补虚祛瘀法对创面修复肉芽组织形成期Smad3，TGF-β1的影响

补虚祛瘀法对创面修复肉芽组织形成期Smad3，TGF-β1的影响 补虚祛瘀法对创面修复肉芽组织形成期 Smad3，TGF-β1的影响 ? 6’JoumalOfGuarNxiTraditionalChineseMedicalUniversity2008.Vo1.11No.3 脑损伤关系的实验观察[J].卒中与神经疾病,2000,7 (2):98—100.一 [6]余家阔,吴毅文,汪发贵,等.实验性颈椎应力分布改变 对颈椎组织结构的影响[J].中华外科杂志,1993,31(8): 456—460. [7]王建英,任引哲.氧自由基与人体健康[J].化学世界, 2006,47(1):62—63. (编辑陈明伟) 补虚祛瘀法对创面修复肉芽组织形成期 Smad3,TGF—l31的影响 郭刚,秦海洗,何长杰.,唐汉钧 (1.上海同济大学附属同济医院,上海200065;2.广西中医学院,广西南宁530001; 3.山东省泰安卫生学校,山东泰安271000;4.上海中医药大学附属龙华医院,上海200032) 摘要:[目的]研究补虚祛瘀法促进慢性难愈性创面愈合的机理.[方法]采用改良付氏大鼠模型为研究对象,分为模型 对照组,复黄生肌愈创油膏组,补虚方油膏组,祛瘀方油膏组,康复新阳性对照组,运用免疫组化法分别研究各组第10天时创 面瘢痕组织中Smad.3,TGF—pl的变化.[结果]第l0天时,复黄生肌愈创油膏组Smad3,TGF一&表达明显低于模型对照组, 补虚方油膏组Smad3的表达亦明显低于模型对照组.[结论]提示复黄生肌愈创油膏在创面修复肉芽组织形成期,对TGF— B】一Smad3信号转导通路的调控起着重要作用. 关键词:创面修复;瘢痕;Smad3;TGF—pl 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1008—7486(2008)03—0006—02 慢性难愈性创面成因复杂,类型多样,不仅从肉体和精 神上给患者带来极大痛苦,同时也加重了社会和家庭的经济 负担.中医药治疗慢性难愈性创面具有自身的优势和特色, 在中医外科临床中已得到证实.本研究通过实验观察补虚 祛瘀法对创面修复肉芽组织形成期Smad3,TGF—Bl的影 响,以阐明其作用机理,并为中医药治疗慢性难愈性创面提 供理论依据. 1实验材料 1.1实验动物雄性清洁级SD大鼠30只,体重400?20g. 上海中医药大学动物实验中心提供,动物合格证号SCXK (沪)2003—0002. 1.2受试药物补虚方油膏(药物成分主要有鸡蛋黄油,珍 珠粉,40g生药/100g膏,批号:20030915一B);祛瘀方油膏 (药物成分主要有大黄,血竭,12g生药/100g膏,批号: 20030916一Q).复黄生肌愈创油膏(由补虚方和祛瘀方组合 而成,药物成分主要有大黄,鸡蛋黄油,血竭,珍珠粉,52g生 药/100g膏,批号:20030911一F);以上三方中的各味药用量 相同,均由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供,同期 制备及低温储藏.康复新(四川佳能达攀西药业有限公司, 批号M060827). 1.3实验试剂 1.3.1大鼠创面模型制备用药新洁尔灭酊,0.9%生理盐 水,0.1%盐酸氯胺酮. 收稿日期:2008—03—28 1.3.2免疫组化试剂Smad3多克隆抗体(上海博士德公 司,批号:H00004089一M10);TGF一81多克隆抗体(Santa Cruz公司,批号:H00005023一gl1);Envisim试剂盒(丹麦 DAKO公司,批号:I-.30308607). 2实验方法与结果 2.1动物分组及造模30只大鼠随机分为模型对照组(生 理盐水),复黄生肌愈创油膏组,补虚方油膏组,祛瘀方油膏 组,阳性对照组(康复新),每组6只.采用改良付氏糖尿病 慢性难愈合创面大鼠模型方法…,腹腔注射氯胺酮(O.2ml/ 只)麻醉大鼠,在无菌条件下用眼科手术剪刀在糖尿病模型 大鼠背中部打一圆孔,深至筋膜,直径1.8cm,创面面积为 2.54cm2,创面止血后无菌纱布包扎.造模后当天开始给 药,每天清洁创面,更换药物1次,连用l0天.各用药组给 药剂量以均匀涂覆创面,油膏厚度0.5mm为度,每次1.5g, 模型对照组以生理盐水清洁即可. 2.2标本采集造模后第1O天,用眼科手术剪分离留取各 创面新生肉芽组织500?10mg. 2.3免疫组化实验步骤?5组标本均用1%中性福尔马 林固定,石蜡包埋,连续切片,同时进行免疫组化Envisim二 步法测定Smad3,TGF—BI.?图像:选择200倍视野, 每张免疫组化片任选3个视野,拍照后用AdobePhotoshop CS8.0作分析,数据导入Excel,建立数据库.评定指标:实 验结果以细胞及基质显色面积为,小于5%为一,5%, 2008年第11卷第3期广西中医学院学报?7? l0%为+/一,10%,30%为+,3O%,50%为++,50% -- 80%为+++,大于80%为++++. 