小分子物质的跨膜运输

小分子物质的跨膜运输 第九章 小分子物质的跨膜运输 细胞质膜和各种内膜的脂双层因其内部的疏水性质而构成了一道屏障，不允许大多数极性和水溶性分子透过，可以经膜自由扩散的只有极少数脂溶性、非极性或不带电的小分子。膜的这一特性有重要的功能意义，正因为这种屏障作用，细胞内外、各细胞器内外的物质浓度差异才得以维持。但是，细胞要摄取营养物质，排泄代谢废物，要调节细胞内外离子浓度，要造成某些特殊物质在某个细胞器内外的浓度差异，因此必须有一些特殊的机制把这些水溶性的、带电的营养物、代谢产物和离子运送进出细胞或细胞器。膜对无机离子和小分子有机物质的运输是靠特化的跨膜蛋白来完成的。膜对大分子的运输有着另一种机制，将在第十章予以讨论。 膜运输蛋白的分子数在所有细胞的膜蛋白中占15,30,，有些特化的哺乳动物细胞甚至将全部代谢能量付诸膜运输活动，可见膜运输对生物体的重要性。本节将介绍小分子跨膜运输的一般形式，然后介绍两大类运输蛋白,载体蛋白和离子通道蛋白以及它们分别介导运输的特点。 第一节 跨膜运输的原理 一、单纯扩散 有些物质可以完全不需膜蛋白的作用而自由透过生物膜的脂双层，这种跨膜运输形式叫做单纯扩散。这方面的证据是从一种叫做黑膜(black membrane)的人工合成脂双层上获得的。黑膜的如图9,1所示，是在分隔两个充水区室的平板的小孔上造成一个脂质双层，通过检测该脂双层(黑膜)两侧液体中某溶质的含量来测定这层膜的通透性。有关结果明，如果不考虑扩散时间的长短，可以说任何不带电小分子都可以顺其浓度梯度而扩散通过脂双层。但因为它们的扩散速率有极大差异，实际上可以自由通过膜的物质有两类:(1)疏水的(脂溶性的)小分子，如氧、氮、苯等，其中脂溶性的愈小的分子扩散愈慢;(2)不带电的极性小分子如水(分子量为18)、二氧化碳(分子量为44)、乙醇(分子量为46)、尿素(分子量为60)、甘油(分子量为92)等，其中分子量愈大的扩散就愈慢。所以，像葡萄糖(分子量为180)这类不带电的极性分子因分子量太大，几乎不能自由扩散过膜;各种离子则因它们的带电及水合性，虽然分子量很小也完全不能通过膜(图9,2)。 图9,1 黑膜 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-18 1 图9,2 脂双层对各种分子的通透性 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-19 二 、膜蛋白介导的运输 生物膜与人工合成的脂双层之间的重要不同是:生物膜对各种极性、带电分子如离子、单糖、氨基酸、核苷酸等均允许通过。这些物质的运输由膜蛋白介导，这些膜蛋白称为膜运输蛋白。 根据膜运输蛋白介导运输的形式不同，将它们分为两类: 载体蛋白(carrier protein) 和通道蛋白(channel protein)。载体蛋白能与所运输的特异性物质结合，经本身构象改变而运送该物质穿过膜。通道蛋白则形成贯穿脂双层的充水孔道，当这些孔道在特异信号控制下打开时，能让特异性物质(一般是无机离子)经过而穿越膜(图9,3)。就运输蛋白与所运分子的关系而言，载体蛋白必须与所运物质结合，有较强的互相作用，而通道蛋白与所运分子作用较弱。就运输速度而言，通道蛋白介导的运输要比载体蛋白介导的快得多。 图9,3 载体蛋白和通道蛋白 (引自Alberts,2002) 参照前书图9-20 所有结构已知的运输蛋白都是多次穿膜的跨膜蛋白，其肽链多次折叠，在脂双层内形成一个跨膜的蛋白通道以运送特异的物质。每种蛋白质只运送某一特定类别的分子如离子或糖或氨基酸，并且常常只针对该类别中某一种分子如钠离子或钙离子、葡萄糖或半乳糖。 膜运输蛋白的特异性最早在上世纪50年代中期被发现，细菌的单个基因突变就使其质膜丧失对某种糖类的运输能力。后来发现很多临床上的例子，在患有肾脏或肠先天性对某种特殊物质吸收障碍的人群中，存在相关的单个基因突变，证明运输蛋白对某一物质的特异性。半胱氨酸尿症是一种遗传性疾病，患者肾和肠的有关细胞不能将半胱氨酸运输入血液，结果导致半胱氨酸在尿中蓄积，造成肾脏发生半胱氨酸结石。 不管是载体蛋白还是通道蛋白，膜蛋白介导的跨膜运输因有无能量偶联而存在两种不同形式(图9,4):(1)被动运输，又称易化扩散。采用这一形式的是所有通道蛋白和一部分载体蛋白。它们“帮助”所要运送的物质顺着其电化学梯度跨越过膜 2 (“下坡”)，因此不需要能量供应。若所运的分子不带电，其运输方向由其在膜两侧的浓度差决定;若所运分子带电，运输方向就由跨膜浓度差和电位差一起决定，浓度差和电位差构成了所谓的电化学梯度。几乎所有质膜都存在电位差，又称电压梯度，通常膜内比膜外更负，所以膜电位差通常有利于带正电离子进入而不利于带负电离子进入(图中的B中图所示情形)。(2)主动运输。采用这一形式的全部是载体蛋白，它们对抗所运送物质的电化学梯度，“逆势”地把物质泵运过膜(“上坡”)， 这样它们又被称为“泵”。载体蛋白的主动运输是定向的，并且总是偶联于一个能源，如ATP水解或离子梯度。 可以看出，载体蛋白介导的运输有些是主动的，有些是被动的，而通道蛋白介导的运输都是被动的。 下面分别讨论载体蛋白和通道蛋白各自介导的运输。 图9,4 单纯扩散、主动运输和被动运输 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-21 第二节 载体蛋白介导的运输 一、载体蛋白介导运输的原理和特点 载体蛋白运送一个特异分子的过程，与酶-底物反应有许多类似之处。