冰冻切片实验步骤

冰冻切片实验步骤 全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 03 -25C包埋(冰冻切片机内) 4 冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤: 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4?丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗,,, 冰冻切片不能用热修复啊～～～ 以下是我的步骤: 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4?丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3,过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10,正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37?孵育1~2小时或4?过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37?或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37?或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色(DAB)。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇 溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4?丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3,过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。 免疫组化染色步骤:(SP试剂盒为例) 1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4?丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3,过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 2 5~10,正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37?孵育1~2小时或4?过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37?孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37?或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37?孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37?或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色(DAB或AEC)。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 1. 冰冻切片4um左右，室温25?C复温30min，浸入4?C预冷的丙酮固定10min， 2. PBS(PH为7.2-7.4)在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min(第一次冲洗时间短些，约 1min后更换) 3. 用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份(需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿)30min。 4. PBS(PH为7.2-7.4，酸性)在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min(第一次冲洗时间短 些，约1min后更换)，甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周 围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致 边缘效应。 5. 5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内 玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。 6. 甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓 度不均。 7. 配置一抗工作液用5%BSA(抗体浓度为1:100)，悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不 要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否 则抗体可能附着不匀。 8. 放入湿盒内，置于4?C冰箱过夜(最长不可超过48h)，注意盖盖，放入后观察玻片是 否处于水平位(否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性)，孵育 期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。 9. 第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min， 10. 滴加1:100生物素标记的二抗(注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹 匀，掌上离心机离心)室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。 11. 滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液(SABC)室温1h， 后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。 12. DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显 微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最 好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间(一般显色时间2s-10min，显色时间过长 背景高，且可靠性低) 13. 终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察 是否有DAB颗粒附着。 14. 甩干水分，苏木素复染(如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直 接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化)，苏木素终止亦可用自来水冲 洗终止反应。 15. 水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明(75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2)个3min， 滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜 16. 封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。 观察照相。 针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。 自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过 1. 单涂胶:往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后 叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片， 0滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上60C烤干1h备用。 02. 双涂胶:往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶60C烤干,同样方法重 0复涂胶1次"60C烤干,备用。 我用过的尼氏染色的方法，效果不错。 1( 溶液配制: (1) 溶液A:焦油固紫0.2g, 纯水500ml (2) 溶液B:0.1M冰醋酸 冰醋酸3ml， 纯水500ml (3) 溶液C:0.1M无水醋酸钠 无水醋酸钠4.1g，纯水500ml (4) 溶液D:PH3.5~4.5醋酸缓冲液 B液94ml，C液6ml (5) 工作液:A液10ml，D液90ml 过滤后使用，避光保存 注:焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。 2( 具体步骤: ? 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤?开始;如果为冰冻切片，从步骤?开始。 ? 将凉干的切片放入纯水中3,5min。 ? 切片放入焦油固紫染色液中1,1.5h。 ? 切片放入纯水中洗去浮色。 ? 切片放入70,,80,,95,的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。 ? 切片放入特殊分色液中褪背底(1:1:1的无水乙醇，氯仿，乙醚)。 ? 切片放入100,乙醇，5min×3次;二甲苯5min×3次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。 3、结果 尼氏小体:深蓝紫色;核、核仁:浅紫色;背底:洁白无色。 我个人觉得特殊分色液挺重要的 Highman甲醇刚果红染色法(类淀粉染色) 1、试剂配制: 甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml 碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml 2、染色步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)甲醇刚果红染液染10,20分钟 (3)用碱性乙醇分化液分化数秒 (4)水洗 (5)苏木素复染2分钟 (6)水洗 (7)脱水,透明,封固 3、结果:淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用: 确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色， 冰冻切片脱脂问题: 0.5盐酸乙醇分化液 配置