2.4统计学处理采用SPSS11.5统计软件包对相关数据 进行秩和检验(Kruskalwa1lisTest),并用SAS8.0统计软件 包做多个样本的两两比较.统计数据以Meanrank和Chi— Square值表示,P<0.05具有统计学意义. 2.5实验性创面第10天肉芽组织中Smad3,TGF一131的表 达结果见表1. 表1各组对实验性创面第10天肉芽组织中 Smad3,TGF—l表达的影响 注:与模型对照组相比,?P<0.05 结果显示,复黄生肌愈创油膏组能明显降低改良付氏糖 尿病慢性难愈合创面大鼠模型创面新生肉芽组织的TGF一 13I及Smad3表达(P<0.05);补虚方油膏组仅降低Smad3 表达(P<0.05);祛瘀油膏组对TGF一l及Smad3表达无 明显影响. 3讨论 传统中医学认为,创面愈合过程是”腐祛肌生,肌平皮 长”的过程,”祛腐生肌”的指导思想一直占有重要地位.而 慢性难愈性创面常常是”祛腐而腐不脱,腐脱而肌不生”.唐 汉钧教授在对历代中医学文献深入研究和的基础上,结 合自己多年临床经验,并参以现代医学研究成果,针对慢性 难愈性创面提出了”补虚祛瘀”的学术观点.认为慢性难愈 性创面难以愈合之原因在于”虚瘀并存,互为标本”,”虚瘀并 存”则”腐肉难脱,新肉难生”.”复黄生肌愈创油膏”是在”补 虚祛瘀”指导思想下配伍组方,专为慢性难愈性创面而设. 在多年的临床应用中,证明此油膏不但促进愈合作用明显, 而且愈后瘢痕面积小,质量佳,皮色接近正常,愈后不易复 发[2l. 在伤口愈合过程中,TGF—t3信号传递,首先是TGF— Bl与其特异性I,?型受体结合成三元复合物,然后是?型 受体使I型受体GS区中的丝氨酸/络氨酸激酶发生磷酸化, 最后由Smad3蛋白完成细胞内的信号传递-3J.转化生长因 子(TGF一)是伤El愈合中重要的调控因子,同时也被公认 为最强的致纤维化因子,激活细胞内信号转导分子Smad3是 其促进胶原合成的必由途径【4J.然而,创面修复是一个动态 的病理生理过程,在修复过程中分为连续而又相互重迭的3 个阶段,即炎症期,肉芽组织形成期和瘢痕形成重塑期.不 同时期的生长因子的表达各异,我们在研究中以TGF一, Smad3为主线,选择皮肤全缺损动物模型第l0天时,观察不 同方剂对创面修复过程中肉芽组织形成期信号转导的影响. 我们在实验中发现,第10天时,复黄生肌愈创油膏组 TGF—l表达及Smad3分子的表达均明显低于模型对照组; 补虚方组Smad3分子的表达明显低于模型对照组.有研究 表明TGF一对角质形成细胞的生长和趋化作用依赖于 ~-nad3,其最终结果是抑制重上皮化.~nad3在体内传递重 上皮化的抑制信号,并介导单核细胞和中性粒细胞向TGF一 l的化学趋化性迁移.Smad3介导的信号途径在体内抑制 创伤愈合,因为去除Smad3可引起了重上皮化的加速和伤口 面积的缩小J.据此,我们认为:复黄生肌愈创油膏在肉芽 组织形成期的作用是减少Smad3的分泌,从而加速创面重上 皮化,促进了伤口愈合.而补虚方组表现与复黄生肌愈创油 膏组相似,这表明复黄生肌愈创油膏的作用有可能来自于组 方中的补虚类中药. 由上分析,提示复黄生肌愈创油膏通过对TGF一岛, Smad3分子表达的影响,直接调控创面的修复.当然创面修 复过程相当复杂,有众多细胞因子的参与以及多种因素的影 响,但复黄生肌愈创油膏在创面修复过程中对TGF一I一 . ~nad3信号转导通路的调控可能是其促进难愈性创面愈合 的机制之一. 参考文献 [1]付小兵,王亚平,孙同柱,等.糖尿病慢性难愈合创面大 鼠模型的制备[J].上海实验动物科学,1997,17(4):217 — 219. [2]唐汉钧,张士云,程亦勤,等.复黄生肌愈创油膏对减少 慢性皮肤溃疡瘢痕形成的临床观察[J].上海中医药杂 志,2001,35(8):26—28. [3]ChinGS,LiuW,PeledZ,eta1.Differentialexpressionof transforminggrowthfactor—betareceptorsIand?and activationofSmad3inkeloidfibroblasts[J].HastRemnstr Surg,2001,108(2):423—429. [4]ChenSJ,YuanW,MoriY,eta1.StimulationoftypeI oollagentranscriptioninhumanskinfibroblastsbyTGF—— betainvolvementofSmad3[J].JInv~tDermatol,1999, l12:49—57. [5]g&llgeD,PerssonU,Wol1inaU,eta1.Expressionof TGFbetarelatedSmadproteinsinhumanepithelialskin tumors[J].IntJoncol,1999,14:1049—1056. (编辑陈明伟)