首先，每种载体对其所运分子有一个或多个特异性结合位点，某种载体饱和时，意味着所有结合位点被占满，此时运输速率为最大，该速率称为V，对某种载体是具特征性的，并反max 映载体蛋白在两种构象之间变换的速率。其次，每种载体对其所运物质有一特征性的结合常数K, 即运输速率为其最大值一半时所运物质的浓度。第三，像酶反应一样，所运m 物质与载体的结合可被竞争性抑制物特异性地阻断(竞争同一位点并且被或不被载体运输)，也可被非竞争性抑制物阻断(在载体的别处结合并特异性地改变载体的构象)。与酶反应的不同之处是，载体蛋白并不对所运分子作共价修饰，也就是说物质是一无改变地从膜的一侧被送到另一侧的。 载体介导运输的另一个特点是有几种不同的运输方式。有些载体只运送一种物质，这是单一运输(uniport)，另一些载体则进行偶联运输(coupled transport)，即一种物质的运输依赖第二种物质同时或后继的运输，这两种物质的运输可以方向相同——称为同向运输(symport)，也可以方向相反——称为反向运输(antiport)(图9,5)。进行偶联运输的载体蛋白又叫偶联载体，它们对一种物质进行主动运输时，依赖另一种物质的电化学梯度所贮存的能量(详见下述)。举例来说，大多数动物细胞必须从细胞外液中摄取葡萄糖，细胞外葡萄糖浓度相当高，由葡萄糖载体操作单一运输而被动地运入。但是，肠道和肾脏的上皮细胞必须分别从肠腔和肾小管管腔中摄取葡萄糖，而肠腔和肾小管腔中葡萄糖浓度是低的，存在于这些细胞顶质膜上的同向运输载体系统就通过把细胞 3 外高浓度的钠离子运入细胞来主动地把葡萄糖运入细胞。另外如上节所述，人类红细胞 --膜上的阴离子载体第三带蛋白进行反向运输以排出Cl，摄入HCO。 3 ,5 载体运输的几种形式 图9 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-22 载体介导运输的机理是:载体蛋白经历了一个构象变化，先后交替地把所运物质结合的位点暴露于膜的两侧，从而完成运输。如图9,6所示，在载体蛋白处于A状态时，结合位点暴露于膜外侧，X物质结合上去，当构象转变为B状态时，结合位点暴露于膜内侧，X物质被释放下来，这样X物质就从膜外到了膜内。由于载体构象变化是随机的、可逆的，当X物质的电化学梯度是膜外高膜内低时，结合至A状态载体的X分子必然多于结合至B状态的，从而X物质得以顺其梯度从膜外进入膜内。这就是载体蛋白进行被动运输的原理。在载体介导主动运输的时候，载体蛋白与一种能源相连接，从而能够将物质逆其浓度梯度运送过膜。所谓能源一般有3种形式，如图9,7所示。 (1)离子梯度驱动力，即通过偶联运输使一种物质的“下坡”带动另一种物质的“上坡”，能这样进行主动运输的载体蛋白叫作偶联载体; (2)ATP驱动泵，将主动运输偶联于ATP水解; (3)光驱动泵，将主动运输偶联于光能。一般存在于细菌中，如细菌视紫红质的作用。 图9,6 载体介导被动运输原理 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-23 在动物细胞中，载体蛋白主动运输所需要的能源主要是ATP水解供能和离子梯度驱动力。 图9,7 载体介导主动运输的能源 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-24 4 从氨基酸序列比较来看，很多情况下，介导主动运输和被动运输的载体蛋白在分子构造上存在极大的相同性。有些细菌的载体蛋白利用膜两侧的氢离子梯度所贮存的能量驱动对糖的主动摄取，它们的结构与动物细胞上被动运输葡萄糖的载体蛋白十分相似。这提示了不同载体蛋白在进化上的关系。小分子代谢物和糖可以作为重要的能源，因此可以认为载体蛋白超级家族实际上是一个很古老的家族。 在下文我们先介绍利用离子梯度驱动主动运输的载体蛋白，即偶联载体。这类载体蛋白在所有细胞小分子代谢物跨膜运输中都扮演重要角色。然后讨论ATP驱动泵，其中包括在几乎所有细胞质膜上普遍存在的钠离子泵。 二、偶联载体 两种物质偶联运输使得载体蛋白可以利用一种物质(典型的是无机离子)的电化 +学梯度中贮存的能量来运输另一种物质。在动物细胞质膜上，Na往往是被偶联送入细胞的离子，它的跨膜电化学梯度为第二种离子的主动运输提供大量能量。进入细胞的+++Na过后再被质膜上的ATP,Na泵泵出去，从而使Na的电化学梯度得以维持。ATP,+++Na泵由此通过维持Na梯度间接驱动了离子运输。因此可以说，ATP,Na泵介导了初级的主动运输，而偶联载体则介导了次级的主动运输。 如前所述，偶联运输可以是同向的，也可是反向的。下面是一些同向和反向的运输载体的例子。 +1(Na梯度驱动的同向运输载体与糖摄入 在肠和肾小管上皮细胞质膜上存在多 +种利用Na梯度的同向运输系统，各自负责运送一种溶质即一组特异糖类或氨基酸进入 ++细胞。在运输过程中，溶质和Na结合于载体蛋白的不同位点上，Na顺其电化学梯度 +欲进入细胞，而糖或氨基酸，在某种意义上可以说，被一起“拽”了进来。Na的电化 +学梯度愈大，溶质进入的速率也就愈大，结果，如果细胞外液Na的浓度降低，溶质的 +进入就会减少。图9,8示由Na梯度驱动的葡萄糖载体的工作原理。载体在A和B两种构象状态间变换:蛋白结构在A状态向细胞外开放，而在B状态则向细胞质开放。+Na和葡萄糖在载体上的结合是协同的，即其中一个的结合诱发载体构象改变，大大增 +加对另一个的亲和力。