烷烃单加氧酶基因的体外酶活测定

烷烃单加氧酶基因的体外酶活测定 (1)底物处理:取50 mmol/L Tris-HCl 100mL,加入1 mg表面活性剂PlysurfA-210G,混匀,再加入100 umol烷烃(十五烷或其它烷烃),ICKTC煮沸5niin后,立刻使用UP200sUltraschalIprozessor 在100%Amplitude 强度下,持续超声1min,使烷烃均匀分散,准确量取3mL烷烃混合物于的螺口旋盖管中,冷却至可以使用。 (2)酶活反应:加底物至终浓度为0.5 mM,辅酶(NADH或NADPH)终浓度为1mM,适量经纯化的蛋白,其余体积由50 mmol/L Tris-HCl补齐,一定温度下振荡反应一定时间。反应结束后,加入等体积氯仿萃取后,直接使用ShimadzuUV-250 UV分光光度计在0D340条件下测定NADH残留量。或者加入三十二烷为内参,再加入等体积的正己烷萃取后,无水Na2S04脱水,使用Agilent 6820气相色谱仪测定残留的烷烃量,色谱柱为SPBTM-5 capillary column (30mx0.53mm i.d.,1.5um thickness) (Supelco),色谱程序如下: 进样口: 280 摄氏度 柱温:150°C,5min ,15度/min 程序升温280°C, 30min 器(FID)温度: 350。C; 载气(N2) : 35mL/min; 空气: 400mL/min ; 氢气(H2) ; 30mL/min; 尾吹(N2) : 20mL/min。 一个酶活单位定义为每分钟内氧化1.0 umol底物(NADH)所需的酶蛋白量(mg)。 (3)底物范围:选用不同底物,包括正戊烷,正己烷,正辛烷,正癸烷,十二烷,十五烷,十六烷,十七烷,十八烷,二十四烷,二十八烷,硝甲烷,甲磺酸,苯,苯甲酸钠,甲苯,邻苯二酷,联苯,十四烷醇,十六烷醇,十八烷醇,进行相应反应,测定酶活。 (4)最适反应时间测定:反应不同时间长度的条件下,测定NADH残余量,确定反应进程及最适反应时间。 (5)酶浓度对反应的影响:在不同酶量的条件下,进行反应,测定反应速率。 (6)最适温度:分别在0°C,4°C,15°C, 25°C, 30°C,35°C, 40°C, 50°C, 60°C条件下进行反应,测定酶活性差异。 (7)最适pH 值:分别在pH 为5.0,5.6,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0, 8.6, 9.0, 9.4,9.8,10.0条件下进行反应,测定酶活性差异。所用buffer为:KH2PO4-K2HPO4(pH5~8)、Tris-HCl (pH 7.5-8.6)和Glycine-NaOH (pH 8.6-10)。 (8)金属离子和螯合剂的影响:分别在反应体系中加入金属离子Na+,K+,A13+,Ca2+,Co2+,Pb2+,Fe2+,Cu2+, Mg2+,Ni+,Zn2+至1 mM,或加入EDTA 至2mM,然后进行相应的反应,测定酶活。 (9K m的测定:选取最适反应条件,分别选择不同浓度的十五烷和NADH进行反应,使用双倒数法计算酶的K m值。 (10)单加氧酶两个亚基之间的体外相互作用:在同一反应体系中,加入纯化后的两个亚基的蛋白,测定酶活,与加入单一纯化后蛋白的酶活相比较。或使用凝血酶(Thrombin)于4°C反应30min,切去小亚基上的6xHis标签(反应体系为:小亚基蛋白0.2 mg/mL; Thrombin 2mg/L; NaCl 150mM; CaCl2 2.5mM)。然后加入终浓度为1 mM的PMSF (蛋白酶抑制剂)终止反应。取反应后的小亚基与等量的大亚基共同加入预处理过的Chelating Sepharose,4°C水平振荡1 h。负对照为单独的反应后的小亚基。最后12% SDS-PAGE检测结果.