SPSS 12.0 统计软件。组间比较用t检验。P?0.05，差异有统计学意义。 二、实验结果与分析 1. 临床评分 EAE组8只小鼠从免疫后第15天开始陆续发病，大约在第21天达到发病高峰，发病率为100%。发病后EAE组小鼠的一般状况较正常对照组差，表现为食欲降低、体质量减轻、皮毛不光滑、活动量减少。同时EAE组小鼠相继出现神经系统症状，表现为尾部无力拖垂表现为尾部无力脱垂、步履蹒跚、后肢瘫痪、行动困难，进而发展为四肢瘫痪，最高评分为4分(见图2)。正常对照组小鼠未出现临床神经系统症状，体质量持续增加(见图1)，神经功能评分为0分。两组小鼠临床症状打分比较，见图3，组间p<0.01。EAE组症状显著，与正常对照组小鼠相比，具有显著的统计学差异。 图1 对照组鼠 图2 双后肢瘫痪(4分) 图3 小鼠神经功能评分 2 病理学检测结果 2.1 H&E结果 EAE组小鼠的脊髓白质和灰质中均有炎性细胞浸润，但病变分布以脊髓颈腰膨大为主 (见图4B，箭头所示)，表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，浸润沿包膜和小血管由外向内延伸。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变(见图4A)。 (A) (B) 图4 H&E染色结果 注:(A):为正常的小鼠脊髓切片。(10×20);(B):为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润(10×20) 2.2 LFB的结果 可见EAE组小鼠的脊髓有大小不等的片状脱髓鞘区，并形成“空泡”。炎性细胞浸润弥散，灰白质受累，尤以灰白质交界区最重，前索及侧索内均有片状脱髓鞘区(见图5B，箭头所示)。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变(见图5A)。 (A) (B) (C) (D) 图5 LFB染色结果 注:(A)(C):为正常的小鼠脊髓切片。(10×20);(B)(D):为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润和髓鞘脱落形成 “空泡”(10×20) 三、讨论 从鸟类到哺乳动物的多种动物均可成功诱发EAE模型，但不同品系的动物敏感性有 b很大不同。对MOG敏感的动物有:Lewis，DA大鼠和C57BL/6(H-2)，鉴于对EAE35~55 b敏感的Lewis和DA大鼠，价格昂贵、不易获得。C57BL/6(H-2)小鼠对诱发EAE相当敏感，且品系纯正，遗传背景知识全面、丰富，遗传学、免疫学等的研究也较深入，因此小鼠更适用于有关基因、细胞间相互作用和发病机制等领域的研究。用小鼠MOG多肽35~55免疫C57BL/6小鼠，产生的EAE慢性,非缓解性EAE，其症状与人类MS很相似，表现为脊髓、大脑和视神经的炎症和髓鞘脱失。虽然MOG在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。 固相合成是多肽合成领域的一个重大突破，在合成多肽中具有快速、简便、高效等优点，因此，本实验室研究人员利用改进后的Fmoc固相合成法，合成MOG多肽，经35~55RP-HPLC纯化后，合成的MOG纯度可达95%，精肽产率达到13.58%。35~55 本研究中选用的实验动物C57BL/6纯系小鼠在国内的来源较为广泛，而且MOG多肽的结构明确，并可精确定量，在此基础上建立的EAE模型更适合从分子免疫学的角度探讨EAE的发病机制。特别值得注意的是，本研究以合成的MOG抗原肽制备C57BL/635~55小鼠EAE模型发病率达到100%，对后续在某些免疫调节相关基因突变型小鼠中制备EAE模型，研究这些基因在疾病进程中的作用和设计成为药靶的可能性打下了良好基础。 总之，通过对C57BL/6小鼠EAE模型行为学和病理学的检测，验证了MOG抗原35~55肽的免疫原性。即本实验室采用改进的Fmoc固相合成法，可获得具有良好免疫原性的MOG抗原肽，用以制备的C57BL/6小鼠EAE模型稳定可靠、发病率高，可为进一步35~55 研究MS免疫学发病机制提供帮助。 参考文献 [1]. Juedes AE,Hjelmstrom P,Bergman CM,et al.Kinetics and Cellular Origin of Cytokines in the Central Nercous System: Insight into Mechanisms of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Immunol,2000,16.4(1):419-426. [2]. 邢清和，王永铭，郑荣远.影响EAE动物模型建立的因素分析.中国临床神经科学.2000，8(4): 305-306. [3]. 魏岗之，袁锦楣，张津等.神经系统脱髓鞘性疾病.第一版.北京.人民军医出版社,2003,50-51. [4]. 穆阳. 不同剂量MOG抗原免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型的比较. 中国实验动物学报 2010, 18. [5]. 王超. 多发性硬化的T细胞研究进展. 中国神经免疫学和神经病学杂志. 2009.16. [6]. 邢清和. 2000. 影响EAE动物模型建立的因素分析. 中国临床神经科学 8. [7]. Costa O,Divoux D,Ischenko A, et al. Optimization of an animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis achieved with a multiple MOG peptide in C57BL6/J strain of mice[J]. J 35~55 Autoimmun, 2003, 20(1): 51-61. [8]. Han X, Gu J. Application of Solid-phase Peptides Synthesis[J]. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2004, 28(1): 10-13. [9]. Chen X,Luo SL,Zhang B,et al. Development of solid-phase polypeptide Synthesis [J]. Biotechnology, 2006,16 (1):81-82. [10]. Juedes, A. E., P. Hjelmstrom, C. M. Bergman, A. L. Neild, and N. H. Ruddle. Kinetics and cellular origin of cytokines in the central nervous system: insight into mechanisms of myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol.2000.164:419-426. [11]. 席娜娜. 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病高峰期外周及中枢淋巴细胞亚群的变化. 中国免疫 学杂志.2010.26. ++[12]. 翁益云. 实验性变态反应性脑脊髓炎AQP-4、CD4CD25调节性T细胞研究. 中国免疫学杂 志.2010.26. ++[13]. 翁益云. C57BL/6小鼠EAE模型的建立及Foxp3、CD4CD25调节性T细胞检测. 中华微生物学 和免疫学杂志.2010.30. [14]. 吕志宇. 实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠外周血单个核细胞分泌Il-4量的研究. 陕西医学杂 志.2010.39. [15]. 王菊蓉, 张冉, 王栋, 等. C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立. 第二军医大学学 报:1089-1091.2006. +[16]. 张为. CD4T细胞及其亚群与多发性硬化. 中国临床康复.2006. 10. 致谢 本课题的选题及进展，是在,,,老师的指导和关怀下完成的。,老师开阔的视野，活跃的学术思维，和蔼平易近人的为人指导令我钦佩。感谢,老师在课题进展过程中精心详尽的指导，在我实验进展不顺利时给予的理解与鼓励。 感谢研究室的,,,师姐、,,,和,,,兄在实验过程中给予的指导和帮助。 感谢,,,、,,,、,,、,,等在实验室和生活中给予的帮助与快乐。