因为Na的细胞外液浓度很高，葡萄糖也就很容易在A状态结合 +于载体，这样, Na和葡萄糖两者经载体状态的A,B变换进入细胞，比经B,A变换离 +开细胞要容易发生，所以总的结果是Na和葡萄糖的净入。注意，由于两者结合有协同作用，缺一种则另一种无法结合上载体，因而只有在两者俱备或两者俱缺的情形下，载 +体才会发生两种构象之间的变换。这种偶联载体在运输葡萄糖的过程中改变了Na梯 ++度，而膜两侧正常Na梯度的维持要依赖膜上的ATP,Na泵(详见下述)。 +图9,8 Na梯度驱动的葡萄糖载体的工作原理 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-25 + 2(H梯度驱动的同向运输载体与糖摄入 在细菌、酵母以及动物细胞一些膜包围 ++的细胞器，许多由离子梯度驱动的膜上主动运输是依赖H而非Na的。这反映出这类 5 +++膜上H泵占优势，Na泵几乎缺如。细菌细胞上许多糖和氨基酸的主动运输靠H跨膜 +梯度驱动，其中研究很多的一个H驱动同向运输的例子就是将乳糖运入大肠杆菌的乳糖通透酶(lactose permease)。该酶由12个穿膜,螺旋松弛折叠而成，在运输过程中，一些螺旋发生滑动，导致倾斜。这一动作使螺旋之间的一个裂隙打开又关闭，先是向膜 +的一侧、然后再向另一侧暴露了乳糖和H的结合位点,。 + 3(Na梯度驱动的反向运输载体与胞质pH维持 蛋白质需要最适pH来实行其功能，不同的细胞器需要特定的pH环境，如溶酶体酶必须在溶酶体的低pH(,5)环境下工作，而胞质的酶则要求近中性的pH(,7.2)。因此，控制胞质和细胞器特有的pH对细胞是至关重要的。大多数细胞在质膜上有一种或多种反向运输载体蛋白用以维 +持胞质pH在7.2左右。H可以自细胞外漏入，也可以从细胞内的成酸反应生成。处理 +++-过多H的机制有两种，一是将H直接运出去，二是带入HCO中和H。有些反向运输3++载体蛋白使用第一种机制，利用Na梯度贮存的能量将胞质中过多的H泵出胞外。其 ++++中的一个例子是Na,H交换蛋白，它将Na内流与H外流相偶联。另一些反向运输 +-+--蛋白则将两种机制结合起来，如Na驱动的Cl,HCO交换蛋白，它将Na 和HCO的33-++-内流与Cl和 H的外流相偶联，也就是造成NaHCO进来和HCl出去。Na驱动的Cl,3++++-HCO交换蛋白如同Na,H交换蛋白一样高效，因为每有一个Na进入，就有一个H3++--被泵出，同时另有一个H被中和。在有NaHCO来源的情况下，Na驱动的Cl,HCO33交换蛋白是调节胞质pH的最重要反向运输载体蛋白。这两种载体都受胞质pH的调节，在pH下降时活性增高。不过，对于许多细胞器的pH维持，例如溶酶体、内体和 ++分泌颗粒的低pH，是ATP驱动的H泵起了重要作用，即ATP水解供能将H从细胞质基质泵入这些细胞器。 + 4(载体蛋白的不对称分布与上皮细胞吸收功能 在小肠上皮细胞，Na梯度驱动的同向运输载体分布于顶面结构域即吸收面结构域，此处，细胞对抗营养物溶质的浓度 +差主动地将溶质从肠腔摄入细胞。不依赖Na的运输蛋白则分布于底面和侧面即底侧面结构域，此处允许营养物溶质顺其浓度差被动地离开细胞。许多上皮细胞通过在吸收面形成大量如指状突起的微绒毛而大大增加质膜面积，增加运输容量。如小肠和肾小管的刷状缘。 三、ATP驱动泵 如上所述，离子梯度在驱动细胞的许多基本运输活动中起到了关键作用，而建立和维持这些离子梯度却有赖于利用ATP水解供能的各种离子泵。 ++ (一)P型运输ATP酶:Na-K泵 ++ 几乎所有动物细胞脂膜上都存在这一对Na进行主动运输的载体蛋白。因它将Na +逆着极高的电化学梯度运出细胞，而把K逆着极高的电化学梯度运入细胞，所以称之 ++++为Na-K泵，又因为它的能量来源是自身进行ATP水解获得的，又把它叫做Na-K- + +ATP酶，大多数细胞的细胞内Na浓度低于细胞外10-20倍，K浓度则是细胞内高于细胞外10-20倍，这样一种奇特的离子梯度对于细胞的许多活动至关重要，其维持正是依 ++靠Na-K泵的作用。一般动物细胞能量需要的三分之一耗费于该泵，在神经细胞这种消耗可达三分之二，可见该蛋白对细胞生存的重要性。 6 ++Na-K-ATP酶已被提纯，其作用机理也已清楚。它是由一个大的多次穿膜的催化亚基(约1000个氨基酸残基)和一个小的糖蛋白相联组成的。糖蛋白功能未明。在催 ++化亚基的胞质面有Na和ATP的结合位点，在其外表面有K或乌本苷(ouabain,一种箭毒苷，能抑制ATP酶)的结合位点，整个分子能可逆地磷酸化和去磷酸化，运输过程依赖的正是这种自动的磷酸化,去磷酸化循环(图9,9A)。催化亚基磷酸化是由于在胞 +质面ATP水解成ADP，其末端磷酸基团在Na存在时就转移至催化亚基的一个精氨酸 ++残基上。这种依赖Na的磷酸化引发了构象变化，导致Na被运送出细胞，随即又发生 ++了依赖K的去磷酸化，即在细胞外表面有K存在时，亚基上的磷酸基水解脱落，结果+K被运送入细胞，这时亚基又恢复原来的构象(图9,9B)。乌本苷对ATP酶的抑制 +就发生在依赖K+的去磷酸化这一步上，因它与K竞争结合至亚基上。由此可以解释为 +++什么Na、K运输与ATP水解紧密偶联，并且这种运输和水解的条件是Na和ATP存 +在于细胞内、K存在于细胞外。 ++图9,9 Na-K-ATP酶工作原理 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-26 泵的两种状态分别以磷酸基团的存在与缺如为标志，这样一类离子泵被统称为“P型运输ATP酶”(P指phosphorylation，即磷酸化)，由结构和功能相关的蛋白家族组 ，，成，包括下文将予讨论的Ca泵和H泵。 ++++ Na-K-ATP酶每水解1分子ATP，同时泵出3个Na，泵入2个K。产生的直接效应是细胞外高钠、细胞内高钾的特殊离子梯度。其间接效应有: (1)调节细胞容积。因细胞内有固有阴离子，又有为平衡固有阴离子而伴随存在的许多阳离子，它们共同形成一个要把水“拉”进来的渗透压，与之对抗的是细胞外渗 +-+透压，这主要由Na、CL等无机离子造成。但细胞外高钠使Na有顺其梯度流入细胞 +++的倾向，Na-K-ATP酶把流入的Na不断泵出，维持了膜内外渗透压的平衡。因此， ++用乌本苷处理细胞，细胞将很快肿胀破裂，可见Na-K泵对维持细胞容积的重要性。 (2)保证另一些物质的主动运输。钠离子浓度梯度中储存的能量使某些载体蛋白 +可以以同向运输或反向运输的形式，主动把氨基酸和葡萄糖运入细胞，把H运出细胞(已如上述)。 ++++ (3)参与形成膜电位。因Na-K泵每泵出3个Na只泵入2个K，结果造成膜内相对负于膜外的电位差，这一效应对膜电位的形成有10%的作用。 +++ Na-K泵可以被反向驱动，这种情况下就有ATP生成。在实验条件下如果将Na +和K梯度扩大到这样一个程度，即贮存于离子电化学梯度中的能量大于ATP水解的化 ++学能，那么这些离子就会顺着它们的电化学梯度移动，Na-K泵就驱动了从ADP和磷 +++酸合成ATP的过程。究竟Na-K泵的工作是用于生成ATP还是将Na泵出细胞，取决 ++于ATP、ADP和磷酸的浓度以及Na和K的电化学梯度。 + (二) P型运输ATP酶:Ca泵 7 +-7+- 真核细胞胞质中游离Ca浓度很低(~10mol/L)，细胞外Ca浓度则很高(~103++mol/L)。肌肉细胞的肌质网是一种特化的内质网，是Ca的储存池，其腔内Ca浓度也大大高于胞质。质膜或肌质网膜两侧的这种钙梯度有十分重要的意义，因为当某些细胞外信号作用于细胞时，钙离子顺其浓度梯度的跨膜流动可以是细胞对细胞外信号应答 +和传导的一种方式。例如神经末梢的去极化引发Ca内流，导致末梢释放乙酰胆碱;肌 ++肉细胞的去极化引起肌质网中Ca释放至胞质，导致肌纤维收缩。Ca梯度的维持相当 +程度上依赖膜上的钙泵，这些钙泵有一种是P型运输ATP酶，另一种是被Na电化学 ++梯度驱动的反向运输蛋白，叫作Na,Ca交换蛋白。在细胞受外界信号刺激而升高胞 ++质Ca浓度后，肌质网膜上的大量钙泵负责将胞质中的Ca泵回肌质网。非肌肉细胞的内质网膜上也存在类似的钙泵，但数量较少。 +肌质网膜上的钙泵，或称Ca-ATP酶，是了解得最清楚的P型运输ATP酶。这个+Ca-ATP酶占肌质网膜蛋白重量的90%，因此易于提纯。像所有P型运输ATP酶一 +样，这个蛋白在泵运Ca过程中经历了磷酸化和去磷酸化的变化，每水解1分子ATP ，++把2个Ca从细胞质中泵入肌质网腔。对Ca,ATP酶以及另一个与之相关的真菌H泵的研究第一次提供了共有相似结构的P型运输ATP酶家族的资料。它们都含10个跨 +膜,螺旋，其中3个排成穿越脂双层的中央通道。在非磷酸化状态，Ca,ATP酶的2 +个螺旋裂开，形成一个面向胞质的腔隙，让2个 Ca结合。ATP在同一面结合至其位点 +以及相邻结构域接着发生的磷酸化，导致整个跨膜,螺旋的剧烈构象变化，结果Ca结 +合位点打破，Ca在膜的另一侧被释放，即被送入肌质网腔(图9,10)。 +图9,10 Ca,ATP酶分子结构及工作原理 (引自 Alberts等，2002) 参照前书图9-27 ， (三) V型运输ATP酶:ATP酶和H泵 细菌质膜、线粒体内膜和叶绿体的类囊体的膜上所含的运输ATP酶，属于V型运输ATP酶，在结构上完全不同于P型运输ATP酶。它们是一种涡轮状的结构，由多个不同的蛋白亚基构成。它们在正常情况下是逆向工作的，即不是ATP水解泵运离子， ，，而是H的跨膜梯度驱动从ADP和磷酸合成ATP。H的跨膜梯度来源于细菌和线粒体 ，的氧化磷酸化，或叶绿体的光合作用，或细菌视紫红质的光激活H生成。 尽管正常情况下V型运输ATP酶合成ATP，被看作ATP酶，但它们也可以反向工作，即象P型运输ATP酶一样，水解ATP，运输氢离子。细胞确实这样使用V型运输ATP酶:在有些细胞器，如溶酶体、突触小泡、植物液泡的膜上，V型运输ATP酶 ，泵入H，造成这些细胞器内部的酸化。 四、运输蛋白超级家族 以上所述运输ATP酶属于一个运输蛋白超级家族，存在于各种细胞。虽然它们的功能刚刚开始被认识，它们在临床上的重要意义已经十分令人注目。 ， 家族中的第一个得到鉴定的成员即前述细菌膜上利用H梯度将各种营养物质泵运入细胞的载体蛋白。 8 细菌质膜上的运输ATP酶属于已知最大、最多样化的一个运输蛋白家族，名为ABC运输蛋白超级家族，因为每一成员都含两个高度保守的ATP结合匣(cassette),即ATP结合结构域。典型的ABC运输蛋白由4个结构域组成:两个高度疏水结构域，其中各自含六个穿膜片断，形成运输通道;另两个就是ATP结合催化结构域，或称结合匣(图9,11)。ATP结合引发两个ATP结合结构域发生二聚体化，而ATP水解造成它们解聚。在膜的胞质面发生的这种结构变化传递至穿膜片断，驱动了构象变换循环，使底物结合位点相继暴露于膜的两侧。