甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用 .doc

甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用 .doc 甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用 作者:张建军 李洪源 王吉锡 李鑫 朴英爱 陈振华 谢志平 杨庆伟 【摘要】 目的 研究甘草抗病毒活性成分(GX)体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法 采用中性红实验和观察细胞病变(CPE)法，以利巴韦林为阳性药,测定GX对RSV的抑制作用。结果 GX的半数中毒浓度(TC50)为460.00?μg/ml，半数有效抑制浓度(EC50)为23.53?μg/ml，治疗指数(TI)为19.55;GX在RSV感染Hela细胞2，4，6，8，10?h后给药, 对RSV复制均有明显的抑制作用(P0.01);且GX对RSV有中和作用。结论 GX在体外对RSV复制有明显的抑制作用。 【关键词】 甘草;呼吸道合胞病毒;抗病毒作用 呼吸道合胞病毒(RSV)是一个世界范围内婴幼儿最常见的呼吸道感染的病原体。目前，对RSV的防治仍无有效的疫苗和药物〔1〕。近年来，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药开发的一个热点〔2〕。本课题组在2004年报道甘草水提液具有明显的抗RSV的作用;在2005年发现甘草有效部位GC3 1 4具有抗RSV的作用基础上〔3〕,进一步分离到抗病毒活性成分(GX)，并在细胞水平上检测其抗RSV的作用。现将结果如下。 1 对象与方法 1 1 材料 甘草(产地内蒙古，经黑龙江省药品检验中药研究所鉴定)。利巴韦林注射液(天津药业集团新郑股份有限公司,批号:0610152)。人宫颈癌传代细胞(Hela),(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。呼吸道合胞病毒(RSV-Long株)(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。RSV在Hela细胞中的组织半数感染量(TCID50)为1×10-6.6/0.2?ml。本次实验采用100TCID50/0.2?ml的感染量。硅胶制备板(安徽良臣硅源材料厂)。甲醇、三氯甲烷、无水乙醇等，均为分析纯(天津市博迪化工有限公司)。中性红(上海华舜生物工程有限公司)，用磷酸盐缓冲液稀释。脱色液:由无水乙醇、枸橼酸钠和盐酸组成。 1 2 方法 1 2 1 甘草抗病毒活性成分(GX)的制备 甘草经水煎煮浸提、醇沉、大孔吸附树脂柱层析得到的GC3 1 4,再经由氯仿和甲醇组成的展开剂，在硅胶板上经薄层层析得GX。 1 2 2 药物毒性实验 用细胞维持液将GX和利巴韦林释为7个浓度组，分别加入到Hela细胞已长成单层的96孔培养板上。同时设正常细胞对照组。置35?、5% CO2培养箱培养3?d后，弃去维持液,每孔添加0.2?ml中性红染液,放回培养箱培养2?h。取出后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,添加0.2?ml脱色液。室温暗处放置30?min后,酶标仪450?nm波长下测吸光度(A)值〔4〕，测定细胞存活率，求药物半数中毒浓度(TC50)。细胞存活率=药物组平均A值/细胞对照组平均A值×100%。 1 2 3 药物抗RSV实验 参照文献 〔5〕。实验分3组进行。(1)药物的抑制作用:在96孔板上，接种100TCID50/0.2?ml RSV液，0.2?ml/孔。吸附2?h后，分别加入不同浓度的GX和利巴韦林。置培养箱中培养。同时设正常细胞对照组和病毒对照组，待病毒对照组细胞病变(CPE)为4时，中性红实验同上,测定病毒抑制率，求药物的半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。病毒抑制率=〔实验组(药物+病毒)平均A值-病毒对照组平均A值〕/〔正常细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值〕×100%。CPE记录规则:0为细胞无CPE;1为0,25% CPE;2为25%,50% CPE;3为50%,75% CPE;4为75%,100% CPE。TI=TC50/EC50。(2)不同时间给药对RSV抑制作用:向96孔板中，加入100TCID50/0.2?ml RSV液，0.2?ml/孔，分别作用2，4，6，8，10，12?h后吸弃病毒液，再分别加入GX(浓度为120.00?μg/ml)和利巴韦林(浓度为80.00?μg/ml)，培养方法同上。待病毒对照组CPE为4时，记录CPE结果。(3)药物的中和作用:200TCID50/0.2?ml RSV液与含不同浓度药物的维持液等体积混合，35?作用2?h后,加到96孔板中，0.2?ml/孔。吸附2?h，弃上清，加细胞维持液，置培养箱中培养。待病毒对照组CPE为4时，记录CPE结果。 1 3 统计分析 采用SAS?8 2软件进行分析。利用Reed Muench法测定病毒TCID50，Logit回归计算药物TC50和EC50〔6〕。不同时间处理组或不同剂量组与病毒对照组之间的结果比较采用Kruskal-Wallis法。2 结 果 2 1 药物毒性结果测定 根据中性红实验测定细胞存活率，Logit回归计算得GX的TC50为460.00?μg/ml，利巴韦林的TC50为1.01?mg/ml。 2 2 药物对细胞内RSV抑制作用(1) 表1 GX和利巴韦林对RSV的抑制作用GX浓度(略) 经Logit回归方法计算得GX的EC50为23.53?μg/ml，利巴韦林的EC50为12.90?μg/ml。所以GX的TI为19.55，利巴韦林的TI为78.29;GX在一定浓度时对RSV在Hela细胞内的复制有明显的抑制作用。 2 3 不同时间给药对RSV抑制作用 Kruskal-ed Sao Paulo,2001,56(3):79-90. 〔2〕朱丹,刘华刚.抗病毒中药的最新研究进展〔J〕.中国医学文摘:内科学，2005，26(6):747-748. 〔3〕刘鑫妍，李洪源，王秀琴，等.甘草抗病毒有效部位(GC3-1-4)体外抑制呼吸道合胞病毒的研究〔J〕.中医药信息，2006，23(4):65-67. 〔4〕Mark RP,Dale LB,Paul FT.Potent inhibition of respiratory syncytial virus replication using a 2-5A-antisense chimera targeted to signals ic RNA 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1998,95(15):8874-8879. 〔5〕何静，杨占秋，石丽桥，等.盐酸阿比朵尔抗呼吸道合胞病毒机制初探〔J〕.武汉大学学报:医学版,2006,27(1):69-71. 〔6〕刘昌孝， 孙瑞元.药物评价实验与统计学基础〔M〕.北京:军事医学科学 出版社，1999:31-32. 〔7〕Jeffrey IC.Licking latency with licorice 〔J〕.J Clin Invest,2005，115(3):591-593. 〔8〕汲晨锋, 姜薇,王晓晶.甘草多糖的化学与药理研究.〔J〕哈尔滨商业大学学 报:自然科学版，2004,20(5):515-518.