金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染RAW264

金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染RAW264 金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒 感染 RAW264.7 细胞 Toll 样受体 3 表达的调控作用# 5 10 15 20 25 30 35 40 李佳曦，汪受传，徐珊，徐建亚，戴启刚** (南京中医药大学中医儿科研究所，南京 210029) 摘要:目的:通过研究金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)活化诱导的 Toll 样受 体 3 Toll like receptor 3, TLR3 的干预作用，探讨其治疗 RSV 肺炎可能的免疫学机制。 方法:RSV 感染体外培养的 RAW264.7 细胞，采用金欣口服液含药血清进行干预，24h 后收集 细胞，Real time RT-PCR 法测定 TLR3 mRNA 的表达变化;激光共聚焦显微镜观察免疫荧光 细胞化学染色法处理的各组细胞 TLR3 表达水平;ELISA 法检测各组细胞培养上清中白细胞 介素 6 Interleukin, IL-6 含量，在核酸及蛋白水平探讨金欣口服液含药血清抗 RSV 感染 的作用机制。结果:RSV 感染 RAW264.7 细胞后 24h，细胞中 TLR3 mRNA 和蛋白表达水平以及 细胞培养上清中 IL-6 表达明显升高 P 0.01 ，而金欣组 TLR3 及 IL-6 表达均显著低于 RSV 感染组(P 0.01)。结论:金欣口服液含药血清能下调 RSV 活化诱导的 TLR3 及其下游炎症 因子 IL-6 的高表达，推测其为金欣口服液抗 RSV 感染的机制之一。 关键词:金欣口服液;含药血清;呼吸道合胞病毒;Toll 样受体 3;白细 胞介素 6;小鼠肺 巨噬细胞 Regulation of Jinxin Oral Liquid Drug Serum on the expression of Toll like receptor 3 in RAW264.7 cells infected with RSV LI Jiaxi, WANG Shouchuan, XU Shan, XU Jianya, DAI Qigang Pediatric Institution of Nanjing University of Chinese Medicine, NanJing 210029 Abstract: Objective: To investigate the regulation of Jinxin oral liquid drug serum on the expression of Toll like receptor 3 TLR3 in RSV infected RAW264.7 cells. Methods: RAW264.7 cells were infected with RSV, and treated with the drug serum of Jinxin oral liquid. 24 hours later, detected the level of TLR3 mRNA and protein with Real time RT-PCR and immunofluorescence IF assay; collected the supernatant and measured the level of Interleukin 6 IL-6 . Results: The expression of TLR3 mRNA and protein and IL-6 was up-regulated significantly compared with the control group P 0.01 , but they were typically down-regulated in Jinxin oral liquid groups compared with RSV infected groups P 0.01 . Conclusion: TLR3 signaling pathway maybe the target of Jinxin oral liquid in anti-RSV infection. Keywords: Jinxin Oral Liquid; drug serum; Respiratory Syncytial Virus; toll like receptor 3; Interleukin 6; pulmonary macrophage 0 引言 呼吸道合胞病毒 Respiratory Syncytial Viral, RSV 为副黏病毒科肺炎病毒属，是有包膜 非片段性的单股负链 RNA 病毒，是导致婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒病源[1]。