就这样，ABC运输蛋白利用了ATP的结合和水解，最终将分子运输过膜。 图9,11 ABC运输蛋白的结构 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-28 在大肠杆菌，有78个基因，即5,的基因，编码ABC运输蛋白。在动物细胞这个数目更大。每个运输蛋白专一运输一种或一类底物，整个超级家族所运输物质的种类是极其巨大的，可包含氨基酸、糖、无机离子、多糖、肽类、甚至蛋白质。 在真核细胞得以鉴定的第一个ABC运输蛋白是由于它们能将疏水的药物泵出细胞而发现的，其中之一就是多药耐药蛋白(multidrug resistance (MDR) protein)。该蛋白在各种肿瘤细胞上的过度表达，使细胞对肿瘤化疗中常用的、化学上无关联的多种细胞毒药物同时发生抵抗。施用其中任一药物都会造成过度表达MDR运输蛋白的细胞得到选择(即适应而生长)。MDR运输蛋白将药物泵出细胞，减轻毒性作用，造成耐药。研究表明有多达40,的人类癌症可以发生多药耐药，这成为抗癌治疗的一大障碍。 另一类似的不利例子是，引起疟疾的疟原虫中有一种具有对抗疟药氯喹的耐药性，原因是它们能过度表达一种ABC运输蛋白，将氯喹泵出细胞。在酵母，负责将求偶素? 一个12个氨基酸的肽? 输出细胞的也是一种ABC运输蛋白。 大多数脊椎动物细胞的内质网膜上，ABC运输蛋白将蛋白质降解产生的各种肽不停地从胞质输入至内质网腔。这是机体免疫系统对细胞进行监控的一种重要机制的第一步。进入内质网的蛋白片断最终将出现在细胞质膜表面，如果这些片断来源于病毒或其他有害微生物，这一提呈抗原将被细胞毒性T淋巴细胞识别。 , 囊性纤维化病在白种人发生率高达1:27，该病由上皮细胞质膜上调控Cl运输的ABC运输蛋白的基因发生突变造成。 第三节 通道蛋白介导的运输 一、通道蛋白介导运输的原理和特点 +++- 通道运输的对象仅限于离子，主要是Na、K 、Ca、Cl等，所以这些运输蛋白又叫离子通道。通道蛋白是通过形成贯穿膜层的充水孔道来完成运输的。但离子通道不是简单的充水孔道，两者主要区别在于两点，一是离子通道对离子的大小、带电性具有选 9 择性，这叫作离子选择性;二是离子通道并非持续开放，而是可以开关，这叫作“门控性”。 通道蛋白介导的运输有一些不同于载体蛋白的性质。通道运输的速率很高，平均 6高出载体运输速率的100倍以上，每秒可有10个离子通过一个通道。运输速率还能受到控制，即当离子浓度增高时，离子的通过先是成比例地增多，但随后就饱和于某一最大速率。离子通道不与能源偶联，因此所有通道运输都是被动的。也就是说，离子通道 +++- 、Ca、Cl等，顺着它们的电化学梯的功能是，允许特异的无机离子，主要是Na、K 度，快速扩散过膜。 通道运输是受到调控的，就像闸门在控制下启闭一样。“闸门”实际上是通道蛋白构象变化形成的不同开放状态。在膜上特异性刺激控制下，闸门短暂地开放，随即很快关闭(图9,12)。这些特异性刺激有多种多样，最主要的是跨膜电压变化、机械刺激、信号分子结合等。信号分子可以是细胞外物质如神经递质，也可以是细胞内物质如离子、核苷酸、GTP结合蛋白等。许多通道还可以被磷酸化/去磷酸化调控。而且，随着刺激时间延长，大多数通道会进入“失敏感”或“失活”状态，不再开放，直至刺激停止。每一种通道受控的刺激类型可以是不同的，最常见、也是本节主要介绍的是电压门控通道(voltage-gated channels)和递质门控通道(transmitter-gated channels)。 图9,12 通道蛋白的启闭 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-29 了解得较清楚的离子通道已有约100多种，并仍在发现新的种类。离子通道在电兴奋细胞有特别重要的意义，它们应答并介导了各种电信号，是神经冲动传导、肌肉收缩的物质基础。一个神经细胞上可以有10种离子通道，分布于质膜上不同部位，细胞利用不同的离子通道实现对信号的接收、转导和传递。但是离子通道的作用不仅限于电兴奋细胞，它们存在于所有动物细胞膜上，并且在植物和微生物上也有作用。 二、几种通道蛋白及其功能 +(一) K通道与静息电位 膜电位是由膜两侧的电荷差异形成的，这种差异可以由主动泵运造成，也可以由 +离子的被动扩散造成。例如线粒体的膜电位是由于线粒体内膜上H泵作用，植物和真菌质膜的电位也是由电能泵生成的。但是，对于典型的动物细胞质膜，被动的离子移动 +是生成膜电位的主要力量，其中，K的跨膜电化学梯度是决定膜电位形成的关键因 ++素。由于Na泵作用，细胞内Na是低浓度的，为平衡细胞内固有阴离子所需要的阳离 ++子就只能是K。K的浓度梯度驱使其逸出，但固有离子造成的电梯度又吸引其留在细 +胞内，当这两种力量平衡时，K停止流动，这时的膜电位就等于静息膜电位(约, ++70mV)，因为此时没有膜内外离子的净流动。膜上的K通道为K自由穿越质膜提供 ++了途径，使它们能被固有阴离子吸收入细胞，然后在Na-K泵的作用下维持在细胞内 +的高浓度。这一对K通透的通道存在于所有动物细胞质膜上，而且可能不需要特异刺 10 ++激即可打开，因而也被叫作K逸漏通道(K leak channels)。这一特点可以说明为什么质 ++膜对K的通透性要比对其他离子大得多，也能说明为什么K的浓度对膜电位起关键作用。 +细菌的K通道蛋白是第一个通过冷冻结晶和X光衍射得到研究的通道蛋白，由此得到的资料极大地增进了我们对离子通道工作原理的认识。 +图9,13 细菌K通道蛋白结构 2002) (引自Alberts等， 参照前书图9-30 ++长期以来人们对离子通道为什么具有离子选择性迷惑不解。例如，K 和Na两种 ++离子都呈球状，大小几乎没有差别(分别为0.133nm和0.095nm)，而K通道对K的 ++通透量是对Na通透量的10000倍。这个问题在我们见到细菌K通道蛋白的X光晶体 +图象后得到了解答。K通道由4条相同的穿膜亚基形成(图9,13，图中仅显示其中2条亚基)。带负电的氨基酸集中于通道的胞质面入口处，吸引阳离子，排斥阴离子，从而赋予通道对阳离子的选择性。通道在脂双层内部膨起形成一个前庭，有利于钾离子进入。每条亚基含2个穿膜螺旋，它们有所倾斜，使得通道向膜的胞外一侧略呈开口，造成该部位成为通道的较宽一端。将两个穿膜螺旋相联结的那段肽链形成一个短的α螺旋(孔道螺旋)和一个向通道较宽部位的突起(选择环)，这些环构成一个选择性滤过器，位于前庭与细胞外区之间。肽链骨架上的羧基氧原子排布于其表面，成为滤器的内壁，并作为钾离子的一过性结合位点。通过滤器的两个钾离子排成单行，分隔约0.8nm，它们之间的斥力可能有助于它们向细胞外液移动。钾离子在通过前庭时仍是含水的，但当它要进入这个滤器时，必须丢弃它所结合的所有水分子，并与排布于滤器表面的羧基氧发生作用(这些羧基氧的排布形式极其精确，刚好接纳一个无水钾离子)。钾离子的脱水需耗费能量，羧基氧可以作为水分子的替身与其结合，从而补充能耗。与此相反，一个钠离子就不能进入这个滤器，因为它分子较小，羧基氧的位置距其太远， +不能提供能耗平衡。这样，易于通过K通道的就主要是钾离子而非钠离子。 +细菌K通道蛋白的结构研究还显示了这些通道是如何开放和关闭的。形成选择滤器的环位置较为固定，在通道启闭时不发生构象变化。但构成通道其余部分的穿膜螺旋能发生位置重排，造成通道关闭时其在胞质面的开口变小。入口变小加上排布于表面的疏水氨基酸，阻断了离子的进入，造成通道关闭的效果。 +(二) Na通道与动作电位 + 存在于神经肌肉细胞即电兴奋性细胞质膜上的Na通道是一种电压门控通道，它们在动作电位的形成过程中起决定性作用。动作电位是由膜部分去极化启动的。起初，引 +起部分去极化的刺激使静息状态的膜上电场发生轻微改变，电压门控的Na通道对电场 +变化高度敏感，随即发生构象变化，从稳定的关闭状态变成开放状态，使小量Na进入细胞。正电荷的流入造成进一步去极化，直至-70mV的静息膜电位转变成+50mV的++Na平衡电位。在此去极化过程中，每个Na通道开放后就有同样强大的传送能力，每 11 +秒钟可让8000个Na通过，随后很快自动转变为失活状态，这时膜开始回复到原有负 +值电位，等到Na通道转变成活化但不开放的构象时，膜才能重新对刺激有反应而形成 +下一次动作电位(图9,14)。这就是Na通道的“全或无”作用方式，也说明了动作电位“全或无”性质的本质。 +图9,14 Na通道的状态与动作电位的关系 (引自Alberts等，2002) -31 参照前书图9 +(三) K通道与动作电位 + 电压门控的K通道存在于神经细胞膜上，它的开放对动作电位后膜恢复其静息电位有重要作用。这些通道的开放造成钾离子外流，很快压倒了钠离子一过性内流带来的 +++电位变化，将膜电位带回到K平衡电位。这一K通道的开放发生在Na通道失活完成 +之前，它像Na通道一样能感受电压的变化，但其动力学较为慢速，因此有时被称为 +“延迟K通道”。 ++K通道也像Na通道一样会发生失活。该通道蛋白的突变研究显示，分子氨基端的20个氨基酸是发生快速失活所必需的，此区域的改变导致失活动力学的改变，此区域如果完全被去除，失活就不能发生。但是将这种去除氨基端的分子的胞质面暴露于一个小的合成多肽，其序列相当于被去除的氨基酸，失活的功能就能重建。这一发现提示，+K通道蛋白分子亚基的氨基端就像一个绳球，在通道打开过后能堵塞胞质面的开口， +从而使通道失活(如图9,15所示)。Na通道失活的机制也与此相似，只不过所涉及的分子片断有所不同，它们使通道失活的部位运作时更像一个“带铰链的盖子”。 +图9,15 K通道的活化状态与构象变化 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-32 +(四) Ca通道与动作电位 + 能产生动作电位的、电压门控的阳离子通道还包括Ca通道。在一些肌细胞、卵细 ++胞和内分泌细胞上， 动作电位的产生依赖Ca通道而非Na通道。 +++ 电压门控的阳离子通道即Na 、K 或Ca通道还分布于许多非电兴奋性的细胞。这3类通道蛋白在结构和功能上存在很大差异，可以由多个基因编码，也可以由一个基因的RNA转录物拼接不同产生。然而，所有已知的这3类蛋白在氨基酸序列上都惊人地相似，这表明它们源于进化上相关的一个超级家族，并基于相同的设计原理。单细胞 +酿酒酵母的电压门控K 通道由1个基因编码，而美丽线虫有68个基因编码不同而相 ++关的电压门控K 通道。数年前曾鉴定了编码一个电压门控Na通道蛋白的DNA的序 +列，它所编码的Na通道蛋白是单个大分子，约由1800个氨基酸残基组成，肽链折叠 12 成4个同质的跨膜结构域，共同形成充水孔道的壁。每个结构域可能包含6个跨膜的α +-螺旋。又发现编码一个电压启闭Ca通道的DNA序列，也是一个单条肽链大分子，结 +构也与Na通道十分相似。