抗原抗体知识

抗原抗体知识 抗原 (antigen, Ag) ? 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性: – 免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性; – 免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 ? 根据抗原是否显示免疫原性分为: – 完全抗原:分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。 • 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 – 半抗原:又称为不完全抗原，分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。 • 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。 载 体 ? 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给偶联的半抗原能力。 – 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋 OVA)等。 白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin， – 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5,25个分子的小肽。 (三)抗体 (antibody, Ab) 1、抗体的概念: ? 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 – 抗体主要存在于血清内; – 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 – 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。 ? 单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 – 特异性强、抗体产量高。 ? 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 – 特异性低，会产生抗体的交叉反应。 – 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。 – 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。 3、抗体的制备——多克隆抗体的制备 ? 动物的选择 ? 佐剂(adjuvant) ? 免疫 ? 免疫剂量 ? 抗体效价的测定 ? 放血或定期抽血 (1) 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于: ? 所需抗血清的量 – 小鼠只能提供1.0,1.5ml的血液，而山羊能提供几升。 ? 能供免疫用的抗原量 – 小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。 ) (1) 动物的选择(续 ? 动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。 – 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。 – 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。 (2) 佐剂 (adjuvant) ? 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 ? 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为: – 弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant) – 弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant) 弗氏不完全佐剂 (Freund's incomplete adjuvant, FIA) ? 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。 ? 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。 弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA) ? 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2,20mg/ml)，即成为FCA。 ? 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。 – 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。 佐剂与抗原乳化的方法 ? 研磨法:适于制备大量的佐剂抗原 – 先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。 – 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 ? 缺点:研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。 佐剂与抗原乳化的方法(续) ? 注射器混合法 – 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 ? 优点:无菌操作，节省抗原或佐剂。 ? 缺点:不易乳化，时间长。 佐剂与抗原乳化的方法(续) ? 快速乳化法:利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 – 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。 10,15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3,4次即可完全乳化。– 每次乳化 管内残余量800r/min离心5,10min收集。 ? 优点:简单、快速、节省。 乳化剂的鉴定 ? 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，示乳化达到要求。 (3) 免疫方法——免疫途径 ? 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。 ? 一般采用多点注射方法 – 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。 – 皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。 (3) 免疫方法——免疫途径 (续) ? 几点说明: – 大动物一般不用腹腔注射 – 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 – 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10,100mg抗原即可获得较好的免疫效果。 – 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。 (3) 免疫方法——次数及间隔时间 ? 次数一般为2,3次(初次免疫和加强免疫) – 首次注射后，10,15天再加强注射; – 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。 ? 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长 – 豚鼠、大鼠为7,8天，兔子为10,15天，羊为14,28天; – 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。 举例1:家兔的免疫 ? 初次免疫 – 用50,200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射6,8点，每点0.1,0.2ml，也可肌肉内或皮内注射; ? 两周后，加强免疫 – 将50,200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射; ? 抗体效价的检测:加强免疫一周后，耳缘静脉采血 – 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。 举例2:微量抗原淋巴结内注射免疫家兔 ? 一般选择2.5,3.0kg的新西兰种公兔 – 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg); – 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化; – 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射 的抗原均为25,50mg; – 末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。 举例3:豚鼠和大鼠的免疫 ? 初次免疫 – 用10,100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射4,6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射; ? 加强免疫 – 每隔 7,8天，将10,50mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射; ? 抗体效价的检测 (4) 免疫剂量 ? 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制; ? 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。 (4) 免疫剂量 (续) ? 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量 只谈免疫效果，原则是少量多次，逐渐加大剂量。具体来说 :OVA以胶体Al(OH)3吸附，day 0, day7, ip.致敏/加强，10 ug/animal. day 14-day18以雾化OVA攻击。mouse, 5%OVA.如此，可有效建立哮喘模型