Toll 样 受体(Toll like receptors, TLRs)是近年来发现的在抗病原微生物免疫防御反应中起重要作 用的受体蛋白，通过识别多种病原微生物的病原相关分子模式 Pathogen-associated Molecular 基金项目:全国高等学校博士学科点专项科研基金(201XXXXXXXXXX3) 作者简介:李佳曦，(1984-)，男，博士研究生。 通信联系人:汪受传，(1946-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向:小儿肺系疾病研究. E-mail: wscnj@126 -1- Patterns, PAMPs ，从而启动天然免疫和调节性免疫反应[2-3]，是机体天然免疫的重要组成部 分。其中 TLR3 可以识别病毒复制中间产物 dsRNA(Martinez 和 Melero[4]等已证明 RSV 在 胞内复制过程中会形成短的小分子 dsRNA 片段)，引起通路中相关转录因子活化，诱导下 45 50 游如 IL-6 等促炎性细胞因子等的高表达，从而发挥相应的清除病原微生物以及炎症免疫反 应[5-8]。 本课题组前期临床研究已证明，金欣口服液治疗小儿病毒性肺炎痰热闭肺证临床疗效显 [9] 抑制人胚肺成纤维细胞钙离子内流等发挥了直接或间接的抗病毒作用[11]。本实验将从与 RSV 胞内复制密切相关的 TLR3 入手，进一步探讨金欣口服液含药血清体外抗 RSV 感染的 作用机制。 1 材料 1.1 病毒与细胞 呼吸道合胞病毒 A 亚型 Long 株(武汉大学国家典型培养物保藏中心); HEp-2 细胞(中 55 国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);RAW264.7 细胞(由南京中医药大学第一临 床医学院尚文斌副教授惠赠)。 1.2 主要药物及试剂 金欣口服液，由炙麻黄、苦杏仁、生石膏、黄芩、葶苈子、桑白皮、前胡、虎杖组成， 经江苏省植物药深加工工程中心制备和质控，含生药 1.351g/mL;利巴韦林注射液(1mL;0.1g， 60 国药准字:H19999427，南京金陵药业股份有限公司)。DMEM 高糖培养基(Wisent, Canada)、 0.25%胰酶(GIBCO, USA);胎牛血清(PAA, Germany);MTT、DMSO(AMRESCO, USA); RNA 提取试剂 RNAiso plus、Real time RT-PCR 试剂盒(TAKARA, Japan);兔抗 TLR3 多 克隆抗体(ABcam, USA);Alexa Fluor 488 羊抗兔荧光二抗(Invitrogen, USA)。 65 1.3 仪器 酶标仪，EXL800 型(BioTek, USA);倒置显微镜 BX-50、激光共聚焦显微 镜(Leica, Germany);低温高速离心机 Centrifuge 5810R、梯度 PCR 仪、生物分光光度计(eppendorf, Germany);Lightrcycler 实时荧光定量 PCR 仪(Roche, Germany);水平电泳仪(Bio-Rad, USA);紫外凝胶成像仪 Alphalmager HP(Alpha innotech, USA); TNF-α ELISA 检测试剂 盒(R&D, USA);酶标仪 EXL800 型(BioTek, USA)。 70 2 方法 2.1 分组 本实验共分 4 组:金欣口服液含药血清干预组、利巴韦林干预组、正常细胞对照组、 RSV 感染细胞模型组(分别简称金欣组、利巴韦林组、正常组、RSV 组)。 75 2.2 含药血清制备 参照本课题组前期含药血清制备方法制备金欣口服液含药血清[12]。免疫荧 光预实验结 果显示，此次制备的实验用含药血清本身对 TLR3 有一定刺激作用，为最大程度避免其对 TLRs 产生干扰，采用甲醇沉淀蛋白的方法进行血清样品处理。具体方法:1mL 金欣口服液 -2- 含药血清，加 3mL 甲醇，充分混匀后 4?静置过夜，4000rpm，4离心 15 分钟，取上清， 氮吹仪 37水浴挥干后加 1mL 细胞维持液复溶，一次性无菌 0.22μm 滤器过滤除菌后备用。 80 2.3 Hep-2 及 RAW264.7 细胞培养 两种细胞均采用 DMEM 高糖培养基(含有 10%FBS，100 U/mL 青霉素, 100 mg/mL 链 霉素)，37,5%CO2 孵箱饱和湿度下常规培养。生长状态良好的细胞每 2-3 d 传代，0.25% 胰酶+0.25%EDTA 消化 2-3min，镜下观察细胞回缩变圆时终止消化，每次分 3-5 瓶。所有实 验均采用对数生长期细胞。 85 2.4 RSV 扩增及组织培养半数感染量 TCID50 的测定 使用体外培养的 HEp-2 细胞进行 RSV 扩增，具体方法参照前期实验[12]，滴度测定采用 Reed-Muench 。 