推测这些分子中都有一个跨膜组分，含有排列规则、带正电荷的氨基酸残基，它们发挥电压感受器的作用并作为“闸门”，保证在膜去极化至某一程度时开放通道。 有些人遗传了编码离子通道蛋白的基因突变，他们可以根据基因表达部位的不同罹患神经、肌肉、脑或心脏疾病。例如肌强直症，肌肉在主动收缩后的松弛发生障碍，造成疼痛性肌肉痉挛。有时候这是因为突变的通道不能正常失活，以致于在动作电位结束 ++后仍有Na持续内流，不断激发膜的去极化和肌肉收缩。如果突变发生在脑内的Na 、+K通道，就引起癫痫。 在电压门控离子通道的研究中长期使用的微电极技术，所探测的是流经所有通道的电流总和。20世纪80年代发展起来的膜片钳法(patch-clamp recording)在这方面研究中引起了革命性变化。这种技术用一玻璃微吸管吸住一小片膜，因管口边缘与膜完全封闭，当有电流流经覆于吸管口这一小片膜上的通道时，在吸管中可以记录到电流， +从而测知单个通道的离子运输情况(图9,16)。Na通道的“全或无”作用方式正是 +采用这种技术发现的。Na通道开放或关闭的时间是随机的，但是一旦开放，通量总是 +相同的，每毫秒允许通过1000个Na。 图9,16 膜片钳技术 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-33 电压对通道的门控作用可以从基本的物理学原理来理解。处于静息状态的神经元或肌细胞的质膜内电位比质膜外负50,100mV，虽然这一差异不大，但这种差别存在于仅厚5nm的一层膜两侧，造成的电梯度就是100，000V/cm，所以膜上蛋白质实际上处于一个很强的电场内。膜蛋白质含有带电基团，其原子之间也有极性键，电场就对分子结构发生作用。对许多膜蛋白来说，电场变化给它们带来的影响也许微乎其微，但电 ++压门控的通道蛋白能发生数种构象变化，其稳定性随电场强度而变化。例如Na 、K +或Ca通道之类电压门控的阳离子通道，它们的一个穿膜片断上含有特征性的带正电氨基酸，能对膜的去极化作出反应而向外移动，激发构象变化，打开通道。如果周围电场的随机热运动给予足够的震荡，一种构象会翻转至另一种，而关闭、开放和失活这三种构象相对更稳定，它们克服了电场变化带来的随机翻转而占有了主导地位。例如在静息状态，膜处于高度极化，关闭构象具有最低自由能，因而最稳定;膜去极化时，开放构象具有较低自由能，所以通道开放的机率很高;但失活构象所需自由能更低，所以开放构象只能一过性存在。以图9,17B所示的乙酰胆碱受体(离子通道)为例，从图的上部状态经下右再到下左，反映一个突发的去极化给通道蛋白构象带来的变化，而从下左回复到上部，反映膜重新极化后构象恢复到自由能最低的起始状态。 13 图9,17 乙酰胆碱受体的结构和三种状态 (引自.Alberts，2002) 参照前书图9-34 (五) 乙酰胆碱受体与神经肌接头的化学,电信号转换 乙酰胆碱受体是一种递质门控的离子通道，大量分布于骨骼肌细胞神经肌接头处。它在神经肌接头的神经末梢释放的乙酰胆碱作用下一过性地开放。递质门控的离子通道在化学突触部位将细胞外的化学信号快速转化为电信号。神经肌接头是运动神经元和骨骼肌之间的一种特化的化学突触。乙酰胆碱受体在离子通道研究中有着特殊地位。在已知的离子通道蛋白中，它第一个被提纯，第一个被鉴定出氨基酸序列，第一个在人工合成脂双层上得到重建，它单向开放的电信号也是第一个得到记录，它的基因又是第一个被分离、克隆并鉴定出序列的， 它的三维分子结构也已大致了解。对这一通道蛋白研究较为透彻主要由于几个原因。首先是来源丰富，电鱼和鳐的电器官即特化肌肉富含该蛋白;另外，某些毒蛇产生的神经毒素能够以高亲和力与该蛋白结合，使人得以用亲和层析的方法将其纯化。 该通道蛋白是一个由5条肽链组成的糖蛋白五聚体(图9,17A)，肽链中2条属一种，3条属另三种，分别由4个基因编码。4个基因高度同源， 提示它们源于同一祖先。每条肽链折叠成4个α-螺旋穿越膜层。五聚体中两条相同肽链各有一个乙酰胆碱结合位点，当两个乙酰胆碱分子结合上五聚体时，就引发了其构象变化，通道打开，直至神经肌接头处的乙酰胆碱酯酶将乙酰胆碱水解，乙酰胆碱浓度下降。 一旦乙酰胆碱与其受体(即五聚体)解离，受体构象恢复至原来状态，通道关闭。如果神经兴奋过度，乙酰胆碱作用持续，受体将发生失活(图9,34B) 根据电镜、低角X射线衍射观察到的结果，乙酰胆碱受体的总体形状和亚基排列如图9,34A所示，5个亚基排成环状，形成穿越脂双层的含水通道，其两端略膨出成前庭。肽链中含大量极性氨基酸的那段α-螺旋参与构成了含水通道的内壁，通道两端开口处成簇的负电性氨基酸使阴离子受到排斥，而阳离子只要直径小于0.65nm就可通 +++过。一般可通过的阳离子是Na、K和Ca，对这三种离子的选择主要取决于这些离子 ++各自的电化学梯度。当膜处于静息电位时，K的驱动力近乎为0，相反，Na很高的电 ++压和浓度梯度都作用于同一方向驱动离子进入细胞，虽然Ca的电化学梯度也如Na的 +一样，但它的细胞外浓度与Na相比无足轻重，所以，乙酰胆碱受体通道开放导致一次++Na的大量内流，最高速率约每个通道每毫秒30000个离子。这一Na内流引起肌肉细胞膜的去极化。 (六) 其他递质门控的离子通道与突触传递 对于分布于突触的递质门控的离子通道而言，各种通道蛋白互相的不同之处在于两点。首先，作为受体，它们对各自的配体，即从突触前膜释放的递质，有特异的结合位点;第二，作为通道，它们对允许通过的离子种类有选择性。这两点就决定了突触后 +膜的反应性质。兴奋性神经递质打开阳离子通道，引起Na内流，造成突触后膜去极 -+化，并且达到一定的阈值引发动作电位。相反，抑制性神经递质打开Cl通道或K通 14 -+道，这使得引发动作电位的兴奋性影响难以发挥，从而抑制了兴奋。Cl通道或K通道开放对膜兴奋性的影响是这样发生的:细胞外氯离子浓度大大高于胞内，但它的内流受 --膜电位的对抗，所以对许多神经元来说Cl平衡电位接近于膜静息电位。因而开放Cl通 -+道将缓冲膜电位的去极化，因为很多带负电Cl入膜会对抗去极化作用。K通道的开放也造成类似的效果。有意思的是，许多递质既可以是兴奋性的，又可以是抑制性的，取决于它们释放的部位、所结合的受体、所处的离子环境。例如乙酰胆碱就可以根据其受体种类的不同既是兴奋性的又是抑制性的。但是，通常情况下，乙酰胆碱、谷氨酸和5,羟色胺都作为兴奋性递质，,-氨基丁酸即GABA和甘氨酸则作为抑制性递质。 对乙酰胆碱、5,羟色胺、GABA 和甘氨酸反应的递质门控离子通道，它们的蛋白亚基氨基酸序列彼此有很高的同源性，说明这些递质门控的离子通道在进化上有密切关系。并且它们形成通道的方式也很接近，分子都为五聚体，只是它们的递质结合位点和离子选择性有异。但是，谷氨酸门控的离子通道似乎源于另一家族，它的分子是一个四 +聚体，有点类似K通道。 每一种递质门控的离子通道都有其多种亚型，它们可以由不同的基因编码，也可 的不同RNA拼接产生。各个变种的不同组合就产生了极其多样的亚以由同一基因产物 型，其配体不同，通道导电性不同，启闭速率不同，对药物和毒素的敏感性不同。例如，脊椎动物神经元的乙酰胆碱门控离子通道与肌肉细胞的就有不同。又如，脑内乙酰胆碱受体的不同亚型具有不同的功能。这些，使人们可以针对较小范围的神经元或突触种类来设计药物，对脑功能发生特异性的影响。事实上，递质门控的离子通道很久以来就是药物作用的重要靶点。外科医生为了让手术期间肌肉松弛可以使用箭毒，这种药取自南美土著人用作箭毒的植物，能阻断骨骼肌的乙酰胆碱受体。治疗失眠、焦虑、抑郁和精神分裂症的大多数药物都作用于化学突触，其中许多都与递质门控的离子通道结合。例如巴比妥类药和镇静药结合于GABA门控的离子通道，导致低浓度的GABA就 -能打开Cl通道，从而增强GABA的抑制性作用。离子通道分子生物学的新进展可望催生更为专一的新一代精神作用药物。除了离子通道之外，突触信号装置的其他成分也是 +精神作用药物的靶点。许多神经递质在突触间隙被清除是依靠Na,驱动载体的。如果药物能抑制该载体将会延长递质的作用，强化突触传导。许多抗抑郁药物还通过抑制递质的摄取发挥作用，如Prozac抑制5,羟色胺的摄取， 其他一些则既抑制5,羟色胺又抑制去甲肾上腺素的摄取。 三、神经肌肉传导中一系列离子通道激活过程 在神经冲动刺激肌肉收缩的过程中，至少有5组有闸门的离子通道在短短数个毫秒的时间内依次激活，从而实现了兴奋-收缩偶联。从中可见有闸门的离子通道对电兴奋细胞的重要性。 如图9,18所示，左图是静息状态的神经肌接头，其上分布的5组有闸门离子通道都是关闭着的;右图显示该处活化时的情形:(1)先是神经冲动到达末梢，其质膜去 ++极化，使其上的电压门控的Ca通道一过性打开，Ca从细胞外大量流入神经末梢细胞质内，启动了末梢释放乙酰胆碱;(2)释放的乙酰胆碱与突触后的肌细胞质膜上乙酰 +胆碱受体结合，一过性地打开了受体的阳离子通道，所造成的Na内流引起局部膜去极 ++化;(3)肌细胞质膜去极化打开了该膜上的电压门控的Na通道，使更多的Na进 15 +入，膜进一步去极化，这又促使更多的电压门控的Na通道开放，导致一次波及整个质膜的、自我扩大的去极化—动作电位;(4)肌细胞质膜的动作电位引起质膜的特殊部 ++位T管上电压门控的Ca通道活化;(5)相邻于T管的肌质网膜上的Ca释放通道被 ++开放，肌浆网内贮存的Ca大量进入胞质，胞质Ca浓度的突然升高引发了肌纤维的收 +缩。(肌细胞质膜去极化也可能激活肌醇磷脂信号通路引发Ca从肌质网中释出，这在 ++此处不予讨论。)为什么T管膜上电压门控的Ca通道活化能打开肌质网膜上的Ca释放通道仍不清楚。但是这两处膜紧密相靠，两种通道通过一种特殊结构联结在一起，因 +此，电压引发的质膜上Ca通道的构象变化完全可能通过机械性偶联直接打开肌质网膜 +上的Ca释放通道。 图9,18 神经肌接头部位的离子通道系统 (引自Alberts等，2002) 参照前书图9-35 第四节 离子导体 虽然此处把离子导体(ionophores)与载体蛋白、通道蛋白相提并论，但离子导体并不是真核细胞的膜运输蛋白，而是一类由微生物合成的小分子多肽，在此只略作叙述。 离子导体能溶解在脂双层中，增加膜对某些离子的通透性。作为抗生素，它们使细菌能通过破坏其敌对微生物生存所必需的离子梯度来杀灭其对手。现在将离子导体广泛用于细胞生物学研究，以提高各种合成膜和天然膜对特异离子的通透性。离子导体在介导离子运输时不需能量，它们把所运离子的电荷遮蔽起来，使之能顺其梯度穿越脂双层。有的离子导体在膜层内穿梭移动，在膜一侧“抓住”所运离子到另一侧“放下”， +++如缬氨霉素运输K、A23187运输Ca和Mg。另一些离子导体形成通道让特异离子通 +过，如短杆菌肽A运输H。 (易 静) 参考文献 1 Alberts B., Brey, D., Lewis, J. et al. 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