2.5 金欣口服液含药血清及利巴韦林注射液对细胞最大无毒浓度测定 RAW264.7 细胞以 1×105/ml 浓度加入 96 孔细胞板，每孔 100μl，待长 成单层后，加入 90 95 不同稀释度的金欣口服液含药血清(经醇沉处理，用维持液稀释成不同稀释度)100%、90%、 80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%，10 个浓度,及用维持液稀释的利巴韦林 注射液 2mmol/L、1mmol/L、500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L，6 个浓度， 每孔 100μL，并设正常细胞对照。置 37, 5%CO2 培养箱中培养 24h，每孔加入 MTT 1mg/ml 20μl，置孵箱孵育 4h，吸弃孔内上清液，每孔加入 150μL DMSO，振荡,使结晶物充分溶解， 酶标仪 490nm 波长测定各孔光吸收值 OD，确定药物的最大无毒浓度。以上实验独立重复 3 次。 2.6 Real time RT-PCR 法 RAW264.7 细胞以 5×105 个/mL，铺于 6 孔细胞培养板，每孔 2.5mL，待细胞长至 80% 左右时，除细胞对照组外，各组接 100TCID50 的 RSV 500uL，37，5%CO2 恒温吸附 1.5h， 100 吸弃病毒液，给药组分别加金欣含药血清及利巴韦林 2.5ml，正常细胞组及病毒组加入细胞 维持液。37，5%CO2 恒温培养箱继续培养 24h，各组加 RNAiso plus 1mL 收集细胞，按照 试剂盒说明提取细胞总 RNA，琼脂糖凝胶电泳及生物分光光度计对 RNA 定性及定量分 析，按照 RT-PCR 试剂盒说明将 RNA 反转录成 cDNA，SYBR Green 实时荧光定量 PCR 法 检测 TLR3 mRNA 转录水平，TLR3 引物设计参照文献[13]，TLR3: 5’-CAGGATACTTGATCTC 105 GGCCTT-3’, 5’-TGGCCGCTGAGTTTTTGTTC-3’; β-acting: 5’-GCCTTCCTTCTTGGG TAT-3’; 5’-GTCTTTACGGATGTCAACG-3’ 。实时荧光定量 PCR 反应条件:95预变性 10s， 95变性 5s，55退火 10s，72延伸 15s，共 45 个循环，同时做熔解曲线。以上实验独立 重复 3 次。 110 2.7 细胞免疫荧光化学分析法 RAW264.7 细胞以 1×105 个/mL 铺于 24 孔板，每孔 1mL 设置细胞爬片， 待细胞长至 80%左右时，除细胞对照组外，各组接 100TCID50 的 RSV 200uL，37，5%CO2 恒温吸附 1.5h，吸弃病毒液，给药组分别加金欣含药血清及利巴韦林各 1ml，正常细胞组及病毒组各 加入细胞维持液 1mL，于 37，5%CO2 恒温培养箱继续培养 24h，吸弃培养基，PBS 清洗 细胞 3 次，每孔加 4预冷 4%多聚甲醛 1mL 于 4固定 30 分钟，PBS 清洗细胞 3 次，每孔 115 加 1ml 0.1%曲拉通 0.5h 增加细胞膜通透性，PBS 清洗细胞 3 次，封闭液 室温封闭 1h，弃封 -3- 闭液加一抗(1:200)，4孵育过夜，PBS 清洗细胞 3 次，加二抗(1:1000)，室温孵育 1h， 加 DAPI 染核 1 分钟，PBS 洗 3 遍后取出爬片，细胞面朝下盖于滴有抗荧光淬灭封片剂的载 破片上封片，避光室温 1h，激光共聚焦显微镜下观察目标蛋白表达情况，各组随机取 6 个 视野，LAS-AF-lite- 软件分析各实验组 TLR3 表达的荧光强度。 120 2.8 2.9 ELISA 法测定中 IL-6 的含量 严格按照试剂盒测定各组细胞培养上清中 IL-6 的含量。 统计学处理 Realtime RT-PCR 实验数据采用相对定量法计算，该法用以比较经过处理的样品和未经 处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-ΔΔCt 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相 125 对变化的一种简便方法[14, 15]，ΔΔCt Ct 样本-Ct 内参 受试组- Ct 样本-Ct 内参 对照组。各组 数据采用均数?标准差( ?s)表示，组间两两比较采用单因素方差分析，P 0.05 表示有显 著性差异，P 0.01 表示有极显著差异，P 0.05 表示无统计学意义。 3 结果 130 3.1 金欣口服液含药血清及利巴韦林对 RAW264.7 细胞最大无毒浓度 在 RAW264.7 细胞中，醇沉后的金欣口服液最大细胞无毒浓度为 40%稀释 度;利巴韦 林注射液最大无毒浓度为 500μmol/L。 135 3.2 3.3 RSV A 亚型 Long 株 TCID50 在 Hep-2 中,RSV long 株 TCID50 为 10-4.385/50μL。 金欣口服液含药血清对 TLR3 mRNA 表达的影响 图 1 示，RSV 诱导 RAW264.7 细胞 TLR3 mRNA 的高表达(正常对照组与之比较， * P 0.01)，提示本实验造模成功，金欣口服液含药血清能显著下调 RSV 诱导 的 TLR3 mRNA 的高表达(与 RSV 组比较，*P 0.01)，而利巴韦林注射液对 RSV 诱导的 TLR3 mRNA 高 表达虽有一定的抑制作用，但与病毒组相比无统计学意义(P 0.05)。 140 图 1 金欣口服液含药血清对 TLR3 mRNA 表达的影响(n 3， ?S) P -4- 145 3.4 金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 TLR3 蛋白表达的调控 作用 图 2 中绿色部分为绿色荧光蛋白标记的 TLR3，蓝色部分为 DAPI 染色的 RAW264.7 细 胞核。结果显示:正常组绿色荧光强度低，提示正常 RAW264.7 细胞中 TLR3 有一定的基础 表达，但含量低;RSV 组绿色荧光强度高，提示 RSV 感染 RAW264.7 细胞后引起 TLR3 高 表达;金欣组绿色荧光强度较 RSV 感染组明显降低，提示金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 TLR3 高表达具有明显的下调作用;利巴韦林组绿色荧光强度与 RSV 组无 150 155 明显差别。各组结果与 TLR3 mRNA 表达相吻合。 A:正常组 B:RSV 组 C:利巴韦林组 D:金欣组 图 2 激光共聚焦显微镜观察金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 TLR3 蛋白表达的调控(×400) -5- 图 3 金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 TLR3 蛋白表达的 影响(n 6， ?S) 160 3.5 P 金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 IL-6 表达的影响 结果显示 RSV 感染 RAW264.7 细胞后 24 小时，IL-6 表达较正常细胞组显著增高 (P 0.01)，而金欣口服液含药血清组 IL-6 表达较 RSV 感染组低(P 0.05)。 165 图 4 金欣口服液含药血清对 RSV 感染 RAW264.7 细胞 IL-6 表达的影响(n 6， ?S) ? 4 结论 170 175 180 天然免疫是机体抵御细菌、真菌、病毒等病原体感染的第一道防线，而作为天然免疫重 要组成部分的 Toll 样受体家族在联系天然免疫和获得性免疫中起着桥梁作用。据相关文献 报道[16]，迄今为止已知的能识别 RSV 相关 PAMP 的 TLRs 主要为:TLR4 识别 RSV 融合蛋 白(F)，TLR3 识别病毒复制中间产物 dsRNA，TLR7/8 识别 RSV 的 ssRNA。当 RSV 入侵 时，TLR4 作为病毒包膜糖蛋白的识别对象，RSV 的融合蛋白(F)是活化 TLR4 的病毒成 分，而 RNA 病毒基因组突变所致相关蛋白分子的改变，是其免疫逃逸的主要策略之一，因 此 TLR4 很可能无法识别突变后的 RSV 膜蛋白 PAMP 基序，而可以识别病毒 dsRNA 的 TLR3 就可能发挥重要作用[17]，而 TLR3 信号通路一旦被激活，就会引起下游促炎性因子的大量释 放，加重机体炎症反应。 金欣口服液是治疗小儿病毒性肺炎的临床有效方剂，此次实验结果表明，该方对 RSV 活化诱导的 Toll 样受体 3 高表达具有明显的下调作用，且对 TLR3 信号通路下游炎症因子 IL-6 及 TNF-α 等的高表达，亦具有一定的抑制作用，从而起到了减轻炎 症反应，缓解因过 度炎症反应而造成的对机体的伤害，推测其可能是金欣口服液治疗 RSV 肺 炎的作用机制之 一。 -6- [参考文献] References 185 190 195 200 205 210 215 220 [1] Harris J, Werling D. Binding and entry of respiratory syncytial virus into host cells and initiation of the innate immune response [J]. CellMicrobio,2003,5 10 :671-680 [2] Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat. Immunol. 2001, 2 8 :675-680. [3] Akira, S. Toll-like receptors and innate immunity. Adv. Immunol [J]. 2001, 78:1-56. [4] Martinez I, Melero JA. A model for the generation of multiple A to G transitions in the human respiratory syncytial virus genome: predicted RNA secondary structures as substrates for adenosine deaminases that act on RNA [J] J. Gen. Virol. 2002, 83:1445-1455. [5] Kopp E, Medzhitov R. Recognition of microbial infection by Toll-like receptors. Curr Opin Immunol [J]. 2003, 15 4 :396-401. [6] Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol [J], 2003, 21:335-376. [7] Vasselon T, Detmers PA. Toll receptors: a central element in innate immuneresponses. Infect Immun [J]. 2002, 70 3 :1033-1041. [8] Sabroe I, Read RC, Whyte MK, et al. Toll-like receptors in health and disease: complex questions remain. J Immunol [J].2003, 171 4 : 1630-1635. [9] 汪受传,韩新民,任现志,等.小儿病毒性肺炎痰热闭肺证治疗方法研究 [J].南京中医药大学学报, 2004, 20 2 : 72-75. [10] 廖辉,汪受传,徐建亚,等.金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒黏附, 膜融合影响的实验研究[J].实用中 西医结合临床, 2008, 8 1 : 3-4. [11] 陈彩霞,汪受传.金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞 胞内钙离子的影响[J].江西中医学 院学报, 2009, 21 2 : 52-54. [12] 李佳曦,汪受传,徐建亚,等.金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦 醇对 RSV 的 RNA 聚合酶转录活性 的影响.南京中医药大学学报,2011,27 1 :36-39. [13] Matsushima H, Yamada N, Matsue H, et al. TLR3-, TLR7-, and TLR9-mediated production of proinflammatory cytokines and chemokines from murine connective tissue type skin-derived mast cells but not from bone marrow-derived mast cells. Journal of Immunology, 2004, 173 1 :531-541. [14] Winer J, Jung C K, Shackel I, et al Development and validation of real time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro [J] . Anal Biochem, 1999, 270 1 : 41. [15] Schmittgen T D, Zakrajsek B A, Mills A G, et al. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real time methods [J] . Anal Biochem, 2000, 285 2 : 194. [16] Janssen R, Pennings J, Hodemaekers H, et al. Host transcription profiles upon primary respiratory syncytial virus infection [J]. J Virology. 2007, 81 11 : 5958-5967. [17] Xiao-hong Xie, Helen K. W. Law, Li-Jia Wang, et al. Lipopolysaccharide Induces IL-6 Production in Respiratory Syncytial Virus-Infected Airway Epithelial Cells Through the Toll-Like Receptor 4 Signaling Pathway [J]. Pediatric Research. 2009, 65 2 : 156-162. -7- 行业 精品 著 ，而实验研究亦认为该方在 RSV 感染细胞生命周期中，通过抑制病毒融 合、入侵[10]， 注:与 RSV 组比较*P 0.01;与利巴韦林相比 0.01 注:与 RSV 组比较*P 0.01;与利巴韦林相比 0.01 注:与 RSV 感染组比较*P 0.01，**P 0.05;与利巴韦林相比 P 0.05。